美廉凈凝膠對宮頸炎的藥效學探究

王雨佳 王夢如＃ 趙健鋌金凡茂沈詠梅 劉 衡何 苗?李 玥?

（1.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發利用協同創新中心，云南大理 671000；2.藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，四川成都 610000）

宮頸炎是女性生殖器官炎癥中最常見且發病率較高的一種炎癥反應，此炎癥與創傷、細菌、病毒等感染密切相關。臨床主要表現為陰道分泌物增多、宮頸出血、水腫等［1］。通常采用陰道局部給藥，使藥物通過陰道黏膜吸收進入局部組織或全身血液循環達到治療目的［2］。凝膠劑是臨床常用的陰道給藥劑型，與人體組織有較好的生物相容性，對藥物具有緩、控釋作用，使局部病灶部位的有效濃度增加，提高了生物利用度，增強藥物療效［3］。美洲大蠊Periplaneta americana L.俗稱蟑螂，屬蜚蠊目、蜚蠊科、大蠊屬昆蟲，其入藥始載于《神農本草經》，有散瘀、解毒、消腫、利水等功能［4］。研究發現，美洲大蠊提取物具有抗菌、抗病毒、抗炎鎮痛、促組織修復等多方面藥理作用［5-6］。本實驗從美洲大蠊醇提取物中純化精制了抗炎活性部位［7］，制成美廉凈凝膠。建立苯酚致大鼠宮頸炎模型并使用美廉凈凝膠治療，通過大鼠血清生化因子及宮頸組織病變評價其對宮頸炎的治療作用，以期為宮頸炎的臨床治療提供新選擇。

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠，雌性未孕，體質量220～240 g，昆明醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（滇）2011-0004，飼養于大理大學實驗動物中心清潔級動物房。

1.2 藥物與試劑 美洲大蠊浸膏（大理大學昆蟲生物醫藥研究院張成桂副教授提供，批號1161-723-GZG，按照中國發明專利CN1943600“含有美洲大蠊及其乙醇提取物的藥物組合物及新用途”方法制備）；苯酚（西隴化工股份有限公司，批號CAS108-95-2）；羧甲基纖維鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號F20110509）；丙三醇（天津市福晨化學試劑廠，批號20130107）；異氟烷（山東科源制藥有限公司，批號131101）；水合氯醛（天津市光復精細化工研究所，批號20120619）；無水乙醇（天津市瑞金特化學品有限公司，批號20130124）；冰醋酸（天津市瑞金特化學品有限公司，批號20130104）；復方地塞米松凝膠（廈門金日制藥有限公司，批號130603）；椿乳凝膠（株洲千金藥業股份有限公司，批號20130113）；泊洛沙姆P407（德國BASF SE 公司，批號WPEH540B）；泊洛沙姆P188（德國BASF SE 公司，批號WPYH570B）；銅藍蛋白試劑盒（CP，批號20130125）、總超氧歧化酶試劑盒（T-SOD，批號20130202）、丙二醛試劑盒（MDA，批號20130110）均購于南京建成生物科技有限公司。

1.3 儀器 METTLERAE240 精密電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；RB-200 智能熱板儀（成都泰盟科技有限公司）；2010 型酶標儀（奧地利安圖斯公司）；ES-1450 型高壓滅菌鍋（日本Tomy Kogyo 公司）；TL-16R 臺式高速冷凍離心機（上海市離心機械所）；APS-300S 型自動脫水機（德國Leica 公司）；BM-VIII 型生物組織包埋機、冷凍臺（孝感市宏業醫用儀器有限公司）；RM2245 型手動切片機（德國Leica 公司）；YT-7FB 型生物組織攤烤片機（湖北省孝感市亞光醫用電子科技有限公司）；BI-2000 型醫學圖像分析系統（成都泰盟科技有限公司）。

1.4 受試藥物配制 空白凝膠，稱取適量的泊洛沙姆P407、P188 固體，加足量水溶脹24 h，加適量乙醇、甘油，攪拌，混勻，于4 ℃靜置24 h，密封，備用。美廉凈凝膠，按上述方法制備空白凝膠，加入美洲大蠊浸膏，制備成美廉凈高（150 mg／mL）、中（100 mg／mL）、低（50 mg／mL）凝膠，密封，備用。

1.5 造模試劑（20%苯酚膠漿制備）量取50 ℃液態苯酚4 mL、1 g 羧甲基纖維鈉，6 mL 甘油在50 ℃的水浴中充分攪拌均勻，再加入9 mL 蒸餾水稀釋混勻，配制20%苯酚膠漿，密封4 ℃冰箱保存，實驗時放置室溫混勻使用［8-9］。

2 方法

2.1 造模 根據參考文獻［10-11］建立大鼠宮頸炎模型。從80 只雌性未孕SD 大鼠中隨機挑選10 只作為正常對照組，其余70 只用于造模。異氟烷將大鼠進行麻醉，用帶有灌胃鈍性針頭的一次性注射劑器將20%的苯酚膠漿緩慢注入大鼠宮頸穹隆部腔內，0.1 mL／只，后將大鼠頭低尾高體位傾斜放置5 min，每3 d 按上述方法操作1 次，連續3 次，造模時間共12 d。

2.2 分組及給藥 造模結束后第3 天，參考《中藥藥理研究方法學》［12］中“中藥陰道用制劑毒性試驗方法”的炎癥程度進行評分（表1），根據紅斑、水腫、分泌物的總分進行療效統計學分析，并以總分0～3 分為無炎癥、4～6 分為輕度炎癥、7～9 分為中度炎癥、10～12 分為重度炎癥。分組時將無炎癥大鼠剔除，剩余大鼠按炎癥嚴重程度分層隨機分為凝膠組、模型對照組、復方地塞米松凝膠組（1.5 mg／kg）、椿乳凝膠組（1.0 g／kg）、美廉凈凝膠高（75 mg／kg）、中（50 mg／kg）、低（25 mg／kg）劑量組，每組10 只。分組后第1 天開始陰道內給藥，每天給藥2 次，正常對照組和模型對照組按上述給藥方式給予相應的生理鹽水，連續給藥10 d。

2.3 取樣及指標檢測 在給藥治療期間，觀察大鼠的一般癥狀，包括形態外觀、行為活動、飲食、飲水及自主活動功能等有無異常；觀察大鼠陰道及宮頸口紅斑、水腫及分泌物，并給予評分，評分標準見表1。末次給藥后，禁食不禁水12 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，冰水浴放置4～6 h，4 ℃、3 500 r／min、離心10 min，取上層血清適量，按照CP、MDA、T-SOD 試劑盒說明書，依次加入試劑，37 ℃孵育顯色，加入終止液，酶標儀測定OD 值；取大鼠肝臟、腎臟和宮頸組織，于生理鹽水中浸洗2～3次，濾紙吸干水分，稱定質量，臟器指數＝相應臟器質量（mg）／大鼠處死前體質量（kg）×100%；完整分離各組大鼠宮頸組織，經10%的福爾馬林固定、梯度脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精／伊紅染色、封片，顯微鏡下觀察宮頸組織的病理變化。

表1 外陰炎癥反應評分標準

2.4 統計學分析 采用統計分析軟件SPSS 17.0 進行統計學處理，數據以（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊，組間兩兩比較采用LSD 法，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 美廉凈凝膠對宮頸炎大鼠一般狀態的影響 造模期間，與正常對照組比較，各造模組大鼠飲食量減少，喜扎堆、豎毛、易怒，外陰及宮頸口可見明顯的紅腫，并伴有大量黃色或白色甚至血絲的黏性分泌物。經藥物治療后，與模型對照組比較，各給藥組大鼠上述癥狀均得到不同程度的改善。其中美廉凈凝膠高劑量組藥效最佳。

3.2 美廉凈凝膠對宮頸炎大鼠外陰炎癥程度的影響 給藥前，模型組各組間外陰炎癥評分無差異。與正常對照組比較，模型對照組外陰炎癥評分升高（P＜0.01）；在給藥第10 天，與模型對照組比較，復方地塞米松凝膠組、椿乳凝膠組及受試藥各劑量組外陰炎癥評分降低（P＜0.01），凝膠組差異無統計學意義（P＞0.05）；與凝膠組比較，各給藥組外陰炎癥評分降低（P＜0.01）。綜上，本模型造模成功，且空白凝膠對模型不會產生顯著影響。見表2。

表2 美廉凈凝膠對苯酚致宮頸炎大鼠外陰炎癥的影響（，n＝10）

表2 美廉凈凝膠對苯酚致宮頸炎大鼠外陰炎癥的影響（，n＝10）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與模型對照組比較，??P＜0.01；與空白凝膠組比較，▲▲P＜0.01。椿乳凝膠組給藥劑量為凝膠質量計算。

3.3 美廉凈凝膠對宮頸炎大鼠臟器指數的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠腎臟指數、宮頸指數升高（P＜0.01）；與模型組對照組比較，美廉凈凝膠各劑量組腎臟指數、宮頸指數均有下降趨勢，肝臟指數差異無統計學意義（P＞0.05）；與凝膠組比較，復方地塞米松凝膠組、美廉凈凝膠高劑量組宮頸指數不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 美廉凈溫度敏感型凝膠對苯酚致宮頸炎大鼠臟器指數的影響（，n＝10）

表3 美廉凈溫度敏感型凝膠對苯酚致宮頸炎大鼠臟器指數的影響（，n＝10）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與模型對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與空白凝膠組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.4 美廉凈凝膠對宮頸炎大鼠血清CP、MDA、T-SOD 水平的影響 與正常對照組比較，模型對照組CP、MDA、T-SOD表達升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，各給藥組CP、MDA、T-SOD 表達均有不同程度的降低，其中MDA、T-SOD 表達降低（P＜0.05，P＜0.01）；與凝膠組比較，復方地賽松凝膠組CP、T-SOD 表達降低（P＜0.01），美廉凝膠高劑量組CP、MDA 表達水平有不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01），見表4。

表4 美廉凈溫度敏感型凝膠對苯酚致宮頸炎大鼠血清CP、MDA、T-SOD 水平的影響（，n＝10）

表4 美廉凈溫度敏感型凝膠對苯酚致宮頸炎大鼠血清CP、MDA、T-SOD 水平的影響（，n＝10）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與模型對照組比較，??P＜0.01；與空白凝膠組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.5 美廉凈凝膠對宮頸炎大鼠宮頸組織病理學的影響 正常對照組宮頸及陰道壁組織結構正常各層清晰可見，未見鱗狀上皮增生和破損，未見柱狀上皮鱗狀化，鱗柱移行處結構正常，宮頸黏膜下及陰道壁黏膜組織內有少許淋巴細胞和中性粒細胞分散浸潤；模型對照組和空白凝膠組可見宮頸黏膜鱗狀上皮增生，陰道壁淺表有潰瘍形成，組織中有大量中心粒細胞和淋巴細胞浸潤，可見血管充血及組織細胞狀態異常；復方地塞米松凝膠組和美廉凈凝膠高、中劑量可見宮頸黏膜各層組織結構清晰，宮頸黏膜下層及陰道壁黏膜組織中有少量的中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，其中復方地塞米松凝膠組趨于正常黏膜下白細胞數明顯少于高、中劑量組；椿乳凝膠組和美廉凈凝膠低劑量組可見宮頸黏膜有上皮增生的現象，黏膜下有較多量的中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，組織及血管有異常。見圖1。

圖1 各組大鼠宮頸組織病理切片圖（HE，×400）

4 討論

本實驗采用經典苯酚膠漿化學灼傷致宮頸炎模型，造模后，各造模大鼠主要一般表現為陰道紅腫、分泌物增多，與臨床宮頸炎患者相似［13］。經美廉凈凝膠各劑量組治療后，模型大鼠的紅腫減輕、分泌物也有減少的跡象，顯示實驗藥物對宮頸炎大鼠有一定的治療作用。

雖然由于高分子輔料組成的空白凝膠有一定的促進組織修復及抑制炎癥的作用，但藥物治療組與凝膠組比較存在顯著性差異，證實了美蠊浸膏在治療宮頸炎過程中發揮了主要作用。

當機體發生炎癥和組織壞死時，血清中作為炎癥反應指標之一的CP 活力會增強［14］，同時體內的超氧自由基會增多，產生的MDA 升高，使SOD 活力降低［15］，故檢測血清中的CP、T-SOD 及MDA 對評價炎癥的程度有重要意義。本研究中，CP、MDA 表達量降低，T-SOD 表達量升高。提示美廉凈凝膠可能降低炎性因子的表達，調節氧自由基含有量，進而起到治療宮頸炎的作用。

基于以上研究，可見美廉凈凝膠在一定程度上有減輕炎性癥狀的作用，但是主要是針對輕、中度的宮頸炎模型進行研究，而且宮頸炎并不是單一因素引起的炎癥，可能還有很多微生物參與炎癥的發展。后期，課題組將進一步研究美廉凈凝膠對不同致病機理的大鼠宮頸炎的治療作用，考察美廉凈抗宮頸炎的藥效學機制。