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多光譜法研究鈣黃綠素-U(VI)配合物與鯡魚精DNA的作用機理

2023-04-29 07:51:53劉德春楊文彬肖嘯楊懿謝紅威李威顏奧琦
西南科技大學(xué)學(xué)報 2023年1期

劉德春 楊文彬 肖嘯 楊懿 謝紅威 李威 顏奧琦

摘要:結(jié)合UV-Vis吸收光譜、熒光光譜和黏度測試法,系統(tǒng)研究了Tris-HCl(pH=7.25)緩沖溶液中U(VI)-鈣黃綠素(CA)配合物與鯡魚精DNA(hsDNA)的相互作用機理。通過摩爾比率法確定U(VI)-CA-hsDNA體系的結(jié)合比nU(VI)∶nCA∶nhsDNA=1∶2∶1。以雙倒數(shù)法計算出此體系在不同反應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù),熱力學(xué)計算表明U(VI)-CA-hsDNA的反應(yīng)是疏水力驅(qū)動進行的自發(fā)行為。結(jié)合熒光分析、Scatchard法分析和溶液黏度變化分析,證明U(VI)-CA配合物對hsDNA的熒光猝滅為動態(tài)和靜態(tài)混合猝滅過程,作用方式為嵌插和非嵌插的混合結(jié)合模式。實驗表明U(VI)-CA配合物嚴重影響hsDNA的生物功能。

關(guān)鍵詞:鯡魚精DNA放射性U(VI)鈣黃綠素?zé)晒忖?/p>

中圖分類號:O657.61文獻標志碼:A文章編號:1671-8755(2023)01-0022-09

Abstract:ViathemeasurementapproachesofUV-Visabsorptionspectrum,fluorescencespectrumandviscosity,theinteractionmechanismbetweenU(VI)-calcein(CA)complexandherringspermDNA(hsDNA)intheTris-HClbuffersolution(pH=7.25)wassystematicallyinvestigated.BindingratioofU(VI)-CA-hsDNAwasdeterminedasnU(VI)∶nCA∶nhsDNA=1∶2∶1bymolarratiomethod.BindingconstantsofU(VI)-CA-hsDNAcomplexatdifferenttemperatureswereobtainedbydoublereciprocalmethod,andtheevaluatedthermodynamicdataindicatedthattheformationofU(VI)-CA-hsDNAcomplexwasspontaneousanddrivenbyhydrophobicforce.Combinedwiththefluorescenceanalysis,scatchardmethodanalysisandsolutionviscositychangeanalysis,thefluorescencequenchingmodeofhsDNAbyU(VI)-CAcomplexwasprovedtobeamixeddynamic-staticquenchingprocess,andtheactionmodewasamixedcombinationmodeofintercalationandnonintercalation.TheexperimentalresultsshowthattheU(VI)-CAcomplexseriouslyaffectsthebiologicalfunctionofhsDNA.

Keywords:HerringspermDNA;RadioactiveU(VI);Calcein;Fluorescencequenching

鈾在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科技領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。作為重要的放射性核素之一,即使在低濃度下也具有嚴重的毒性[1],其不當(dāng)?shù)暮筇幚砘蚺欧艜Φ孛婧秃畬釉斐蓢乐氐沫h(huán)境威脅,因此,鈾及其各種衍生物的分析監(jiān)測受到廣泛關(guān)注[2]。含鈾廢物在水中易溶解、輸運和沉淀,若處理不當(dāng)而排入水體中,在微生物作用下將產(chǎn)生更多有毒金屬有機物,通過食物鏈富集進入人體,從而對人體健康造成嚴重影響[3]。因此,探索放射性鈾及其有機小分子活性配合物與生物大分子的作用方式,對了解放射性核素危害人體健康的致病機理具有重要意義。

生物體細胞核中的重要遺傳物質(zhì)DNA大分子由糖磷酸骨架和4個核堿基組成[4],它控制著蛋白質(zhì)的合成和儲存遺傳信息[5],在基因轉(zhuǎn)錄、基因表達、癌變和突變中起著至關(guān)重要的作用。因此,DNA常作為研究各種抗腫瘤和抗癌藥物的生物活性靶分子[6]。研究各種小分子及其金屬離子的配合物與DNA的相互作用機理,對于設(shè)計能夠識別特定DNA位點的新型高效藥物具有重要意義[7]。近年來,有學(xué)者開展了小分子及其各種金屬離子配合物與DNA結(jié)合的研究[8]。然而,放射性U(VI)及其各種有機小分子活性配合物與DNA的相互作用機理卻鮮有報道。研究鈾及其有機小分子活性配合物與DNA的結(jié)合方式,可以從分子水平上了解鈾及其小分子活性配合物對人體健康的影響,準確推進針對靶向癌細胞和正常細胞的無毒高效藥物的作用機理研究和開發(fā)[9]。UV-Vis吸收和熒光光譜具有測量簡單、快速且靈敏的特點,是研究小分子與生物大分子之間作用機理的最有效方法[10]。因此,本實驗在生理pH值條件下利用多光譜法研究了U(VI)-鈣黃綠素活性配合物與鯡魚精DNA的相互作用機理,為放射性鈾在環(huán)境科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)領(lǐng)域的毒性預(yù)防、評價及相關(guān)藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1實驗

1.1試劑

鯡魚精DNA(BR級,純度>99.0%,分子量為17736g·mol-1),上海源葉生物科技有限公司;三羥甲基氨基甲烷(BR級)、NaOH(AR級)、HCl(AR級)、茜素紅(AR級)、鈣黃綠素(AR級),成都市科隆化學(xué)品有限公司;硝酸鈾(AR級),北京化工廠。所有實驗溶液均使用生物反應(yīng)最優(yōu)pH值的Tris-HCl緩沖溶液制備。

1.2實驗方法

1.2.1UV-Vis吸收光譜測定

UV-Vis吸收光譜測量在UV-3150分光光度計(日本京都島津公司)和1.0cm石英比色皿上進行。吸收光譜的測定分3步進行,首先在系列10mL比色管中用Tris-HCl緩沖溶液配制固定濃度的U(VI),CA和hsDNA溶液(cCA=1×10-3mol·L-1,cU(VI)=1×10-3mol·L-1和chsDNA=1×10-5mol·L-1),以相應(yīng)pH值的緩沖溶液為空白參比溶液,掃描三者之間在20℃下相互作用的吸收光譜以確定最佳反應(yīng)pH值。其次,配制最佳反應(yīng)pH值下的U(VI),CA和hsDNA溶液(濃度同上一步),在石英比色皿中加入3.5mL相關(guān)溶液,采用滴定法測定U(VI)與CA相互作用的吸收光譜。最后,以摩爾比法得到U(VI)與CA反應(yīng)的結(jié)合比,配制此結(jié)合比下的一定濃度的U(VI)-CA配合物溶液,采用滴定法測定其與hsDNA在不同溫度下相互作用的吸收光譜。每次掃描光譜前均將比色皿中的樣品溶液充分混合并恒溫5min,體積效應(yīng)忽略不計,下同。

1.2.2熒光光譜測定

熒光光譜測量在F-4600熒光分光光度計(日本日立高科技公司,1.0cm石英比色皿)上進行。測量過程分為3個步驟:首先,不同反應(yīng)溫度下U(VI)-CA-hsDNA三相作用體系熒光猝滅光譜的測定采用1×10-3mol·L-1濃度的U(VI)-CA配合物溶液滴定1×10-5mol·L-1濃度的hsDNA溶液。其次,以3×10-4mol·L-1茜素紅作為熒光探針,固定hsDNA濃度為1×10-6mol·L-1,在室溫25℃下測定hsDNA和U(VI)-CA配合物不同混合摩爾比(0,0.2,0.4,0.6,0.8和1.0)的熒光光譜。最后,通過測量U(VI)-CA-hsDNA溶液從30℃升溫至90℃的最大特征熒光峰(掃描步長為10℃)的變化來確定U(VI)-CA-hsDNA配合物的熔點溫度(Tm),這里固定U(VI)-CA-hsDNA配合物的濃度為1×10-3mol·L-1。所有熒光光譜測定條件設(shè)置為中等速度,狹縫寬度5nm,幅度為2,波長310nm。

1.2.3U(VI)-CA-hsDNA反應(yīng)體系黏度的測定

使用烏氏黏度計(0.6mm)在25℃水浴中進行反應(yīng)體系溶液的黏度變化測量。hsDNA和U(VI)-CA配合物溶液的濃度均固定在1×10-4mol·L-1。加入2mLhsDNA溶液于10mL比色管中,分別加入不同量(0~8mL)的U(VI)-CA溶液,以Tris-HCl緩沖溶液稀釋制備系列不同濃度的U(VI)-CA-hsDNA三相體系溶液。分別在黏度計中加入不同濃度的U(VI)-CA-hsDNA溶液,重復(fù)3次測定各樣品的流動時間t。溶液比黏度η0和η值由η=(t-t0)/t0進行計算[11],其中t和t0分別代表在添加不同濃度U(VI)-CA配合物和單獨緩沖溶液存在下hsDNA的流出時間;η和η0分別代表添加和沒有添加U(VI)-CA配合物的hsDNA溶液的比黏度。

2結(jié)果及分析

2.1溶液pH值對U(VI)-CA-hsDNA配合物形成的影響

CA在不同的溶液pH值條件下與放射性U(VI)離子或hsDNA反應(yīng)時,其UV-Vis吸收光譜特征峰的吸光度值和位置會發(fā)生明顯變化,從而可確定體系反應(yīng)的最佳pH值。如圖1所示,CA溶液在323nm和493nm出現(xiàn)兩個特征吸收峰。將各反應(yīng)體系在493nm處的特征吸收峰的吸光度變化值和紅移值列于表1中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)U(VI)-CA和U(VI)-CA-hsDNA系統(tǒng)在pH值7.25時存在最大的吸光度降低值和紅移值,表明此pH值為U(VI)-CA-hsDNA配合物形成的最佳值,它接近人體生理pH值,符合hsDNA大分子的生物學(xué)條件。因此,后續(xù)實驗均在pH=7.25下進行。

2.2U(VI)-CA-hsDNA配合物形成的UV-Vis吸收光譜分析

CA與U(VI)的結(jié)合率可以通過分光光度滴定法的UV-Vis吸收光譜計算得到[12]。實驗發(fā)現(xiàn)U(VI)-CA配合物在493nm特征峰處的吸光度值隨U(VI)量的增加而顯著降低,并產(chǎn)生一定程度的紅移(圖2(a),每滴10μL,0-13對應(yīng)0~130μL)。通過摩爾比法可求得此特征峰處U(VI)-CA配合物的結(jié)合比nU(VI)∶nCA=1∶2(圖2(b))[13]。采用相同的方法,在λ=492nm處可確定U(VI)-CA-hsDNA三相體系的結(jié)合比nU(VI)∶nCA∶nhsDNA=1∶2∶1(圖2(c)和圖2(d),cU(VI)-CA=5.0×10-5mol·L-1,chsDNA=1.0×10-6mol·L-1,每滴10μL,0-30對應(yīng)0~300μL)。根據(jù)朗伯-比爾定律(吸光度A=εbc,b=1cm),U(VI)-CA和U(VI)-CA-hsDNA配合物在20℃下的表觀摩爾吸光度(ε)分別為5.11×104L·mol-1·cm-1和7.33×104L·mol-1·cm-1。

2.4U(VI)-CA配合物對hsDNA的熒光猝滅機理

圖5為不同溫度下滴加U(VI)-CA配合物的hsDNA溶液的熒光光譜(λex=310nm,λem=391nm,pH=7.25)。從圖5可見,hsDNA溶液的熒光強度隨著U(VI)-CA量的增加而顯著降低,但最大發(fā)射波長隨溫度的升高而產(chǎn)生明顯的紅移現(xiàn)象,表明hsDNA的構(gòu)象產(chǎn)生了改變(圖5(a)、圖5(b)和圖5(c))。同時,在475nm附近出現(xiàn)了一個等熒光強度點,表明U(VI)-CA配合物對hsDNA產(chǎn)生了嵌插作用[17]。由于hsDNA蛋白隨溫度升高而變性,導(dǎo)致U(VI)-CA-hsDNA溶液的熒光強度隨溫度升高而降低[18]?;谀柋确?,計算出U(VI)-CA-hsDNA配合物在不同溫度下的結(jié)合比nhsDNA∶nU(VI)-CA=1∶1(圖5(d)),與UV-Vis吸收光譜的分析結(jié)果相同。

為了進一步探索U(VI)-CA對hsDNA的猝滅機理,假設(shè)熒光猝滅是動態(tài)猝滅過程,因此可用Stern-Volmer方程來描述[19]:

2.5U(VI)-CA配合物與hsDNA之間的結(jié)合模式分析

由于茜素紅(AR)分子可以嵌入DNA鏈雙螺旋的堿基對中,從而增加其熒光強度。因此,AR可用作熒光探針來研究U(VI)-CA配合物與hsDNA之間的相互作用。AR對U(VI)-CA-hsDNA體系的影響可通過熒光Scatchard方程進行分析[24]:

式中:r是指每個核苷酸結(jié)合配合物的量;c是游離配合物的濃度;n是r的最大值;K是單個位點固有的結(jié)合常數(shù)。根據(jù)r的定義,可得:

U(VI)-CA是否嵌插入hsDNA的螺旋雙鏈中,可以通過測定U(VI)-CA-hsDNA不同溫度下的變性溫度(Tm)來確定。因為DNA的變性溫度一般在70℃左右,如果嵌入劑嵌入DNA的雙鏈堿基對中,則可以提高DNA螺旋雙鏈的穩(wěn)定性和Tm值;反之,非嵌入結(jié)合會導(dǎo)致Tm值增加不明顯[27]。測定U(VI)-CA-hsDNA配合物在不同加熱溫度下的系列熒光光譜,以最大特征峰處的熒光值比Ft/F0為縱坐標、加熱溫度為橫坐標繪制U(VI)-CA-hsDNA配合物的熱變性曲線如圖8所示。實驗發(fā)現(xiàn)在U(VI)-CA配合物存在下,hsDNA的Tm為80℃,表明U(VI)-CA配合物已嵌入hsDNA的雙螺旋堿基對中[28]。

雖然光學(xué)探針可以提供必要但不充分的線索來探索二者的結(jié)合模式,但流體動力學(xué)測量對溶液中結(jié)合模式的長度變化卻很敏感[29]。即,hsDNA與U(VI)-CA配合物的結(jié)合模式可以通過黏度測量進一步驗證。當(dāng)嵌入劑嵌入DNA后會增長DNA的雙螺旋鏈,導(dǎo)致DNA溶液的黏度顯著增加。反之,小分子配合物部分或非嵌入DNA的雙螺旋鏈中卻會降低DNA溶液的黏度,這是因為非嵌入結(jié)合不會明顯增加DNA溶液的黏度[30]。如圖9所示,hsDNA溶液的相對黏度值隨著U(VI)-CA配合物的增加量而降低,并最后趨于平衡。進一步證明U(VI)-CA與hsDNA的相互作用模式確實為嵌入和非嵌入結(jié)合模式。

3結(jié)論

本文結(jié)合UV-Vis吸收光譜、熒光光譜、熱變性和黏度測量法研究了U(VI)與鈣黃綠素和U(VI)-CA配合物與hsDNA之間的相互作用,獲得了U(VI)-CA-hsDNA的結(jié)合比(摩爾比1∶2∶1)、結(jié)合作用力和結(jié)合方式等信息和數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果表明U(VI)-CA配合物和hsDNA的結(jié)合是受焓驅(qū)動的自發(fā)作用,前者對hsDNA的猝滅過程是由動態(tài)和靜態(tài)猝滅相結(jié)合引發(fā)的,二者之間的作用方式為采用嵌插和非嵌插混合的結(jié)合模式。本文結(jié)果為了解放射性核素對人體的致病機理和尋找新的能夠識別特定DNA位點的新型抗腫瘤藥物提供了理論和實驗數(shù)據(jù)。

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