腺相關病毒不同轉染策略應用于心臟光遺傳學的研究

樊哲儒 王龍 王晞 周芳

[基金項目：國家自然科學基金面上項目（81772044）；湖北省重點實驗室開放項目（2021KFY035）

通信作者：王龍，E-mail：wanglongwhu@163.com]

【摘要】目的? 探究腺相關病毒不同轉染策略構建大鼠心臟光遺傳學模型的可行性與有效性。方法? 20只SD大鼠，隨機分為4組：心肌注射組、心包注射組、心外膜滴涂組、正常對照組，每組5只，分別心肌注射、心包注射、心外膜滴涂rAAV9-CAG-hChR2（H134R）-eYFP，正常對照組只開胸。造模4周后，超聲測量4組大鼠左室射血分數及左室短軸縮短率；記錄體表心電圖，測量RR間期、PR間期和QRS時限。開胸進行473 nm波長藍光照明實驗，根據光輸出信號與心電圖判斷心臟節律是否被光脈沖奪獲。對心臟組織石蠟切片進行HE染色和熒光觀察。結果? 心肌注射組、心包注射組、心外膜滴涂組大鼠與正常對照組大鼠相比，心電參數無顯著差異（P＞0.05），左室射血分數及左室短軸縮短率無顯著差異（P＞0.05）。用一定頻率和功率的473 nm藍光照射心肌注射部位或心臟，能奪獲心肌注射組和心包注射組心臟的節律，但不能奪獲心外膜滴涂組。HE染色顯示心肌注射組注射部位心肌纖維排列紊亂、炎癥細胞浸潤。熒光顯示心肌注射組、心包注射組、心包滴涂組心室切片均有ChR2（H134R）轉染。結論? 心包注射途徑能有效構建大鼠心臟光遺傳學模型。

【關鍵詞】光遺傳學；腺相關病毒；光敏蛋白質；光起搏；心包注射

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2023.12.000

Different Transfection Strategies of Adeno-Associated Virus Applied

to Cardiac Optogenetics

FAN Zheru1，WANG Long1，WANG Xi2，ZHOU Fang1

（1.Department of Anesthesiology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，Hubei，China；2.Department of Cardiology，Renmin Hospital of Wuhan University，Cardiovascular Research Institute of Wuhan University，Hubei Key Laboratory of Cardiology，Wuhan 430060，Hubei，China）

【Abstract】Objective? To investigate the feasibility and effectiveness of different transfection strategies of adeno-associated viruses to construct a rat cardiac optogenetic model. Methods? A total of 20 SD rats were purchased and randomly divided into four groups：myocardial injection group，pericardial injection group，epicardial drip coating group and normal control group. The rats （n＝5） were injected with rAAV9-CAG-hChR2（H134R）-eYFP by myocardial injection，pericardial injection and epicardial drip coating respectively. After Four weeks，left ventricular ejection fractions （LVEF） and left ventricular fractional shortening （LVFS） of all rats were measured by ultrasound;record the body surface ECG to measure the RR interval，PR interval and QRS wave time frame. Open-chest light experiments with 473 nm blue light were performed to determine whether the heart rhythm was captured by the light pulse based on the light output signal and the body surface ECG. Results? The rats in the myocardial injection group，pericardial injection group and epicardial drip coating group ，compared with the rats in the normal control group，showed no significant differences in ECG parameters （P＞0.05） and no significant differences in LVEF and LVFS （P＞0.05）. The rhythm of myocardial injection and pericardial injection groups could be captured by irradiating the myocardial injection site or heart with 473 nm blue light of certain frequency and power，but not the epicardial drip coating group. HE staining showed disorganized myocardial fiber arrangement and inflammatory cell infiltration at the injection site in the myocardial injection group. Fluorescence showed ChR2 （H134R） transfection in ventricular sections of the myocardial injection group，pericardial injection group，and pericardial drip coating group. Conclusion? The pericardial injection route can effectively construct cardiac optogenetics model.

【Key words】Optogenetics;Adeno-associated virus;Light-sensitive protein;Optical pacing;Pericardial injection

光遺傳學是利用遺傳技術，將光敏感元件導入細胞或組織，與光學技術結合[1]，對生物特定功能進行研究。2005年，神經科學領域首次報道光遺傳學應用，Boyden等[2]將光遺傳學應用于神經回路。2010年Bruegmann等[3]將帶有視紫紅質通道蛋白-2（channelrhodopsin-2，ChR2）的病毒結合到小鼠胚胎干細胞中，用于證明體外光學起搏。自此光遺傳學應用于心臟[4-6]，開啟心臟光遺傳學新興研究方向[3]。將ChR2[1]特定表達于心肌細胞，特定波長藍光照射導致細胞膜去極化，引發心肌細胞動作電位，使光遺傳學成為一種心臟起搏、同步化、終止心律失常的新途徑，有望實現無電擊和院外轉復。藥物、電子起搏器等有相關免疫反應、感染風險、設備故障和促心律失常的局限性，這些問題可通過光遺傳技術替代解決。本研究利用載有ChR2（H134R）目的基因的重組腺相關病毒血清型9（rAAV9）[7]，通過心肌注射、心包注射、心外膜滴涂3種途徑，將ChR2表達于大鼠心肌細胞，給予473 nm波長藍光，探討不同途徑構建大鼠光遺傳模型的可行性、安全性和有效性。

1? 材料與方法

1.1? 實驗動物及分組

清潔級雄性SD大鼠20只，體重（120±10）g，購自武漢大學人民醫院實驗動物中心，隨機分為4組：心肌注射組（n＝5），心包注射組（n＝5），心外膜滴涂組（n＝5），正常對照組（n＝5）。攜帶eYFP熒光的載有ChR2（H134R）的rAAV9購于武漢樞密腦科學技術有限公司。外科用封合劑購于百特醫療用品貿易（上海）有限公司。

1.2? 光遺傳模型制備

所有動物均在20～25 ℃的SPF級環境內恒溫飼養。適應性飼養1周后，禁食8 h，予大鼠腹腔注射60 mg/kg的3%戊巴比妥鈉進行麻醉，將其仰臥位固定于手術臺上。行氣管插管術，連接小動物呼吸機，正壓通氣，潮氣量10～15 mL，呼吸頻率70次/分。開胸后用擴胸器固定，充分暴露其心室游離壁的同時避免損傷肺葉。心肌注射組開胸術后，用30 G胰島素注射器將rAAV9（60×1012μL）進行心肌注射。心包注射組開胸術后，用5-0線穿過心包膜，將心包膜提起與心肌分離出間隙，通過間隙用30 G胰島素注射器將rAAV9（60×1012μL ）注射入心包腔內，注射完畢后棉簽輕輕按壓注射點避免病毒載體隨心臟跳動漏出心包外。心外膜滴涂組在開胸術后，用自制固定器在心室游離壁上定位，將相同容量的rAAV9載體滴入固定器內，噴入適量外科用封合劑，移除固定器，待封合劑固定膨脹后關胸。術后逐層縫合關胸，正常對照組大鼠只開胸。4組大鼠同等條件下給予常規飼料及水飼養4周。

1.3? 心臟超聲檢查

光遺傳造模4周后第1天，用超聲儀器（Vinno V6）評估大鼠心臟功能。4組大鼠腹部注射3%戊巴比妥鈉（10～20 mg/kg）麻醉，保留大鼠自主呼吸，胸部脫毛后仰臥位固定行經胸超聲心動圖檢查。測量大鼠左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）及左室短軸縮短率（Left ventricular fractional shortening rate，LVFS），連續3次后計算平均值。檢查完成后大鼠充分保暖直至清醒。

1.4? 體表心電圖記錄與光起搏效應評價

光遺傳造模4周后第2～5天，4組大鼠進行光起搏實驗，記錄體表心電圖。大鼠四肢用針刺電極連接PowerLab數據采集系統記錄Ⅱ導聯體表心電圖，利用LabChart 8.0分析RR間期、PR間期和QRS時限。

設置473 nm藍光激光器的脈沖寬度為20 ms，連續20個脈沖，使用不同光照頻率與光照功率（功率范圍0.02～65.50 mW）[8]照射心臟（緊貼心臟表面），根據同步記錄的光輸出信號與體表心電圖判斷心臟節律是否被光脈沖奪獲。

1.5? HE染色和eYFP熒光觀察

完成光照實驗的大鼠取心肌組織，生理鹽水沖洗干凈，4%多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋切片。用蘇木素和伊紅染液進行HE染色，觀察心肌形態學變化。用熒光顯微鏡觀察eYFP的綠色熒光，以確定病毒的轉染情況。

1.6? 統計學分析

采用GraphPad Prism 8進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（X±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，計數資料用率表示，采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

2? 結果

2.1? 心電指標比較

根據LabChart 8.0記錄的Ⅱ導聯心電圖，測量4組大鼠心電圖相關參數。心肌注射組、心包注射組、心外膜滴涂組大鼠與正常對照組大鼠相比，RR間期、PR間期及QRS時限無顯著差異（圖1）。

2.2? 心功能指標比較

心臟超聲結果顯示，心肌注射組、心包注射組、心外膜滴涂組大鼠與正常對照組大鼠相比，LVEF及LVFS無顯著差異（圖2）。心肌注射組的LVEF及LVFS雖略有降低，但無統計學意義。

2.3? 光起搏有效性評價

病毒轉染4周后，使用20個脈沖寬度20 ms的473 nm藍光照射大鼠心臟或注射部位，達到一定脈沖頻率與光照功率范圍后能奪獲心肌注射組、心包注射組大鼠心臟的節律，但不能奪獲心外膜滴涂組和正常對照組心臟的節律（圖3）。

2.4? 心肌HE染色

心包注射組和心外膜滴涂組大鼠心肌切片之間HE染色無明顯區別，心肌纖維排列規則，細胞膜完整，輪廓清晰，未見明顯炎癥細胞浸潤。心肌注射組注射部位（右心室）心肌切片顯示心肌纖維排列紊亂，炎癥細胞浸潤（圖4）。

2.5? eYFP的熒光表達

熒光顯微鏡下觀察到3組大鼠心房切片偶見綠色熒光。心包注射組心室切片、心外膜滴涂組心外膜處心室切片顯示綠色熒光，心肌注射組注射部位心室切片顯示綠色熒光（圖5）。

3? 討論

心臟光遺傳學是一種新興的操作和技術，將光學與遺傳學結合，利用基因編輯技術，在心肌細胞插入光敏感生物元件，通過光電流引發心肌細胞電活動。ChR2是一種快速門控非選擇性光敏陽離子通道，來源于萊茵衣藻，可在哺乳動物細胞中穩定安全地表達，主要傳導Na+和K+，ChR2激活引發向內電流和細胞膜去極化。心臟光遺傳學常使用ChR2（H134R），是ChR2的第一個突變體，與ChR2相比脫敏性降低，可產生兩倍光電流，雖然通道開關速度減慢，但仍在毫秒水平[9]。AAV是一種單鏈DNA病毒，長度約為18～25 nm。根據病毒衣殼蛋白氨基酸序列，AAV分為多個血清型。其中AAV9與其他血清型相比，具有心肌細胞趨向性及心肌轉染效率高等優點[7，10]，適用于構建心臟光遺傳學模型。既往已有研究證明可通過靜脈注射途徑構建心臟光遺傳模型，但與構建模型的途徑相比，靜脈注射所需的大劑量[11]限制了靜脈注射的發展。

本研究采用了三種方式構建大鼠心臟光遺傳模型，分析其對心臟組織分布和轉導效果的影響，評估各方式的可行性與安全性。心肌注射可在注射部位局部實現高效的心肌細胞基因轉移，實現1∶1心臟起搏，但與其他途徑相比，心肌注射方式產生強烈的心肌內炎癥和心肌細胞壞死[12]，更易導致心室顫動[13]。水凝膠已用于藥物輸送系統[14]，實現皮膚、骨骼、血管等組織的修復和再生。本研究中使用的外科用封合劑，是一種合成水凝膠，已成熟應用于臨床。但由于本實驗一是，未對rAAV9與外科用封合劑的相互作用進行驗證，rAAV9轉染效率是否受影響有待研究；二是，操作過程中，液體在心外膜表面的流動性可能導致病毒的流失，實際轉染量低于預期，結果中熒光雖提示心外膜滴涂組大鼠心外膜處有病毒轉染，但未能有效傳遞基因以實現心臟起搏。心包腔是天然的包膜，心包注射可將rAAV9限制在心包內，延長病毒與心肌接觸時間，增大接觸面積，實現病毒的靶向傳遞，減少病毒對其他組織可能產生的副作用。此外，心包注射已應用于藥物、質粒、細胞、生物制劑的傳輸[13]，顯示心包注射在治療心律失常、血管損傷和心肌梗死中的潛力。本研究中，心包注射不僅對大鼠心臟的電生理與功能影響較小，且能實現1∶1心臟起搏。

雖然本實驗表明心包途徑是一種有效的傳遞基因的方式，但仍具有局限性。首先，心包注射組大鼠心房未能有效表達ChR2，實現心房奪獲。其次，病毒在心臟組織的分布與心包內病毒的清除率密切相關，注射入心包的病毒能否在清除前轉染至心肌細胞有待進一步研究。另外，病毒量的選擇也很重要，如何達到最大效率轉染且不至于心臟壓塞還有待探討。最后，本研究所有的結果是在嚙齒動物實驗中得到的，嚙齒動物與人類之間有不同的心血管解剖結構和生理[15]，尚需在與人類有類似結構或生理的大型動物（如犬、豬）中進行進一步研究，提供臨床轉化的數據。

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收稿日期：2022-12-22