SIRT1介導間歇性禁食改善高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪組織線粒體功能和炎癥狀態

鄧小杰?王甜?徐芬?梁華

【摘要】目的 探討間歇性禁食對高脂飲食誘導的肥胖小鼠白色脂肪組織線粒體功能和炎癥狀態的影響以及沉默信息調節因子2相關酶1（SIRT1）在其中的作用。方法 將5～6周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為普通自由飲食組（CD組）、高脂自由飲食組（HFD組）和高脂間歇性禁食組（HFD-IF組，隔日禁食24 h），每組各5只，喂養12周。用HE染色觀察各組小鼠白色脂肪組織情況，并檢測白色脂肪SIRT1、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）、叉頭轉錄因子1（FOXO1）、線粒體功能和炎癥相關基因的表達情況。在小鼠尾靜脈注射腺相關病毒（AAV）-shSirt1敲減SIRT1表達，分別給予小鼠高脂自由飲食和高脂間歇性禁食，檢測上述指標。結果 HE染色結果顯示HFD-IF組脂肪細胞體積減小。蛋白免疫印跡結果顯示高脂自由飲食時脂肪組織SIRT1、p-AMPK、 FOXO1蛋白表達均下調，間歇性禁食后均上調（P均< 0.05）。定量PCR結果顯示HFD組線粒體功能基因Tfam、Nrf1、Pgc-1a表達下調（P均< 0.001），炎癥基因TNF-α、單核細胞趨化蛋白1、生長因子樣模體黏液樣激素樣受體表達均上調（P均< 0.01），間歇性禁食后線粒體功能相關基因均上調（P均< 0.05），炎癥相關基因均下調（P均< 0.05）。敲減SIRT1后，HFD-IF組的上述指標上調或下降的趨勢均有所減弱甚至消失（P均< 0.05）。結論 SIRT1通過改善小鼠內臟白色脂肪組織線粒體功能和炎癥狀態從而介導間歇性禁食改善高脂喂養誘導的肥胖。

【關鍵詞】間歇性禁食； 沉默信息調節因子2相關酶1；高脂飲食；白色脂肪

SIRT1-mediated intermittent fasting improves adipose tissue mitochondrial function and inflammation in high-fat diet-induced obese mice Deng Xiaojie△， Wang Tian， Xu Fen， Liang Hua.△Department of Endocrinology and Metabolism， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China

Corresponding author， Liang Hua， E-mail： lianghua@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】Objective To investigate the role of SIRT1 in the effect of intermittent fasting on mitochondrial function and inflammation in white adipose tissue（WAT） of obese mice induced by high-fat diet. Methods Male C57BL/6 mice aged 5-6 weeks were randomly divided into the control diet （CD） group （n = 5）， high‐fat diet （HFD） group （n = 5） and high-fat diet intermittent fasting （HFD-IF， alternate-day fasting 24 h） group （n = 5） and fed for 12 weeks. The pathological changes of WAT were observed by HE staining. The expression levels of SIRT1， p-AMPK， FOXO1 and mitochondrial function， inflammation-related genes in WAT of each group were detected. AAV-shSirt1 virus was delivered by tail-vein injection into mice to knockdown SIRT1. HFD and HFD-IF were given. The parameters above were determined. Results HE staining indicated that the adipose cell volume was decreased in the HFD-IF group. Western blot showed that the expression levels of SIRT1， p-AMPK and FOXO1 in adipose tissues were significantly down-regulated in the HFD mice （all P < 0.05）， which were significantly up-regulated after intermittent fasting （all P < 0.05）.? qPCR revealed that the expression levels of mitochondrial functional genes， including Tfam， Nrf1 and Pgc-1a were dramatically down-regulated in the HFD group （all P < 0.001）， whereas those of inflammatory markers， such as TNF-α，MCP-1 and F4/80， was significantly up-regulated （all P < 0.01）. After intermittent fasting， the expression levels of genes related to mitochondrial function were up-regulated （all P < 0.05）， whereas those of inflammatory markers were down-regulated （all P < 0.05）. After knockdown of SIRT1， the trend of up-regulating or down-regulating the expression levels of these parameters was weakened or even absent in the HFD-IF group （all P < 0.05）. Conclusion SIRT1 mediates intermittent fasting in improving high-fat diet-induced obesity via ameliorating adipose tissue mitochondrial function and inflammation.

【Key words】 Intermittent fasting； SIRT1； High-fat diet； White adipose tissue

肥胖是全球重大的公共健康問題［1］。肥胖改變全身代謝并導致胰島素抵抗，其機制涉及脂肪組織的線粒體功能損傷和炎癥［2］。間歇性禁食（IF）是指在特定時間段內限定熱量攝入的一種飲食管理手段［3］。研究表明，IF可以作為一種有效的行為干預方式來減少包括肥胖在內的代謝性疾病的負擔及延長壽命，但具體機制尚未完全明確［4］。沉默信息調節因子2相關酶1（SIRT1）是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的去乙酰化酶，表達受能量狀態調節，NAD+高表達可改善高脂飲食誘導的肥胖和胰島素抵抗形成，并改善脂肪組織和肝臟的線粒體功能，減輕氧化應激和炎癥程度［5-10］。因此推測，SIRT1在IF改善肥胖中可能發揮重要作用。本研究通過構建隔日禁食的間歇性高脂飲食小鼠模型、利用尾靜脈注射腺相關病毒（AAV）敲減SIRT1等手段，探討IF對高脂誘導的肥胖小鼠脂肪組織線粒體功能、炎癥通路的影響以及SIRT1在其中的介導作用，為揭示SIRT1在IF調控機體代謝平衡中的作用提供理論基礎。

材料與方法

一、動物模型的建立及IF方案

5～6周齡雄性C57/BL6小鼠35只，體重18～22 g，購至江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。動物飼養于中山大學SPF級環境中，控制溫度、濕度，進行12 h光-暗循環。小鼠經過1周適應性喂養后，將15只小鼠根據空腹血糖和體重隨機分為普通自由飲食組（CD組，n = 5）、高脂自由飲食組（HFD組，n = 5）和高脂IF組（HFD-IF組，n = 5），HFD-IF組采取隔日禁食24 h、自由飲水，喂養12周。第2批小鼠適應性喂養1周后，將16只小鼠隨機分為HFD組和HFD-IF組，干預4周后，通過尾靜脈分別注射腺相關敲減SIRT1病毒和腺相關對照病毒，分別設為高脂自由飲食對照組（shCtrl-HFD組，n = 4）、高脂自由飲食敲減組（shSirt1-HFD組，n = 4）、高脂IF對照組（shCtrl-HFD-IF組，n = 4）、高脂IF敲減組（shSirt1-HFD-IF組，n = 4），繼續喂養8周。所有小鼠實驗結束后，用異氟烷麻醉后摘除眼球取血，采用頸椎脫臼法將其處死，留取小鼠附睪旁脂肪組織，切取部分組織置于4%多聚甲醛固定，將其余組織儲存于-80℃冰箱。本實驗通過中山大學實驗動物倫理委員會審批（批件號：SYSU-IACUC-2021-000374）。

二、實驗試劑和材料

1.主要試劑

高脂飼料（貨號D12492）購自Research Diets公司（美國）；AAV-shRNA-Sirt1和AAV-shRNA-Control購自廣州東澤生物科技有限公司（中國），SIRT1干擾序列5′-TCGAACAATTCTTAAAGAT-3′，RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和BCA試劑盒購自Thermo Fisher公司（美國）；磷酸酶抑制劑（貨號CW2383S）購自康為世紀（中國）；TRIzol試劑（貨號T9424）購自Sigma-Aldrich公司（美國）；Prime ScriptTMRT Master Mix逆轉錄試劑盒（貨號RR036A）購自TaKaRa公司（日本）；LightCycler 480 SYBR Green I Master購自Roche公司（美國）；SIRT1、腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）、p-AMPK、叉頭轉錄因子O1（FOXO1）、β-actin抗體均購自Cell Signaling Technology公司（美國）；IRDye 800CW二抗（貨號926-32211）購自LI-COR公司（美國）；甘油三酯（貨號A110-1-1）、總膽固醇試劑盒（貨號A111-1-1）購自南京建成生物工程研究所（中國江蘇）。

2. 主要儀器

熒光倒置顯微鏡及體視顯微鏡（Leica）；Nanadrop2000分光光度計（Thermo）；實時熒光定量PCR儀（Roche LightCycler 480）；全自動酶標儀（Thermo）；雙色紅外成像系統Odyssey（LI-COR）。

三、方 法

1. HE染色

將小鼠脂肪組織固定，經過浸蠟、包埋、切片后，按照步驟進行二甲苯脫蠟，蘇木素和0.5%伊紅分別染色、脫水和封片，顯微鏡下觀察并拍照。采用Image J軟件統計脂滴大小。

2.組織蛋白提取和蛋白免疫印跡

取小鼠脂肪組織100 mg～200 μL預冷RIPA裂解液中，勻漿后采用14 000轉/分于4℃離心

20 min，吸取中間清液層得到蛋白原液。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度配平后，取30 μg總蛋白進行凝膠電泳，將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入相應的Ⅰ抗稀釋液（1∶1 000）于4℃過夜孵育。孵育結束后用TBST洗膜3次，加入Ⅱ抗稀釋液（1∶10 000）室溫避光孵育1 h后，再次洗膜，使用Odyssey紅外熒光成像系統掃描，并用Image J軟件測量蛋白條帶灰度值進行定量。

3. 組織RNA提取和RT-qPCR檢測

使用TRIzol試劑提取小鼠脂肪組織總RNA，用分光光度計測定總RNA濃度和純度，用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。使用試劑盒并采用PCR檢測儀進行PCR擴增。反應體系的配制及反應程序均按照試劑盒說明書。內參照為β-actin，結果使用2-??Ct方法分析計算目的基因的相對表達量。

4.血清檢測

小鼠血清中甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）水平的測定按照相應試劑盒進行測定。

四、統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0進行統計分析和圖表繪制分析。數據采用? 表示。數據符合正態分布，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、IF能減小高脂飲食喂養小鼠脂肪細胞體積并降低血脂水平

小鼠脂肪組織HE染色和稱重結果顯示，與CD組相比，HFD組小鼠脂肪細胞體積增大且質量更重（F = 30.732，P < 0.001；F = 63.267，P < 0.001），而HFD-IF組小鼠脂肪細胞體積較HFD組減小且質量減輕（F = 30.732，P < 0.001；F =

63.267，P < 0.001），脂質含量明顯降低，見圖1。HFD組小鼠血清中TG、TC水平高于CD組［TG HFD vs. CD：（148.66±11.44）mg/dL vs.

（79.33±5.43） mg/dL，F = 22.913， P < 0.001；TC HFD vs. CD：（160.40±7.62） mg/dL vs. （100.12±2.05） mg/dL，F = 38.717， P < 0.001］，而HFD-IF組較HFD組小鼠水平下降［TG HFD-IF vs. HFD：（80.96±6.69）mg/dL vs. （148.66±11.44）

mg/dL，P < 0.001；TC HFD-IF vs. HFD：（116.23±3.63）mg/dL vs. （160.40±7.62）mg/dL，P < 0.001］。

二、IF上調高脂飲食小鼠白色脂肪組織中SIRT1及激活AMPK、FOXO1通路

蛋白免疫印跡結果顯示，HFD組小鼠中SIRT1、p-AMPK、FOXO1表達均較CD組降低

（F = 35.641，P < 0.001；F = 7.503，P = 0.037；F =

9.935，P = 0.012），而IF使SIRT1、p-AMPK、FOXO1水平升高（F = 35.641，P = 0.043；F = 7.503，P = 0.034；F = 9.935、P = 0.044）。見圖2。

三、IF增加高脂飲食小鼠白色脂肪組織線粒體生物合成并減輕炎癥程度

與CD組相比，HFD組小鼠脂肪組織中線粒體生物合成相關基因Pgc-1a、Tfam和Nrf1的mRNA相對表達量均降低（F = 23.561，P < 0.001；F = 15.872，P < 0.001；F = 24.456，P < 0.001），而炎癥相關基因TNF-α、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）和生長因子樣模體黏液樣激素樣受體（F4/80）的mRNA表達水平均升高（F = 16.742，P = 0.006；

F = 17.743，P = 0.003；F = 8.492，P = 0.007）；與HFD組相比，HFD-IF組小鼠線粒體生物合成相關基因表達水平上升（Pgc-1a、Tfam和Nrf1分別為P = 0.003、P = 0.022、P = 0.021），炎癥相關基因表達下降（TNF-α、MCP-1和F4/80分別為P < 0.001、P < 0.001、P = 0.043）。

四、敲減SIRT1削弱IF減小高脂飲食喂養小鼠脂肪細胞體積和降低血脂的作用

通過尾靜脈注射AAV-shSirt1敲減SIRT1表達后，shSirt1-HFD組與shCtrl-HFD組脂肪細胞體積大小比較差異無統計學意義（P > 0.05），而shSirt1-HFD-IF組與對照組相比，脂肪質量無明顯變化但細胞體積減小的程度有所下降（體積F = 17.993，P = 0.047；質量F = 46.439，P =

0.881），見圖3A～B。敲減SIRT1后，IF降低HFD誘導的高血脂作用被減弱（IF后TG shCtrl vs. shSirt1：（82.30±2.12） mg/dL vs. （124.74±2.94）? mg/dL，F = 97.605， P < 0.001；TC shCtrl vs. shSirt1：（105.56±2.95） mg/dL vs. （144.83±5.10） mg/dL，F = 28.871， P = 0.002）。以上結果提示敲減SIRT1后，IF改善高脂飲食誘導的脂肪細胞體積增大和降低血脂的作用有所削弱。

五、敲減SIRT1減低間歇性禁食激活白色脂肪組織AMPK及FOXO1的作用

蛋白免疫印跡結果顯示，敲減SIRT1后，SIRT1的蛋白水平均降低（F = 9.653，P = 0.038；F = 11.307，P = 0.027），見圖4A。與之前的實驗結果相同，shCtrl-HFD-IF組 FOXO1、p-AMPK的蛋白水平較shCtrl-HFD組增加（F = 7.468，P = 0.028；F = 15.313，P = 0.003），敲減SIRT1后shSirt1-HFD-IF組與shCtrl-HFD-IF組相比，可以看到IF上調的FOXO1、p-AMPK表達的作用減弱（FOXO1 P = 0.026、p-AMPK P = 0.012），見圖4B。

六、敲減SIRT1消除IF增加高脂飲食小鼠白色脂肪組織線粒體合成和炎癥的作用

RT-qPCR結果顯示，shCtrl-HFD-IF組與shCtrl-HFD組相比，線粒體功能相關基因如Tfam、Nrf1和Pgc-1a的mRNA表達均增加（F = 19.495，P < 0.001；F = 16.386，P = 0.008；F = 12.254，P =

0.002），炎癥相關基因MCP-1、F4/80和TNF-α的mRNA水平下調（F = 9.857，P = 0.014；F = 5.039，P = 0.050；F = 10.264，P = 0.047）。而敲減SIRT1后，與shCtrl-HFD-IF組相比，shCtrl-HFD-IF組IF的這種改善作用基本消失（Tfam P = 0.008、Nrf1 P < 0.001、Pgc-1a P = 0.018；MCP-1 P = 0.002、F4/80 P = 0.524、TNF-α P = 0.030）。見圖5。

討論

脂肪組織是具有能量儲存和分泌功能的器官，在肥胖的發生、發展中起重要作用。脂肪組織線粒體功能與炎癥和許多跟肥胖相關的疾病發生有關，如脂肪肝、脂代謝紊亂、胰島素抵抗和糖尿病等［11-12］。IF作為一種越來越受到關注的飲食方式，已成為肥胖與代謝性疾病發病機制及干預措施研究的重要模型。既往研究顯示IF具有改善葡萄糖耐量、脂代謝紊亂、脂肪組織炎癥和延長壽命的作用，但具體機制尚不明確［13-14］。本研究顯示SIRT1在IF改善HFD誘導的脂肪組織線粒體功能和炎癥狀態中發揮重要作用，可能通過激活AMPK和FOXO1通路增加線粒體生物合成發揮抗炎作用。

本課題組的前期研究證實SIRT1作為受能量代謝調控的去乙酰化蛋白，在高脂條件下其在肝臟中的表達降低，禁食時表達上調［15-16］。在本研究中，白色脂肪組織中SIRT1的蛋白表達結果與既往研究結果相似，相關研究證實，SIRT1可通過調控脂肪組織和肝臟的Pgc-1a促進線粒體生物合成，并能控制促炎基因轉錄從而調節脂肪組織炎癥程度［9， 17-18］。本研究顯示高脂誘導小鼠白色脂肪組織Pgc-1a、Tfam和Nrf1的表達降低，MCP-1、F4/80以及TNF-α的表達增加，提示存在線粒體功能障礙和脂肪炎癥，IF能改善上述基因的表達；然而尾靜脈注射AAV-shSirt1敲低小鼠SIRT1表達后，IF對上述線粒體功能及炎癥相關基因的作用被顯著減弱，提示SIRT1可能通過改善線粒體功能障礙、減輕機體組織炎癥程度而緩解機體代謝性疾病。

AMPK是機體的能量感受器，具有特異性調控線粒體生物過程的作用［19］。SIRT1是激活AMPK改善線粒體功能所必需的［8］。此外，SIRT1還通過上調FOXO1發揮抗自噬、抗氧化應激和抗炎等作用［10-20］。本研究顯示，IF能上調HFD小鼠脂肪組織p-AMPK和FOXO1蛋白水平，但敲低SIRT1的表達后，IF上調p-AMPK、FOXO1表達的作用減弱，提示SIRT1通過激活AMPK和FOXO1參與IF改善肥胖脂肪組織線粒體功能和炎癥的機制。

綜上所述，IF可能通過調控脂肪組織線粒體功能和炎癥狀態從而改善肥胖，而SIRT1在其中起重要作用。本研究僅探討了IF對白色脂肪組織的作用，需進一步檢測其在組織代謝中的作用并通過體外實驗更深入探討SIRT1在其中的作用。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2022-11-01）

（本文編輯：洪悅民）