孤雌胚胎干細胞在細胞移植和治療上的應用

征月良

摘 要：研究發現，卵子孤雌激活后，從囊胚中獲得孤雌胚胎干細胞（parthenogenetic embryonic stem cells，pESCs），pESCs表達多能性標志物，發生表觀遺傳修飾重編程。它們具有高度的分化潛能，在體內可產生畸胎瘤，在體外能形成類胚體。pESCs能分化成多種類型的細胞，已被用于細胞移植治療研究。用pESCs分化來的成纖維細胞構建皮膚組織，移植到皮膚缺損處，能促進傷口愈合。源自pESCs的成骨細胞、成軟骨細胞和肌腱細胞接種到支架上并移植到皮下后，能再生出骨、軟骨和肌腱組織，從而可以為治療這些組織的損傷提供細胞來源。pESCs分化產生的心肌細胞移植到患急性心肌梗死的宿主心臟后，可改善心臟功能。由pESCs分化的神經干細胞或神經元移植到受損大腦或患帕金森病的宿主大腦后，也能促進大腦皮層的修復，改善宿主的運動缺陷。因此，pESCs在臨床上具有重要的應用和推廣價值，從而為疾病的細胞移植治療提供理論依據和臨床應用策略。

關鍵詞：孤雌胚胎干細胞；分化；細胞移植；細胞治療；疾病

中圖分類號：Q813

文獻標志碼：A

Applications of parthenogenetic embryonic stem cells in cell transplantation and cell therapy

ZHENG Yueliang

（College of Life Science， Linyi University， Linyi 276000， China）

Abstract： Parthenogenetic embryonic stem cells （pESCs） can be established from blastocysts after parthenogenetic activation of oocytes. pESCs express pluripotent markers and undergo epigenetic modification reprogramming. They have high differentiation potential， and can produce teratomas in vivo and embryoid bodies in vitro. Studies have shown that pESCs can differentiate into many types of cells and have been used in cell transplantation and cell therapy research. The fibroblasts differentiated from pESCs can be used to construct skin tissue， which can promote wound healing after being transplanted to the skin defects. Osteoblasts， chondroblasts， and tenocytes derived from pESCs can regenerate bone， cartilage， and tendon tissue after being seeded into the scaffolds and used for subcutaneous transplantation， thus providing cellular sources for the treatments of injuries of these tissues. Cardiomyocytes differentiated from pESCs can improve the cardiac function after they are transplanted into the hearts of hosts with acute myocardial infarction. Transplantation of neural stem cells or neurons derived from pESCs into the injured brains or the brains of hosts with Parkinsons disease can also promote the repair of cerebral cortex and ameliorate motor deficits of hosts. Therefore， pESCs have important clinical applications and promotion values， thus providing theoretical basis and clinical application strategy for cell transplantation and treatment of diseases.

Key words： parthenogenetic embryonic stem cells； differentiation； cell transplantation； cell therapy； disease

在正常有性生殖過程中，精子基因組和卵子基因組結合，獲得受精胚胎，胚胎在雙親遺傳物質的控制下進行發育。待胚胎發育至囊胚階段，從受精囊胚可獲得胚胎干細胞（embryonic stem cells derived from fertilized blastocysts，fESCs）[1]。哺乳動物的卵子孤雌激活后，也可產生胚胎，這種孤雌胚胎的發育僅是在卵子遺傳物質的控制下進行的。孤雌胚胎也能發育至囊胚，從囊胚可獲得孤雌胚胎干細胞（parthenogenetic embryonic stem cells， pESCs）。近年來，pESCs已成為干細胞研究的熱點之一，人們對這種干細胞的特性及其在細胞移植治療上的應用有了一定的了解。

卵子孤雌激活后，獲得pESCs。小鼠pESCs在體外培養時，形成碟狀集落，具有堿性磷酸酶活性，表達多能性標志八聚體結合轉錄因子3/4（octamer-binding transcription factor 3/4，OCT3/4）、階段特異性胚胎抗原1（stage-specific embryonic antigen-1，SSEA-1）和NANOG，這些產物對維持pESCs的未分化狀態起重要作用[2]。pESCs的印跡基因發生表觀遺傳修飾重編程，這種重編程與甲基化水平變化有關。人pESCs在傳代過程中，H19和Meg3的差異甲基化區域（differentially methylated regions，DMR）未發生甲基化，而Snrpn的DMR發生甲基化，引起H19和Meg3的表達上調及Snrpn的表達下調[3]。MAI等[4]對人pESCs中父系印跡基因的表達進行研究，發現有些印跡基因的表達水平與fESCs相同，而其他印跡基因在pESCs中表達水平下降。相比于fESCs，人pESCs中母系印跡基因的表達上調[5]。

pESCs具有高度分化潛能，將其注射到裸鼠體內，能形成畸胎瘤。畸胎瘤含有來自外胚層的神經節、中胚層的軟骨和內胚層的腺體。將pESCs進行體外懸浮培養，能分化成類胚體（embryoid bodies，EBs）。小鼠EBs用視黃酸處理后，置于成脂誘導培養基中，可產生脂肪細胞[6]。人pESCs可分化為肝細胞，此分化細胞具有常規肝細胞的典型超微結構，表達肝細胞標志蛋白CK18和Hepa。吲哚菁綠染色表明這種肝細胞是功能性細胞，對物質具有吸收和代謝能力[7]。pESCs不僅可分化為體細胞，也可分化為生殖細胞。將小鼠pESCs先分化為原始生殖細胞樣細胞（primordial germ cell-like cells，PGCLC），然后將PGCLC移植到腎包膜中，可獲得卵子，卵子成熟和受精后，能成功產生小鼠幼崽[8]。

pESCs表達自然殺傷細胞（natural killer， NK）活化性受體的配體，對NK細胞的殺傷非常敏感。在pESCs分化后，這種配體的表達下調，從而分化細胞獲得對NK細胞殺傷的抵抗力。來自pESCs的分化細胞移植后，如果移植物中仍含有pESCs，可能會增加移植的安全性，因為NK細胞會將pESCs作為靶細胞而減輕對分化細胞的殺傷[9]。盡管pESCs在體內可能形成畸胎瘤，但與fESCs相比，pESCs形成畸胎瘤的風險較低[10]。近年來，pESCs已用作一種重要的干細胞來源，以分化產生成纖維細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌腱細胞、心肌細胞、神經干細胞和神經元，來進行細胞移植治療研究。

1 分化成纖維細胞

胚胎干細胞在構建組織工程化皮膚方面具有巨大的應用前景。皮膚成纖維細胞的增殖和生長對于皮膚再生是重要的。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是細胞治療的重要細胞來源，它產生的外體能提高胞外信號調節激酶1/2的磷酸化水平，促進皮膚成纖維細胞的增殖[11]。MSCs的條件培養基中含有許多與皮膚再生相關的生長因子，能刺激皮膚成纖維細胞的生長和細胞外基質的產生，有利于皮膚傷口的愈合[12]。將小鼠pESCs進行懸浮培養，形成EBs，然后將EBs進行貼壁培養，從EBs的生長物中富集MSCs。用結締組織生長因子對MSCs進行處理，MSCs能定向分化為成纖維細胞，這種分化細胞與fESCs分化來的成纖維細胞類似，均能表達高水平的FGF、EGF、VEGF等生長因子，這些生長因子對傷口愈合和皮膚修復是重要的。將pESCs分化來的成纖維細胞接種到膠原凝膠，形成組織工程化皮膚等效物（tissue-engineered skin equivalents，TESE），能嵌入膠原凝膠中且活力高。TESE移植到小鼠的皮膚缺損處后，能促進傷口愈合，未出現明顯炎癥反應。皮膚缺損處發生上皮再生過程，在TESE移植后15 d被成功修復[13]。

2 分化成骨細胞和軟骨細胞

骨的形成可通過軟骨內途徑和骨膜內途徑實現，前一種途徑是骨骼干細胞（skeletal stem cell，SSC）在初始軟骨模板上形成骨，后一種途徑是骨膜干細胞（periosteal stem cell，PSC）在骨膜內分化成骨[14]。SSC也可分化形成軟骨，BMP2和sVEGFR1的共同作用有利于SSC向軟骨分化[15]。pESCs具有分化成骨和軟骨組織的潛能。先將小鼠pESCs進行懸浮培養，形成球狀EBs，然后將EBs置于涂有明膠層的培養皿中，進行貼壁培養，獲得紡錘狀MSCs。將MSCs分別在成骨分化培養基和成軟骨培養基中培養，分化為成骨細胞和成軟骨細胞。源自pESCs的成骨細胞（pESC-derived osteoblasts，pDOs）表達骨橋蛋白和骨鈣素，而來自pESCs的成軟骨細胞（pESC-derived chondroblasts，pDCs）表達II型膠原α1鏈和軟骨蛋白聚糖。將pDOs和pDCs分別接種到珊瑚支架和褐藻酸鈉支架上，它們均能在支架上存活，pDOs附著于珊瑚表面并生長到珊瑚孔中，pDCs在褐藻酸鈉凝膠中生長，形成圓形集落。把這些支架移植到裸鼠背部皮下后，沒有炎癥發生，pDOs和pDCs在移植處成功再生出骨和軟骨組織。pDOs形成的骨組織為紅色，外被結締組織包裹，表面有骨小梁，內部是軟骨，表明這種骨是通過軟骨內骨化的方式形成的。纖維組織分布于骨和軟骨之間，小血管穿過骨組織，血管內有紅細胞。盡管珊瑚支架存在于這種骨組織中，但可以通過脫礦質作用去除。pDCs形成半透明軟骨，有柔韌性和抗壓性，外被結締組織包被，橢圓形細胞散在分布于軟骨基質中。軟骨具腔隙，有少量血管穿過。pESCs能夠分化成骨和軟骨組織，為治療這些組織的損傷提供了一種細胞來源[2]。

3 分化成肌腱細胞

肌腱可以將力從肌肉傳遞到骨骼，以支持身體運動，肌腱細胞是肌腱再生的一種理想細胞來源。肌腱干細胞表達促微管聚合蛋白3和血小板衍生生長因子受體α，它可分化為肌腱細胞，在肌腱再生中起重要作用[16]。誘導多能性干細胞也可分化為肌腱細胞，這些細胞移植到受損肌腱后，能促進肌腱再生[17]。將小鼠pESCs分化成MSCs后，再通過循環機械拉伸對MSCs進行刺激，以增強其膠原合成能力，使其分化為肌腱細胞，這種分化細胞能表達肌腱細胞標志物如肌腱蛋白C和肌腱調節蛋白。肌腱細胞接種到聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架上后，能在支架上附著、生長和增殖， 并分泌細胞外基質。將接種有肌腱細胞的支架移植到小鼠的背部皮下，沒有畸胎瘤產生，肌腱細胞形成表面光滑的白色肌腱組織。在這種肌腱組織中，肌腱細胞位于支架軸上，隨后支架降解，出現縱向排列的膠原纖維和細胞結構。與天然髕骨肌腱相比，pESCs產生的肌腱中膠原纖維直徑更小，結構更松散，這可能是由于移植的皮下部位缺乏機械刺激的緣故。pESCs分化來的肌腱細胞可在體內形成肌腱組織，為肌腱損傷的治療提供了一種思路[18]。

4 分化成心肌細胞

小鼠pESCs可分化為心肌細胞，心肌細胞移植到主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）匹配小鼠的腎包膜后，能自發搏動28 d。若將這種心肌細胞移植到MHC不匹配小鼠的腎包膜，只能自發搏動7 d。將心肌細胞和滅活的小鼠胚胎成纖維細胞混合，加入膠原和培養基制成細胞混合液，然后將混合液加進4個環形模具組成的培養器皿，膠原凝固后，制成工程化心肌（engineered heart muscles，EHMs）。在EHMs中，心肌細胞呈各向異性排列，有自發收縮特性，對細胞外鈣濃度上升產生正性肌力反應。將小鼠EHMs與小鼠脾細胞和T細胞共培養，用干擾素γ進行刺激，未引起共培養系統中這些免疫細胞的增殖[19]。用胰島素樣生長因子II（insulin-like growth factor-II， IGF-II）過表達載體對小鼠pESCs進行轉染，生成IGF-II過表達的pESCs。IGF-II的過表達能促進pESCs向心肌細胞分化和成熟，將這些心肌細胞移植到患急性心肌梗死的小鼠心臟后，可改善其心功能指數，減少梗死區的膠原沉積和線粒體損傷，促進線粒體生成，表明pESCs分化來的心肌細胞可改善心肌梗死后的病理變化和心臟功能，從而為心肌再生治療提供了一條重要途徑[20]。

5 分化成神經干細胞和神經元

細胞治療作為一種治療帕金森病的方法，已經引起人們的極大興趣。胎兒神經組織移植可改善帕金森病的癥狀，但這種組織的來源有限，而且胎兒神經組織移植在倫理上也存在爭議。pESCs來源于未受精卵子，為帕金森病的治療提供了一種很好的選擇。將人pESCs分化為神經干細胞（human parthenogenetic stem cell-derived neural stem cells，hpNSCs）后，選擇患有神經毒素導致的中重度帕金森病的猴作受體，將hpNSCs注射到免疫抑制猴的紋狀體和黑質中，動物對手術的耐受性良好，注射的細胞既沒有形成腫瘤，也不會遷移到肺、心、肝等其他器官。hpNSCs在整個紋狀體和黑質中遷移和植入，并通過胼胝體遷移到對側大腦半球，其分化產生的多巴胺能神經元可改善帕金森病的癥狀[21]。除了猴外，患有創傷性腦損傷（traumatic brain injury， TBI）的大鼠也被用作hpNSCs的受體，進行細胞移植治療研究。將hpNSCs注入TBI大鼠的大腦皮層后，hpNSCs可以遷移并植入TBI的周圍區域，產生抗炎反應，減輕炎癥對神經元的繼發性損傷，增強神經元的存活力，減少反應性膠質細胞的增生，增加與神經譜系和髓鞘形成相關的表型表達，從而促進神經元修復。hpNSCs移植后，TBI大鼠在抬高身體的搖擺試驗中擺動偏差減少，前爪抓握能力增強，肢體失用癥狀得以改善，在放射臂水迷宮測試中空間認知的犯錯也減少，說明hpNSCs移植可以改善TBI大鼠的運動和認知缺陷，從而為TBI的細胞療法研究開辟一條重要途徑[22]。

大腦皮層對大腦的高級功能至關重要，成體動物的大腦皮層難以通過神經發生方式來補償因損傷導致的神經元損失。小鼠pESCs能分化成具有電生理活性的谷氨酸能神經元，這些功能性神經元移植到成體小鼠的受損大腦后，能整合到大腦皮層中，而且其發出的軸突具有皮質神經元的投射模式，在宿主腦中能發送軸突投射，從而有利于大腦皮層的修復[23]。除了小鼠pESCs，人pESCs也可分化成神經元，用于疾病的細胞移植治療研究。將人pESCs分化為神經上皮細胞后，誘導神經上皮細胞繼續分化為多巴胺能神經元，此神經元具有電生理活性，能誘發動作電位和細胞電流。將這些神經元移植到患帕金森病的猴的紋狀體中，移植體能在猴腦中存活、遷移和植入，不會形成腫瘤。猴的運動功能在細胞移植后得以改善，而且這種改善至少持續24個月，說明移植的細胞在受體大腦中能發揮長時間的功能，從而緩解疾病癥狀[24]。

6 結語

pESCs由孤雌激活的卵子制備而來，避免了通過破壞受精胚胎來獲得胚胎干細胞所帶來的有關倫理方面的問題。pESCs能大量增殖，可擴增足夠數量的細胞，供人們對干細胞的移植治療進行深入研究。pESCs是多能性干細胞，具有高度分化能力，可用于細胞移植治療研究。盡管pESCs為這些研究提供了一種重要的細胞來源，但在細胞治療時，需要防止畸胎瘤的發生，減少移植后細胞的死亡率，增強移植細胞的存活率。pESCs包括二倍體pESCs和單倍體pESCs，對它們的分化能力和細胞移植治療效果需要加以比較。pESCs除了分化成上述分化細胞外，若分化成其他種類的細胞，這些細胞的移植治療效果如何，也需要進行研究。另外，人們已以動物為模型，將人pESCs的分化細胞移植給這些動物來進行細胞移植治療研究。但如果這些細胞移植給人，它的安全性怎樣，有效性如何，還有待進行研究。

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