無葉假木賊葉綠體基因組特征系統發育及密碼子偏好性分析

江萍　黃祥　Sulaiman Shah等

關鍵詞：無葉假木賊；葉綠體基因組；系統發育；密碼子

中圖分類號：Q941.2 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2023）04-0109-13

無葉假木賊（Anabasis aphylla L.）隸屬于藜科（Chenopodiaceae）假木賊屬（Anabasis），半灌木，具有強的抗鹽堿能力，在我國主要分布于西北地區。無葉假木賊是荒漠植被的主要建群種和優勢種，常作為防風固沙的植物材料，具有很高的生態價值。同時，其植株提取物包含生物堿、萜類、皂苷類等多種生物活性物質，有效治療疥癬、疥瘡和濕疹癢痛，還有效防治菜青蟲、蚜蟲等多種害蟲。

葉綠體是一種重要的質體，在植物細胞的光合作用等生物過程中起著關鍵作用。葉綠體基因組通常比核基因更為保守，對植物系統發育和物種鑒定有重要作用。在物種進化過程中，葉綠體基因組在序列、組成、大小和基因含量方面高度保守，具有2個反向重復區（inverted repeats， IR）、1個小單拷貝區（small single copy，SSC）和1個大單拷貝區組成的四分體結構（large single copy，LSC）。IR區域的收縮和擴張是葉綠體基因含量和基因組大小變化的主要影響因素。葉綠體基因組中存在一些簡單重復序列（SSRs）和單核苷酸多態性（SNP）的熱點區域，可產生足夠的信息用于物種分類和鑒定。此外，植物葉綠體基因組中的密碼子偏好性反映其在進化過程中的分子適應程度和受到的進化壓力，同時參與基因的表達。目前，葉綠體基因組序列作為超級條形碼，已經在藜科中多個物種的系統發育研究中得到應用。然而，假木賊屬物種的葉綠體基因組尚未被報道，它們的進化特征和遺傳多樣性尚不清晰。

本研究首次對假木賊屬的無葉假木賊的葉綠體基因組進行測序、組裝和注釋，進一步分析其葉綠體基因組特征和密碼子偏好性等；此外，將其與已公布葉綠體基因組的藜科物種構建系統發育樹，進一步篩選種間基因組高變區。本研究目的在于：（1）闡明無葉假木賊與其它藜科物種的進化關系及其在系統發育中的地位；（2）篩選有效的候選分子標記序列和最優密碼子，以期為無葉假木賊的分子標記開發、系統進化及葉綠體基因工程研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料及測序

植物樣本來源于新疆準格爾盆地南緣（84°52′E，45°22′N，海拔265 m），經石河子大學楚光明教授鑒定為無葉假木賊（A.aphylla L.）。采集的幼嫩同化枝用液氮處理后置于液氮保溫桶，帶回實驗室放于-80℃冰箱保存。基于改良的CTAB法提取無葉假木賊總DNA，用超聲波將DNA片段化，經過純化、末端修復、3端加A、連接測序接頭的片段，通過瓊脂糖凝膠電泳的方法選擇合適長度的片段進行PCR擴增，構建測序文庫。文庫質檢后，基于Illumina Genome Analyzer Hiseq 2000測序平臺進行葉綠體基因組測序。

1.2葉綠體基因組組裝與注釋

使用GetOrganelle軟件對無葉假木賊葉綠體基因組序列進行組裝；通過Perl語言腳本Plann對葉綠體基因組進行注釋；利用Sequin檢查注釋缺失或錯誤的基因。利用OGDRAWv.1.3.1軟件繪制葉綠體基因組環狀結構圖。無葉假木賊葉綠體基因組數據已上傳GenBank數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/），登錄號為OP712667。

1.3葉綠體基因組重復序列分析

利用REPuter在線工具對長重復序列進行分析，最大重復序列數為100，最小重復大小為22bp。使用MISA在線工具檢測簡單重復序列（Simple Sequence Repeats，

SSRs），參數設置為：單核苷酸重復次數≥10，二核苷酸重復次數≥5，三核苷酸重復次數≥4，四核苷酸到六核苷酸重復次數≥3。

1.4系統發育樹構建

從NCBI的GenBank數據庫下載19種藜科（Chenopodiaceae）物種的葉綠體基因組序列，登錄號分別為：Spinacia oleracea L.（AJ400848）、Dysphania pumilio （R.Br.） Mosyakin＆Clemants（MH936550） 、Dysphania botrys L.（MH898873）、Dysphania ambrosioides L.（MK182726）、Chenopodium quinoa Willd.（KY419706）、Chenopodium ficifolium Sm.（MK182725） 、Chenopodium album L.（KY419707）、Chenopodium acuminatumWilld. （MW057780）、Atriplex centralasiaticalljin（MK867774）、Atriplex gmelinii C.A.Mey.ex Bong. （MT810472）、Salsola affinis C.A.Mey （ON080842） 、Salsola abrotanoides（Bunge）Akhani （MW123092）、Haloxylonammodendron （C. A. Mey.） Bunge（KF534478） 、Haloxylon persicum Bge.（KF534479） 、Suaeda glauca L.（MK867773）、Salicornia europaea L.（KJ629116）、Salicornia brachiate Miq.（KJ629115） 、Salicornia

bigelovii Torr.（KJ629117）、Kalidium foliatum （Pall.） Moq.（MW699755）；以2種莧科物種，Deeringia amaranthoides （Lam.） Merr. （MK397865）和Celosia argentea L.（MK397861）的葉綠體基因組序列作為外群，與測得的無葉假木賊葉綠體基因組序列共同構建系統發育樹。基于MAFFT v.7.450軟件對22個物種的葉綠體基因組序列進行多序列比對，通過IQ-TREE v.2.1.1軟件構建最大似然法（Maximum likelihood， ML）系統進化樹，其中最優構樹模型為TVM+F+R3，步長值為1000。

1.5葉綠體基因組突變位點和IR邊界分析

通過MAFFT v.7.450軟件對包括無葉假木賊在內的藜科20個物種的葉綠體基因組序列進行多序列比對，對齊后的序列通過DnaSP 6.0軟件計算核苷酸多態性值（搜索窗口長度為600 bp，步長為200 bp）。將無葉假木賊及其近緣種的genbank格式的葉綠體基因組文件上傳至生信云在線分析網站（http：//112.86.217.82：9919/#/tool/all-tool/detail/296），進行葉綠體基因組IR區邊界區域上基因的可視化。

1.6密碼子使用偏好性分析

在無葉假木賊葉綠體基因組中，篩選長度大于300 bp的基因序列，使用Codon W 1.4.2軟件和CUSP在線程序（https：//emboss.toulouse.inra.fr/cgi-bin/emboss/cusp）對有效密碼子數、同義密碼子相對使用度（ RSCU）、密碼子GC含量和最優密碼子進行計算。通過中性繪圖、ENC-plot和PR2-plot分析密碼子偏好性的影響因素。

2結果與分析

2.1葉綠體基因組結構特征

無葉假木賊葉綠體基因組呈典型的雙鏈環狀四分體結構（圖1），全長為154 084 bp，其中，LSC長85 124 bp，SSC長18 934 bp，IRa和IRb長25 013 bp。葉綠體基因組GC含量為36.25%，其中，SSC、LSC、IR區的GC含量分別為29.26%、33.89%、42.85%。

無葉假木賊葉綠體基因組中共注釋到132個基因，包含83個蛋白編碼基因，8個rRNA基因，37個tRNA基因和4個假基因。其中，75個基因與自我復制功能相關，45個基因與光合作用功能相關，6個基因編碼其它蛋白質，6個基因的功能未知（表1）。16個基因存在雙份拷貝，包括6個蛋白編碼基因（rp/23、rp/2、rps12、rps7、ndhB、ycf2），6個tRNA基因（trnA-UGC、trnl-GAU、trn L-CAA、trnN-GUU、trn R-ACG、trnV-GAC）和4個rRNA基因（rrn4.5S、rrn5S、rrn16S、rrn23S）。此外，1個tRNA基因（trn M-CAU）在無葉假木賊葉綠體基因組中存在3份拷貝。

無葉假木賊葉綠體基因組中有16個基因包含內含子，12個基因位于LSC區，3個基因位于IR區，1個基因位于SSC區（表2）。14個基因包含1個內含子（trn K-UUU、rps16、trn G-UCC、atpF、rpo C1、trnL-UAA、trnl-GAU、petB、petD、rp/16、ndhB、trn V-UAC、trnA-UGC、ndhA），2個基因包含2個內含子（ycf3、c/pP）。內含子長度在525 bp（trnL）～2500 bp（trnK）之間。

2.2重復序列分析

無葉假木賊葉綠體基因組中共有41對長序列重復，其中，正向重復21對，回文重復20對，無互補和反向重復（圖2A）。其中，重復長度為30 bp的數量最多，分布在IR區的重復長序列數量最多。無葉假木賊葉綠體基因組中，共確定71個SSR位點，屬于12種重復類型（圖2B）。其中，A/T重復類型的SSR數量最多，且重復次數在10、11、12次最常見。此外，SSR在基因間區的數量最多（70.4%），其次是位于內含子（14.1%）和蛋白編碼序列（12.7%），tRNA和rRNA數量最少（1.4%）（圖2 C）。

2.3系統發育分析

為確定無葉假木賊在藜科的系統位置，將其和19個藜科物種的葉綠體基因組進行系統發育分析，并以2種莧科物種為外類群，構建了ML系統發育樹（圖3）。結果表明：藜科物種系統發育樹共分為2個大的分支，聚類的支持率較高，大部分節點的支持率為100%。第一分支包含聚類組1和聚類組2，聚類組1包含：鹽爪爪屬、鹽角草屬和堿蓬屬的5個物種；聚類組2包含：假木賊屬、梭梭屬和豬毛菜屬的5個物種。第二分支包含聚類組3和聚類組4，聚類組3包含：濱藜屬和藜屬的6個物種；聚類組4包含：腺毛藜和菠菜屬的4個物種。2個莧科的外群物種單獨在一個分支。

2.4突變熱點分析

基于聚類分析結果，將無葉假木賊及其9種近緣種葉綠體基因組序列進行突變熱點分析。結果表明：LSC和SSC區的核苷酸多態性明顯高于IR區（圖4）。序列比對總長度為161 920 bp，序列一致位點長度為138 470 bp，突變位點數為14021；核苷酸多態性平均值為0.039 18，范圍為0～0.143 43。19個突變位點的核苷酸多態性大于0.1，3個在LSC區，16個在SSC區；19個突變位點分別屬于trnS-trn G（exon1）、ndhF-rpl32、rpl32-trnL、rps16（exonl）-trnQ基因間區和ycf基因區。

2.5 IR區邊界收縮和擴張分析

無葉假木賊及其9種近緣種的邊界分析顯示：IR區長度變化不大（23 701～25 036 bp），但4個邊界區的過渡區域存在一定差異（圖5）。藜科10個物種的葉綠體基因組在IRb-LSC邊界均存在rps19基因，向LSC區擴張長度在148～173 bp之間。在IRb-SSC邊界，梭梭屬、豬毛菜屬和堿蓬屬的5個物種ycf假基因缺失；其它5個物種的ycf基因均不同程度的擴張到了SSC區域中，擴張長度在18～4440 bp之間。在IRa-SSC邊界，均存在不同程度的ycf基因擴張，長度在3～5426 bp之間。在IRa-LSC邊界，鹽爪爪屬、鹽角草屬、豬毛菜屬和堿蓬屬的6個物種IRa區不存在rps19基因，其余4個物種的rps19基因均沒有越過IRa-LSC邊界。

2.6密碼子偏好性分析

無葉假木賊葉綠體基因組中RSCU值在0.32（CUG）～2.07（UUA）之間，30個密碼子為高頻密碼子（RSCU>1），除編碼亮氨酸的密碼子UUG以G結尾外，其它29種密碼子均以A/U結尾（表3）。共確定20個最優密碼子（UUU、UAU、UGU、CAU、UCU、UCA、UUA、CUU、CCU、AGA、GAA、ACU、ACA、AAU、GAU、AAA、GUU、GCU、GGU、CAA），均以N/U結尾。

進一步通過ENC-plot、ENC分布直方圖、PR2-plot和中性繪圖，分析無葉假木賊葉綠體基因組中密碼子偏好性的影響因素（圖6）。由圖6A可知：大部分基因分布在期望曲線附近。由圖6B可知：大部分基因的ENC值小于ENC期望值，且主要分布在直方圖的0～0.1區間內。由圖6C可知，分布在四個象限點的數量差異不大，但右下角分布點的數量略高于其它三個象限；這表明除了突變因素，自然選擇也是無葉假木賊葉綠體基因組密碼子偏好性的影響因素。由圖6D可知：GC12和GC3之間相關性系數為0.45，線性回歸系數為0.343 6，進一步表明突變因素對密碼子使用偏好性的影響占34.36%。因此，無葉假木賊葉綠體基因組密碼子使用偏好性主要受自然選擇影響，突變等影響因素對其影響較弱。

3討論

植物葉綠體基因組相對保守，已有研究表明，被子植物葉綠體基因組長度通常在120～180 kb之間，IR區在20～30 kb之間。本研究中，無葉假木賊葉綠體基因組全長為154 084 bp，IR區長度為25 013 bp，在被子植株葉綠體基因組序列長度范圍內。此外，無葉假木賊葉綠體基因組與大多數被子植物的葉綠體基因組有相似的環狀四分體結構。被子植物葉綠體基因組大小與IR區和SC區邊界的擴張和收縮密切相關。本研究中，無葉假木賊及其9種近緣種葉綠體基因組的邊界分析顯示，IR區長度變化不大（23701～25036 bp），表明藜科植物葉綠體基因組結構相對保守；但藜科中一些物種在IR-LSC邊界處yc1和rps19基因的缺失和不同程度的擴張，這導致了藜科物種葉綠體基因組中IR區長度大小的差異。無葉假木賊葉綠體基因組的平均GC含量為36.25%，這可能與該基因組偏好使用NU結尾的密碼子有關。無葉假木賊葉綠體基因組中共注釋到132個基因，這和蔣禮玲等報道的4種藜屬物種的葉綠體基因組編碼基因相比，少1個蛋白編碼基因，多4個假基因，這可能與假木賊屬中物種進化較緩慢有關；同時，在胡桃科（Juglandaceae）核桃屬（Carya）和薔薇科（Rosaceae）梨屬（Pyrus）的葉綠體基因組的相關研究中也得到相似的結果，表明藜科中不同物種間葉綠體基因組基因數量存在差異屬于正常現象；此外，筆者還推測這與不同研究中的測序平臺和注釋結果的差異有關。

分布在植物葉綠體基因組上的重復序列和多態性變異位點，目前已廣泛應用于多個物種的遺傳多樣性和系統關系的研究。本研究在無葉假木賊葉綠體基因組中鑒定到12種類型，共71個SSR位點，其中，單堿基重復（A/T）、二堿基重復（AT/TA）、三堿基重復（TAA/TTA）和一些多堿基重復（AAAT、TAAT、TTAT、TAAAA、TTA、TTATT、TTTTA）均為多聚A或多聚T，占所有SSR位點的83，33%，這是假木賊葉綠體基因組中AT含量高的一個重要因素。在真核生物中，大多數SSR分布在非編碼序列，無葉假木賊葉綠體基因組中SSR主要位于基因間區（70.4%），這可能與該物種的葉綠體基因組在遺傳進化中較保守有關。此外，本研究中，LSC和SSC區的核苷酸多態性顯著高于IR區，這和蔣禮玲等在藜屬植物葉綠體基因組的研究結果一致。trnS-trnG（exon1）、ndh F-rpl32、rpl32-trnL、rps16（exon1）-trnQ和ycf1是無葉假木賊葉綠體基因組中的高核苷酸多態性區域，這些序列為該科的屬間分子鑒定奠定了基礎。

植物葉綠體全基因組序列較單個或多個編碼序列包含更豐富的信息，基于其構建的系統發育樹結果更加準確。高鳴澤通過對藜科41個物種的蛋白編碼基因構建系統發育樹，將鹽角草屬、堿蓬屬、梭梭屬聚成一類，表明其親緣關系較近。本研究得到了相似的結論，同時，本研究結果進一步表明，假木賊屬和梭梭屬、豬毛菜屬有較高的親緣關系，這和前人基于形態學特征將假木賊屬、梭梭屬、豬毛菜屬歸為豬毛菜族（Salsoleae）的研究結果一致。本研究是首次對藜科中假木賊屬物種進行葉綠體基因組測序，明確了假木賊屬在藜科中系統發育的位置，但要充分明確藜科物種的系統發育關系，需要更多藜科物種全基因組被測序。

密碼子偏好性在植物葉綠體基因組中蛋白質編碼基因的過程中發揮重要作用，這與突變、自然選擇和隨機遺傳漂變等分子進化現象密切相關。本研究中，ENC-plot、ENC分布直方圖、PR2-plot和中性繪圖分析的綜合結果表明，無葉假木賊葉綠體基因組密碼子使用偏好性主要受自然選擇影響，突變等影響因素對其影響較弱，這可能與荒漠植物在遺傳進化過程中的特殊生存環境有關。前人研究表明，密碼子第三個堿基的GC含量在基因組結構進化過程中也起著重要作用。本研究中，在RSCU值大于1的30個密碼子中，除編碼亮氨酸的UUG以G結尾外，其它29種密碼子均以A/U結尾。當RSCU值<1時，多以G/C結尾。這表明，以A/U結尾的同義密碼子更多地參與無葉假木賊葉綠體基因組的蛋白質編碼基因的過程，這與前人在雙子葉植物中密碼子使用偏好性的研究一致。此外，本研究在無葉假木賊葉綠體基因組中確定了20個最優密碼子，均以NU結尾，這為無葉假木賊中外源基因密碼子的優化提供了理論依據。

4結論

無葉假木賊葉綠體基因組全長為154 084 bp，包括1個LSC區（85 124 bp）、1個SSC區（18 934 bp）、1對IR區（IRa和IRb，25 013 bp），呈典型的四分體結構。12種類型共71個SSR位點在無葉假木賊葉綠體基因組中被鑒定；trnS.trn G（exon1）、ndh F-rpl32、rpl32-trnL、rps16（exon1）-trnQ和yc1是無葉假木賊葉及其9種近緣種葉綠體基因組中的高核苷酸多態性區域；這些信息為無葉假木賊今后的分子標記開發提供了科學的依據。系統發育分析中，20個藜科物種被歸為4個聚類組，其中，無葉假木賊與梭梭屬和豬毛菜屬的物種親緣關系最近；在無葉假木賊葉綠體基因組中確定20個最優密碼子，均以A/U結尾；其密碼子使用偏好性主要受自然選擇影響，突變等影響因素對其影響較弱；研究結果可為無葉假木賊的系統進化及葉綠體基因工程研究提供參考。