基于羅丹明B的熒光探針“關-開”法測定硫普羅寧的含量

孫雙姣　何芳　鄧子璇

摘 要：目的 建立一種基于碘-羅丹明B（rhodamine B，RhB）體系的“關-開”熒光探針的新方法測定藥物中硫普羅寧（tiopronin，TPN）含量。方法 RhB水溶液具有熒光性質，以365 nm為激發波長時，RhB在582 nm處有最大熒光強度。加入碘后，熒光強度減弱甚至消失，發生熒光猝滅。TPN含有巰基官能團而具有較強的還原性，能將I3還原為I-，I-不與RhB作用，將TPN加入到上述體系中，體系的熒光信號得以恢復。根據熒光強度的增強值（△F365/582）與TPN的濃度呈現較好的線性關系實現對TPN濃度的測定。結果 TPN濃度在1.00-20.00 μmol/L范圍內與熒光強度（△F365/582）有較好的線性關系，回歸方程為△F365/582=84.783+9.6962C（r=0.999 3），檢出限為0.33 μmol/L。結論 該法測定藥品中TPN含量，操作簡便可行。

關鍵詞：羅丹明B；碘；硫普羅寧；熒光法；含量測定

中圖分類號：O657.3

文獻標志碼：A

Determination of tiopronin content based on“off-on”rhodamine Bas fluorescent probe

SUN Shuangjiao HE Fang DENG Zixuan

（1. School of Pharmacy， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China；

2. Hunan Engineering Research Center of Development and Utilization of Traditional Chinese Medicine in Southwest Hunan， Shaoyang 422000， China）

Abstract： Objective To establish a new fluorescence spectroscopic method for the determination of tiopronin （TPN） in medicine by the fluorescence switch based on iodine-rhodamine B. Method Rhodamine B aqueous solution exhibits fluorescence properties. When 365 nm used is the excitation wavelength， Rhodamine B has the maximum fluorescence intensity at 582 nm. After adding iodine to the solution of rhodamine B， the fluorescence intensity weaken or even disappears and undergoes fluorescence quenching. TPN containsed a sulfhydryl functional group and has strong reducibility， which can reduce I-3 to I-. Because I- does not interact with rhodamine B， the fluorescence signal of the system is reproduced when adding TPN to the above system. According to the good linear relationship between the enhanced value of fluorescence intensity （△F365/582） and the concentration of TPN， the inverse fluorescence determination of the concentration of TPN was achieved.? Results When the concentration of TPN was 1.00～20.00 μmol/L， it had a good linear relationship with the fluorescence intensity （△F365/582）. The regression equation was △F365/582=84.783+9.696 2 C（r=0.999 3） with a detection limit of 0.33 μmol/L.? Conclusion The method is simple and feasible to determine the content of TPN in drugs.

Key words： rhodamine B; iodine; tiopronin; fluorescence method; content determination

硫普羅寧（tiopronin，TPN）又稱作為凱西萊，分子結構如圖1所示，在側鏈中含有巰基（-SH），該巰基具有活性可以保護肝臟，在體內具有多種藥理效應，在臨床上主要用于治療有機磷中毒[1]、藥物性肝損傷[2]、早期肝硬化、慢性肝炎[3]、脂肪肝[4]等各種疾病。

已報道的測定TPN的儀器分析方法主要有RP-HPLC[5]、超高效液相色譜-串聯質譜法[6]、柱前衍生-高效液相色譜熒光法[7]、LC-ESI-MS-MS[8]、褪色光度法[9]、UV-Vis[10]、 HPLC[11]、浮選法[12]、金納米熒光法[13]等，但這些方法有的檢測靈敏度較低，分離效果較差，有的儀器設備較為復雜或昂貴，分析的成本較高，有的需要具備特殊的檢測器，在實際操作過程中存在一定的限制。

羅丹明B（rhodamine B，RhB）屬于三苯甲烷類染料，具有熒光特性，常作為分析試劑用于熒光分析。現有文獻報道的氧化性物質的測定分析中已有使用過RhB熒光猝滅法，如測定I-[14]、鐵（Ⅲ）[15]、亞氯酸根[16]等，對于分析還原性藥物的研究鮮見報道。本研究發現，在弱酸反應環境下，I-3-RhB締合物使得體系熒光消失，在實驗體系中加入TPN，TPN分子中的官能團巰基將I-3還原成I-，溶液熒光再現，熒光強度的增加值與TPN的濃度存在較好的線性關系，本研究據此建立了RhB熒光“關-開”法測定TPN含量的光譜分析新方法，該法用于腸溶片中TPN含量的分析，具有試劑易得，選擇性較好，簡化便捷，分析成本較低、靈敏度較高的特點。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

FA2004電子分析天平（購自上海舜宇恒平科學儀器有限公司）、F97pro熒光分光光度計（購自上海棱光技術有限公司）。

RhB（天津市科密歐化學試劑有限公司）、TPN標準品（美侖生物科技有限公司）、TPN腸溶片（上海凱寶新誼（新鄉）藥業有限公司；江蘇亞邦愛普森藥業有限公司；遠大醫藥（中國）有限公司）、0.20 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液（廣檢（廣州）檢測科技有限公司）、碘單質（天津市永大化學試劑有限公司）、碘化鉀（國藥集團）。所有試劑均為分析純。所用的化學品均未經進一步純化。實驗用水均為去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣液的制備

TPN標準品貯備液：分析天平準確稱取0.163 3 g標準品，將其加水溶解后定容至10.00 mL，制成0.10 mol/L TPN標準品貯備液，實驗時溶液稀釋1 000倍。RhB貯備液[17]：分析天平稱量RhB 0.119 8 g，加水溶解后定容至250.00 mL，配制濃度為1.00 mmol/L的RhB貯備液。碘標準溶液[18]：分析天平準確稱量碘單質12.650 0 g（分析純）置1.0 L容量瓶中，然后加入1.00 mol/L的氫氧化鈉150.00 mL，隨后震蕩半分鐘，密封靜置至碘完全溶解，溶液無色說明反應完全，加碘化鉀固體36.000 0 g，1.00 mol/L HCl 150.00 mL，蒸餾水定容至1.0 L，制成濃度為0.05 mol/L碘標準溶液。隨后將溶液轉移至棕色細口瓶內，靜置36 h待用，使用時稀釋50倍。

1.2.2 測定方法

取HAc-NaAc緩沖溶液1.00 mL，TPN標準溶液適量于10.00 mL容量瓶中，然后加碘液0.40 mL，反應6 min后再依次加入RhB 1.00 mL，加蒸餾水定容，搖勻靜置9 min。當以365 nm作為激發波長時，體系的熒光強度最強[17]。本研究的激發波長選擇365 nm。于熒光分光光度計500～700 nm范圍掃描體系的熒光強度，得到體系的熒光光譜，測定不同TPN濃度在582 nm處的熒光強度F365/582，并記錄實驗數據。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜與波長的選擇

圖2為激發波長365 nm 時反應體系的熒光光譜圖，其中，曲線a為RhB的熒光發光曲線，結果表明RhB有較強的熒光強度，且熒光發射峰位于582 nm處；曲線b為碘液加入后的發光曲線，與曲線a相比，曲線b的熒光強度發生了猝滅，這說明碘和RhB之間發生了締合，生成了I-3-RhB締合物而導致羅丹明的熒光強度明顯減弱；曲線c至曲線f為加入不同濃度TPN后碘液與RhB體系的熒光發射曲線，由圖2可知，隨著TPN的加入，體系的熒光再一次增強，且TPN加入的量越大，熒光增強幅度越大，這是因為TPN含有巰基官能團而具有較強的還原性，能將I3還原為I-，I-不與RhB作用，體系的熒光信號得以恢復。

2.2 條件的優化

2.2.1 酸度與緩沖溶液用量的選擇

取0.10 mmol/L TPN標準液1.00 mL，通過加入不同體積的0.20 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉溶液，調節其pH，探究不同酸度對體系的影響[14]。結果表明，當pH不斷增強時，熒光強度增加，這是由于RhB分子結構中的羧基隨著OH-濃度不斷增加而導致電離程度不斷增大，吸電子能力減弱，從而熒光強度增大[19]；當pH在4.0至8.0時處于一個比較穩定的狀態；pH開始大于9.0時，碘開始發生歧化[20]，F365/582二次增大，說明pH在4.0～8.0時比較適合羅丹明和碘的締合，也有利于TPN的氧化。因此本試驗選擇的反應介質為pH為4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液。

考察緩沖溶液用量對體系熒光強度的影響。結果如圖3所示，隨著體積的增大，體系的熒光強度先增后降，當緩沖溶液用量為1.00 mL時體系的熒光強度最大，故實驗選擇1.00 mL為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的用量。

2.2.2 RhB最佳濃度的選擇

RhB的熒光強度與自身濃度有著非常密切的關系。在10.00 mL容量瓶中加入HAc-NaAc緩沖液（pH=4.6）1.00 mL，RhB 0～1.80 mL，加水定容測定其熒光強度。實驗結果如圖4所示，RhB水溶液的體積在0～1.00 mL范圍內時，其熒光強度與體積存在線性關系，當RhB濃度大于0.10 mmol/L，即RhB體積大于1.00 mL，熒光強度趨于穩定，可知RhB的水溶液超過一定濃度則會形成二聚體甚至多聚體，自熄滅增強，線性關系會消失[19]。為了實驗的線性范圍足夠大且具有較低的檢測限，實驗確定RhB的濃度為0.10 mmol/L，即加入1.00 mL的RhB溶液。

2.2.3 碘液最佳濃度的選擇

考察I-3-RhB體系在不含有TPN的情況下，改變碘液用量的情況下對RhB的熒光猝滅的影響。在10.00 mL容量瓶內分別加入HAc-NaAc 1.00 mL，不同體積的碘液0～2.00 mL，RhB溶液1.00 mL，定容至10.00 mL，測定其熒光強度。圖5分析結果表明，當加入的碘液在0～0.40 mL時猝滅的線性度較好，當濃度大于0.50 mL時體系的熒光強度開始呈現較為平緩的趨勢，當加至1.20 mL時體系熒光強度不再發生明顯變化。為了實驗具有良好的線性，故碘液用量為0.40 mL，此時體系內碘液的濃度為0.04 mmol/L。

2.2.4 最佳反應溫度與時間的選擇

取0.10 mmol/L TPN標準溶液1.00 mL、其他條件不變。通過考察在20～50 ℃的溫度下體系的熒光強度，可知體系的熒光強度在反應溫度為20～35 ℃為最大且變化較小。因此，選擇室溫25 ℃為TPN氧化以及RhB熒光猝滅反應的最佳溫度。

探究TPN與碘的氧化以及碘與RhB締合2個反應時間對熒光強度的影響。實驗結果見圖6，曲線a為HAc-NaAc 1.00 mL，0.10 mmol/L TPN標準溶液1.00 mL，碘液0.40 mL，分別反應2～10 min（間隔為2 min一組）后加入1.00 mLRhB溶液于10.00 mL容量瓶定容，靜置10 min后。在不同氧化時間點分別測定的體系熒光強度；曲線b為取HAc-NaAc1.00 mL，0.10 mmol/L TPN標準溶液1.00 mL，碘液0.40 mL，反應8 min后加入1.00 mLRhB溶液定容至10.00 mL，分別搖勻靜置2～10 min（間隔為2 min一組）后測定不同靜置時間下體系的熒光強度。結果表明，TPN與I-3反應較快，加入瞬間黃色有變化，6 min時反應完全，熒光強度達到最大；RhB與碘締合在8 min時反應完全，10 min時熒光強度基本保持不變，因此，RhB加入后的靜置時間為9 min。

2.2.5 試劑加入最佳順序的選擇

取1.00 mL 0.10 mmol/L的TPN標準溶液，重點考察了“氧化后締合”以及“締合后氧化”兩種順序對熒光強度（F365/582）的影響。結果表明順序為：TPN+碘液+RhB，即先氧化后締合時體系熒光強度最為穩定，并且此時體系的熒光強度最高。所以實驗選擇TPN+I-3+RhB的加入順序為最佳。

2.2.6 共存物質的影響

針對藥物中常見的賦形劑和添加劑，實驗考察了葡萄糖、淀粉、硬脂酸鎂、糊精、蔗糖、乳糖、甘油以及Ca2+、Fe3+、Mg2+、Al3+等陽離子在優化條件下對測定的干擾。干擾實驗表明，當相對誤差小于或等于±5%時，150倍的淀粉、葡萄糖、糊精、硬脂酸鎂、蔗糖、乳糖以及100倍的金屬離子Mg2+、Al3+、Ca2+對測定結果均無干擾，TPN和I-皆可被Fe3+氧化，Fe3+存在一定的干擾。由于藥品中附加成分和輔料很少加Fe3+，因此，不在此討論其干擾情況。

2.3 標準曲線的繪制

分別取一系列濃度的TPN標準溶液于10.00 mL容量瓶中按照前面的實驗方法測其熒光強度。實驗表明，TPN濃度在1.00～20.00 μmol/L時與熒光強度有較好線性，線性方程為△F365/582=84.783+9.696 2C（μmol/L），相關系數為0.999 3，通過10次空白溶液的測定，用3σ/k求得檢測限DL為0.33 μmol/L。

2.4 樣品分析

分別取來自3個不同廠家的TPN腸溶片10片于分析天平中準確稱重，除去包衣后在研缽中粉碎混勻，精密稱取一定量的TPN粉末，大約相當于TPN 0.33 mg。加水溶解，于100.00 mL容量瓶中定容，經濾紙過濾，取濾液10.00 mL定容至100.00 mL，作為待測液使用。按照2.2的實驗方法取待測液1.00 mL進行含量的測定，并進行標準品加入回收實驗，所得回收率結果見表1。

3 結論

本實驗基于RhB的熒光“關-開”建立了測定TPN含量的熒光光譜分析新方法，TPN在1.00-20.00 μmol/L濃度范圍內的TPN與熒光強度有較好的線性，線性回歸方程為△F365/582=84.783+9.696 2C（μmol/L），相關系數r=0.999 3，DL為0.33 μmol/L。利用該方法測定TPN腸溶片中TPN的含量，操作簡便可行。

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