基于羅丹明B的熒光探針“關(guān)-開”法測(cè)定硫普羅寧的含量

孫雙姣　何芳　鄧子璇

摘 要：目的 建立一種基于碘-羅丹明B（rhodamine B，RhB）體系的“關(guān)-開”熒光探針的新方法測(cè)定藥物中硫普羅寧（tiopronin，TPN）含量。方法 RhB水溶液具有熒光性質(zhì)，以365 nm為激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)，RhB在582 nm處有最大熒光強(qiáng)度。加入碘后，熒光強(qiáng)度減弱甚至消失，發(fā)生熒光猝滅。TPN含有巰基官能團(tuán)而具有較強(qiáng)的還原性，能將I3還原為I-，I-不與RhB作用，將TPN加入到上述體系中，體系的熒光信號(hào)得以恢復(fù)。根據(jù)熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)值（△F365/582）與TPN的濃度呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系實(shí)現(xiàn)對(duì)TPN濃度的測(cè)定。結(jié)果 TPN濃度在1.00-20.00 μmol/L范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度（△F365/582）有較好的線性關(guān)系，回歸方程為△F365/582=84.783+9.6962C（r=0.999 3），檢出限為0.33 μmol/L。結(jié)論 該法測(cè)定藥品中TPN含量，操作簡(jiǎn)便可行。

關(guān)鍵詞：羅丹明B；碘；硫普羅寧；熒光法；含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：O657.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Determination of tiopronin content based on“off-on”rhodamine Bas fluorescent probe

SUN Shuangjiao HE Fang DENG Zixuan

（1. School of Pharmacy， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China；

2. Hunan Engineering Research Center of Development and Utilization of Traditional Chinese Medicine in Southwest Hunan， Shaoyang 422000， China）

Abstract： Objective To establish a new fluorescence spectroscopic method for the determination of tiopronin （TPN） in medicine by the fluorescence switch based on iodine-rhodamine B. Method Rhodamine B aqueous solution exhibits fluorescence properties. When 365 nm used is the excitation wavelength， Rhodamine B has the maximum fluorescence intensity at 582 nm. After adding iodine to the solution of rhodamine B， the fluorescence intensity weaken or even disappears and undergoes fluorescence quenching. TPN containsed a sulfhydryl functional group and has strong reducibility， which can reduce I-3 to I-. Because I- does not interact with rhodamine B， the fluorescence signal of the system is reproduced when adding TPN to the above system. According to the good linear relationship between the enhanced value of fluorescence intensity （△F365/582） and the concentration of TPN， the inverse fluorescence determination of the concentration of TPN was achieved.? Results When the concentration of TPN was 1.00～20.00 μmol/L， it had a good linear relationship with the fluorescence intensity （△F365/582）. The regression equation was △F365/582=84.783+9.696 2 C（r=0.999 3） with a detection limit of 0.33 μmol/L.? Conclusion The method is simple and feasible to determine the content of TPN in drugs.

Key words： rhodamine B; iodine; tiopronin; fluorescence method; content determination

硫普羅寧（tiopronin，TPN）又稱作為凱西萊，分子結(jié)構(gòu)如圖1所示，在側(cè)鏈中含有巰基（-SH），該巰基具有活性可以保護(hù)肝臟，在體內(nèi)具有多種藥理效應(yīng)，在臨床上主要用于治療有機(jī)磷中毒[1]、藥物性肝損傷[2]、早期肝硬化、慢性肝炎[3]、脂肪肝[4]等各種疾病。

已報(bào)道的測(cè)定TPN的儀器分析方法主要有RP-HPLC[5]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]、柱前衍生-高效液相色譜熒光法[7]、LC-ESI-MS-MS[8]、褪色光度法[9]、UV-Vis[10]、 HPLC[11]、浮選法[12]、金納米熒光法[13]等，但這些方法有的檢測(cè)靈敏度較低，分離效果較差，有的儀器設(shè)備較為復(fù)雜或昂貴，分析的成本較高，有的需要具備特殊的檢測(cè)器，在實(shí)際操作過程中存在一定的限制。

羅丹明B（rhodamine B，RhB）屬于三苯甲烷類染料，具有熒光特性，常作為分析試劑用于熒光分析。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的氧化性物質(zhì)的測(cè)定分析中已有使用過RhB熒光猝滅法，如測(cè)定I-[14]、鐵（Ⅲ）[15]、亞氯酸根[16]等，對(duì)于分析還原性藥物的研究鮮見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，在弱酸反應(yīng)環(huán)境下，I-3-RhB締合物使得體系熒光消失，在實(shí)驗(yàn)體系中加入TPN，TPN分子中的官能團(tuán)巰基將I-3還原成I-，溶液熒光再現(xiàn)，熒光強(qiáng)度的增加值與TPN的濃度存在較好的線性關(guān)系，本研究據(jù)此建立了RhB熒光“關(guān)-開”法測(cè)定TPN含量的光譜分析新方法，該法用于腸溶片中TPN含量的分析，具有試劑易得，選擇性較好，簡(jiǎn)化便捷，分析成本較低、靈敏度較高的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

FA2004電子分析天平（購(gòu)自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、F97pro熒光分光光度計(jì)（購(gòu)自上海棱光技術(shù)有限公司）。

RhB（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、TPN標(biāo)準(zhǔn)品（美侖生物科技有限公司）、TPN腸溶片（上海凱寶新誼（新鄉(xiāng)）藥業(yè)有限公司；江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司；遠(yuǎn)大醫(yī)藥（中國(guó)）有限公司）、0.20 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液（廣檢（廣州）檢測(cè)科技有限公司）、碘單質(zhì)（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）、碘化鉀（國(guó)藥集團(tuán)）。所有試劑均為分析純。所用的化學(xué)品均未經(jīng)進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣液的制備

TPN標(biāo)準(zhǔn)品貯備液：分析天平準(zhǔn)確稱取0.163 3 g標(biāo)準(zhǔn)品，將其加水溶解后定容至10.00 mL，制成0.10 mol/L TPN標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，實(shí)驗(yàn)時(shí)溶液稀釋1 000倍。RhB貯備液[17]：分析天平稱量RhB 0.119 8 g，加水溶解后定容至250.00 mL，配制濃度為1.00 mmol/L的RhB貯備液。碘標(biāo)準(zhǔn)溶液[18]：分析天平準(zhǔn)確稱量碘單質(zhì)12.650 0 g（分析純）置1.0 L容量瓶中，然后加入1.00 mol/L的氫氧化鈉150.00 mL，隨后震蕩半分鐘，密封靜置至碘完全溶解，溶液無色說明反應(yīng)完全，加碘化鉀固體36.000 0 g，1.00 mol/L HCl 150.00 mL，蒸餾水定容至1.0 L，制成濃度為0.05 mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液。隨后將溶液轉(zhuǎn)移至棕色細(xì)口瓶?jī)?nèi)，靜置36 h待用，使用時(shí)稀釋50倍。

1.2.2 測(cè)定方法

取HAc-NaAc緩沖溶液1.00 mL，TPN標(biāo)準(zhǔn)溶液適量于10.00 mL容量瓶中，然后加碘液0.40 mL，反應(yīng)6 min后再依次加入RhB 1.00 mL，加蒸餾水定容，搖勻靜置9 min。當(dāng)以365 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)[17]。本研究的激發(fā)波長(zhǎng)選擇365 nm。于熒光分光光度計(jì)500～700 nm范圍掃描體系的熒光強(qiáng)度，得到體系的熒光光譜，測(cè)定不同TPN濃度在582 nm處的熒光強(qiáng)度F365/582，并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜與波長(zhǎng)的選擇

圖2為激發(fā)波長(zhǎng)365 nm 時(shí)反應(yīng)體系的熒光光譜圖，其中，曲線a為RhB的熒光發(fā)光曲線，結(jié)果表明RhB有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，且熒光發(fā)射峰位于582 nm處；曲線b為碘液加入后的發(fā)光曲線，與曲線a相比，曲線b的熒光強(qiáng)度發(fā)生了猝滅，這說明碘和RhB之間發(fā)生了締合，生成了I-3-RhB締合物而導(dǎo)致羅丹明的熒光強(qiáng)度明顯減弱；曲線c至曲線f為加入不同濃度TPN后碘液與RhB體系的熒光發(fā)射曲線，由圖2可知，隨著TPN的加入，體系的熒光再一次增強(qiáng)，且TPN加入的量越大，熒光增強(qiáng)幅度越大，這是因?yàn)門PN含有巰基官能團(tuán)而具有較強(qiáng)的還原性，能將I3還原為I-，I-不與RhB作用，體系的熒光信號(hào)得以恢復(fù)。

2.2 條件的優(yōu)化

2.2.1 酸度與緩沖溶液用量的選擇

取0.10 mmol/L TPN標(biāo)準(zhǔn)液1.00 mL，通過加入不同體積的0.20 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)其pH，探究不同酸度對(duì)體系的影響[14]。結(jié)果表明，當(dāng)pH不斷增強(qiáng)時(shí)，熒光強(qiáng)度增加，這是由于RhB分子結(jié)構(gòu)中的羧基隨著OH-濃度不斷增加而導(dǎo)致電離程度不斷增大，吸電子能力減弱，從而熒光強(qiáng)度增大[19]；當(dāng)pH在4.0至8.0時(shí)處于一個(gè)比較穩(wěn)定的狀態(tài)；pH開始大于9.0時(shí)，碘開始發(fā)生歧化[20]，F(xiàn)365/582二次增大，說明pH在4.0～8.0時(shí)比較適合羅丹明和碘的締合，也有利于TPN的氧化。因此本試驗(yàn)選擇的反應(yīng)介質(zhì)為pH為4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液。

考察緩沖溶液用量對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果如圖3所示，隨著體積的增大，體系的熒光強(qiáng)度先增后降，當(dāng)緩沖溶液用量為1.00 mL時(shí)體系的熒光強(qiáng)度最大，故實(shí)驗(yàn)選擇1.00 mL為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的用量。

2.2.2 RhB最佳濃度的選擇

RhB的熒光強(qiáng)度與自身濃度有著非常密切的關(guān)系。在10.00 mL容量瓶中加入HAc-NaAc緩沖液（pH=4.6）1.00 mL，RhB 0～1.80 mL，加水定容測(cè)定其熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，RhB水溶液的體積在0～1.00 mL范圍內(nèi)時(shí)，其熒光強(qiáng)度與體積存在線性關(guān)系，當(dāng)RhB濃度大于0.10 mmol/L，即RhB體積大于1.00 mL，熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，可知RhB的水溶液超過一定濃度則會(huì)形成二聚體甚至多聚體，自熄滅增強(qiáng)，線性關(guān)系會(huì)消失[19]。為了實(shí)驗(yàn)的線性范圍足夠大且具有較低的檢測(cè)限，實(shí)驗(yàn)確定RhB的濃度為0.10 mmol/L，即加入1.00 mL的RhB溶液。

2.2.3 碘液最佳濃度的選擇

考察I-3-RhB體系在不含有TPN的情況下，改變碘液用量的情況下對(duì)RhB的熒光猝滅的影響。在10.00 mL容量瓶?jī)?nèi)分別加入HAc-NaAc 1.00 mL，不同體積的碘液0～2.00 mL，RhB溶液1.00 mL，定容至10.00 mL，測(cè)定其熒光強(qiáng)度。圖5分析結(jié)果表明，當(dāng)加入的碘液在0～0.40 mL時(shí)猝滅的線性度較好，當(dāng)濃度大于0.50 mL時(shí)體系的熒光強(qiáng)度開始呈現(xiàn)較為平緩的趨勢(shì)，當(dāng)加至1.20 mL時(shí)體系熒光強(qiáng)度不再發(fā)生明顯變化。為了實(shí)驗(yàn)具有良好的線性，故碘液用量為0.40 mL，此時(shí)體系內(nèi)碘液的濃度為0.04 mmol/L。

2.2.4 最佳反應(yīng)溫度與時(shí)間的選擇

取0.10 mmol/L TPN標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL、其他條件不變。通過考察在20～50 ℃的溫度下體系的熒光強(qiáng)度，可知體系的熒光強(qiáng)度在反應(yīng)溫度為20～35 ℃為最大且變化較小。因此，選擇室溫25 ℃為TPN氧化以及RhB熒光猝滅反應(yīng)的最佳溫度。

探究TPN與碘的氧化以及碘與RhB締合2個(gè)反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6，曲線a為HAc-NaAc 1.00 mL，0.10 mmol/L TPN標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL，碘液0.40 mL，分別反應(yīng)2～10 min（間隔為2 min一組）后加入1.00 mLRhB溶液于10.00 mL容量瓶定容，靜置10 min后。在不同氧化時(shí)間點(diǎn)分別測(cè)定的體系熒光強(qiáng)度；曲線b為取HAc-NaAc1.00 mL，0.10 mmol/L TPN標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL，碘液0.40 mL，反應(yīng)8 min后加入1.00 mLRhB溶液定容至10.00 mL，分別搖勻靜置2～10 min（間隔為2 min一組）后測(cè)定不同靜置時(shí)間下體系的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，TPN與I-3反應(yīng)較快，加入瞬間黃色有變化，6 min時(shí)反應(yīng)完全，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大；RhB與碘締合在8 min時(shí)反應(yīng)完全，10 min時(shí)熒光強(qiáng)度基本保持不變，因此，RhB加入后的靜置時(shí)間為9 min。

2.2.5 試劑加入最佳順序的選擇

取1.00 mL 0.10 mmol/L的TPN標(biāo)準(zhǔn)溶液，重點(diǎn)考察了“氧化后締合”以及“締合后氧化”兩種順序?qū)晒鈴?qiáng)度（F365/582）的影響。結(jié)果表明順序?yàn)椋篢PN+碘液+RhB，即先氧化后締合時(shí)體系熒光強(qiáng)度最為穩(wěn)定，并且此時(shí)體系的熒光強(qiáng)度最高。所以實(shí)驗(yàn)選擇TPN+I-3+RhB的加入順序?yàn)樽罴选?/p>

2.2.6 共存物質(zhì)的影響

針對(duì)藥物中常見的賦形劑和添加劑，實(shí)驗(yàn)考察了葡萄糖、淀粉、硬脂酸鎂、糊精、蔗糖、乳糖、甘油以及Ca2+、Fe3+、Mg2+、Al3+等陽離子在優(yōu)化條件下對(duì)測(cè)定的干擾。干擾實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)相對(duì)誤差小于或等于±5%時(shí)，150倍的淀粉、葡萄糖、糊精、硬脂酸鎂、蔗糖、乳糖以及100倍的金屬離子Mg2+、Al3+、Ca2+對(duì)測(cè)定結(jié)果均無干擾，TPN和I-皆可被Fe3+氧化，F(xiàn)e3+存在一定的干擾。由于藥品中附加成分和輔料很少加Fe3+，因此，不在此討論其干擾情況。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取一系列濃度的TPN標(biāo)準(zhǔn)溶液于10.00 mL容量瓶中按照前面的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)其熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)表明，TPN濃度在1.00～20.00 μmol/L時(shí)與熒光強(qiáng)度有較好線性，線性方程為△F365/582=84.783+9.696 2C（μmol/L），相關(guān)系數(shù)為0.999 3，通過10次空白溶液的測(cè)定，用3σ/k求得檢測(cè)限D(zhuǎn)L為0.33 μmol/L。

2.4 樣品分析

分別取來自3個(gè)不同廠家的TPN腸溶片10片于分析天平中準(zhǔn)確稱重，除去包衣后在研缽中粉碎混勻，精密稱取一定量的TPN粉末，大約相當(dāng)于TPN 0.33 mg。加水溶解，于100.00 mL容量瓶中定容，經(jīng)濾紙過濾，取濾液10.00 mL定容至100.00 mL，作為待測(cè)液使用。按照2.2的實(shí)驗(yàn)方法取待測(cè)液1.00 mL進(jìn)行含量的測(cè)定，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品加入回收實(shí)驗(yàn)，所得回收率結(jié)果見表1。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于RhB的熒光“關(guān)-開”建立了測(cè)定TPN含量的熒光光譜分析新方法，TPN在1.00-20.00 μmol/L濃度范圍內(nèi)的TPN與熒光強(qiáng)度有較好的線性，線性回歸方程為△F365/582=84.783+9.696 2C（μmol/L），相關(guān)系數(shù)r=0.999 3，DL為0.33 μmol/L。利用該方法測(cè)定TPN腸溶片中TPN的含量，操作簡(jiǎn)便可行。

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