中國藥典和歐洲藥典鹽酸萬古霉素有關(guān)物質(zhì)檢測方法的比較研究

趙燕 金楊巧 李澤南徐慧娟 易芬芬

摘要：目的 比較并討論《中國藥典》和《歐洲藥典》中鹽酸萬古霉素有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，為完善鹽酸萬古霉素及注射用鹽酸萬古霉素有關(guān)物質(zhì)的檢測方法提供科學(xué)依據(jù)。方法 采用《中國藥典》2020年版（ChP2020）和《歐洲藥典》10.0版（EP10.0）有關(guān)物質(zhì)方法，分別對系統(tǒng)適用性試驗(yàn)、空白輔料干擾試驗(yàn)、強(qiáng)制降解試驗(yàn)和樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測，對色譜行為、已知雜質(zhì)、有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果和雜質(zhì)控制策略等進(jìn)行比較。結(jié)果 兩種藥典方法中色譜條件、系統(tǒng)適應(yīng)用性要求和雜質(zhì)控制策略存在較大差異。EP方法對特定雜質(zhì)的分離效能優(yōu)于ChP，且樣品中檢測出的雜質(zhì)數(shù)量大于或等于ChP，但兩種藥典方法檢測得到的總雜質(zhì)含量結(jié)果無明顯差異。結(jié)論 建議測定鹽酸萬古霉素及注射用鹽酸萬古霉素有關(guān)物質(zhì)時(shí)推廣使用EP10.0中的有關(guān)物質(zhì)檢測方法。

關(guān)鍵詞：中國藥典；歐洲藥典；鹽酸萬古霉素；注射用鹽酸萬古霉素；有關(guān)物質(zhì)

中圖分類號(hào)：R978.1 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ? 文章編號(hào)：1001-8751（2023）04-0281-09

Comparative Study on Determination Methods of Vancomycin Hydrochloride Chinese Pharmacopoeia and European Pharmacopeia

Zhao Yan1， Jin Yang-qiao1， Li Ze-nan1， Xu Hui-juan2， Yi Fen-fen2

（1 Hai Zheng Pharmaceutical Co.， LTD， ? Hangzhou ?311400; 2 Hanhui Pharmaceuticals Co.，Ltd.， ? ?Hangzhou ?310016）

Abstract：Objective To compare and discuss the determination methods of vancomycin hydrochloride related substances in Chinese Pharmacopoeia （ChP） and European Pharmacopeial （EP）， so as to provide the scientific basis for the determination of related substances in vancomycin hydrochloride and vancomycin hydrochloride for injection. Methods The vancomycin hydrochloride related substances were determined by adopting the methods of related substances quality standard contained in ChP2020 and EP10.0. The system suitability， blank excipient interference test， forced degradation and samples were tested. Comparisons were made between the chromatographic behavior， known impurities， associated compounds determination results， and impurity control technique. Results The chromatographic conditions， system applicability requirements and impurity control strategy of two methods have a large difference. The EP approach was more effective than ChP at separating particular impurities， and the levels of impurities found in the samples were greater than or on par with those found in ChP. However， there was no significant difference in the total contents of impurity between the two pharmacopoeia methods. Conclusion It is suggested that EP10.0 should be widely used in the determination of vancomycin hydrochloride and vancomycin hydrochloride for injection.

Key words：ChP; ? EP; ? vancomycin hydrochloride; ? vancomycin hydrochloride for injection; ? related substances

萬古霉素（VaIlcomycin）是東方鏈霉菌（Streptomyces orientalis）產(chǎn)生的一種三環(huán)糖肽類抗生素，主要用來預(yù)防和治療革蘭陽性菌所造成的感染，被視為“最后一線藥物”治療所有抗生素均無效的嚴(yán)重感染[1]。其作用機(jī)制為結(jié)合敏感細(xì)菌細(xì)胞壁前體肽聚末端的丙氨酰丙氨酸，阻斷肽聚糖合成，導(dǎo)致細(xì)胞壁缺損而殺滅細(xì)菌，并且還可通過改變細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性來選擇性地抑制RNA的合成。目前，臨床上多使用其鹽酸鹽進(jìn)行治療。

1958年，注射用鹽酸萬古霉素作為第一個(gè)（糖）肽類抗生素品種獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）許可上市使用。原研制劑注射用鹽酸萬古霉素（穩(wěn)可信）由禮來（Eli Lily）公司生產(chǎn)。鹽酸萬古霉素及其已知雜質(zhì)（A～L）結(jié)構(gòu)見圖1，其中已知雜質(zhì)M結(jié)構(gòu)未確定。本品種收載于中國藥典2020年版（ChP2020）二部[2]、《日本藥典》17版[3]、《美國藥典》43版[4]、歐洲藥典10.0（EP10.0）版[5]等國際藥典中。對比各國藥典中鹽酸萬古霉素有關(guān)物質(zhì)檢測方法，日本藥典、美國藥典以及進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20130179與中國藥典的分析方法相同，均采用普通HPLC和常規(guī)粒徑（5μm）的C18色譜柱。流動(dòng)相配制，稀釋劑，檢測波長，進(jìn)樣體積，系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，色譜柱和計(jì)算方法（自身對照法）均一致，僅在樣品濃度，體積流量以及梯度洗脫程序上存在細(xì)微差異。歐洲藥典的分析方法則與其余四個(gè)檢測方法有較大差異，采用了超高效液相色譜儀（UPLC）以及分離效果更好的小粒徑（1.7 μm）色譜柱。故本研究采用鹽酸萬古霉素有關(guān)物質(zhì)檢測方法差異較大的ChP2020和EP10.0兩種方法對其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢查，并對結(jié)果加以比較和分析，擬制定更嚴(yán)格的有關(guān)物質(zhì)分析方法。

1 儀器與材料

安捷倫高效液相色譜儀1260，安捷倫超高效液相1290，色譜柱：Thermo ODS HYPERSIL柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；Acquity C18 CSH柱（2.1 mm×150 mm， 1.7 μm）。甲醇（色譜級(jí)，Thermo Fisher Scientific），乙腈（色譜純，新藍(lán)景化學(xué)工業(yè)有限公司）， 四氫呋喃（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磷酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），三乙胺（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），鹽酸（分析純，杭州化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉（分析純，杭州蕭山化學(xué)試劑有限公司），30%過氧化氫（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），三羥甲基氨基甲烷（分析純，Sigma），純化水。

萬古霉素系統(tǒng)適應(yīng)性標(biāo)準(zhǔn)品（European Pharmacopeia（Ph.Eur.） ，批號(hào)：1.0），雜質(zhì)A（Molcan Corporation，批號(hào)：171218），雜質(zhì)B（Molcan Corporation，批號(hào)：141027），雜質(zhì)C（Molcan Corporation，批號(hào)：170906），雜質(zhì)D（Molcan Corporation，批號(hào)：170910），萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130360-201302），穩(wěn)可信[Vianexs.A.（Pliant C）希臘，批號(hào)：C940434、C822077]，自制注射用鹽酸萬古霉素三批（海正藥業(yè)杭州有限公司，批號(hào)：A、B、C），鹽酸萬古霉素原料藥二批（海正藥業(yè)杭州有限公司，批號(hào)：1.0、2.0）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及溶液配制

ChP2020和EP10.0有關(guān)物質(zhì)測定方法的色譜條件及溶液制備見表1。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)比較

ChP2020有關(guān)物質(zhì)檢查方法采用Thermo ODS HYPERSIL色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），具體方法見表1，梯度洗脫，體積流量1.0 mL/min， 進(jìn)樣量20 μL，供試品溶液質(zhì)量濃度2 mg/mL；EP10.0有關(guān)物質(zhì)檢查方法采用Acquity C18 CSH柱（2.1 mm×150 mm， 1.7 μm），具體方法見表1，梯度洗脫，體積流量0.3 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，供試品溶液質(zhì)量濃度 ? ? ? ?4 mg/mL，雜質(zhì)A對照品溶液質(zhì)量濃度0.12 mg/mL，雜質(zhì)B對照品溶液質(zhì)量濃度0.08 mg/mL，雜質(zhì)C對照品溶液質(zhì)量濃度0.04 mg/mL，雜質(zhì)D對照品溶液質(zhì)量濃度0.06 mg/mL，具體方法見表1，分別記錄不同色譜條件下供試品溶液和雜質(zhì)對照品溶液的色譜圖，比較其專屬性，結(jié)果見表3。

由于僅采購到歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)的四個(gè)已知雜質(zhì)（雜質(zhì)A～D），故本實(shí)驗(yàn)采用已購的四個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行專屬性試驗(yàn)，同時(shí)采購到歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)適用性標(biāo)準(zhǔn)品可用于EP10.0方法下特定雜質(zhì)（雜質(zhì)A～M）的定位，見圖2。結(jié)果顯示ChP2020和EP10.0兩種方法檢出的注射用鹽酸萬古霉素樣品中有關(guān)物質(zhì)均符合各自規(guī)定。但EP10.0方法雜質(zhì)分離度更好，檢出的已知雜質(zhì)更多，見圖3。

2.3 空白輔料的干擾試驗(yàn)

按照供試品濃度分別配制1倍處方量和3倍處方量的空白輔料樣品溶液。按照ChP2020及EP10.0液相條件，記錄色譜圖，見圖4，結(jié)果顯示兩種檢測方法均未檢測到輔料色譜峰。

2.4 強(qiáng)制降解試驗(yàn)比較

鹽酸萬古霉素受熱后易產(chǎn)生化學(xué)結(jié)構(gòu)分解，因此通過熱降解得到更多的雜質(zhì)，同時(shí)再進(jìn)行酸降解、堿降解和氧化降解，以考察ChP2020和EP10.0方法對其雜質(zhì)的分離效能。熱降解樣品配制：按照表1中供試品溶液濃度配制，取供試品適量，分別在105 ℃的高溫條件下暴露8 h后用稀釋劑溶解完全轉(zhuǎn)移至容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻作為熱降解樣品溶液；酸降解樣品配制：按照表1中供試品溶液濃度配制，取供試品適量，分別置容量瓶中，加入0.5 mol/L鹽酸溶液5.0 mL，在室溫下放置15 h后加0.5 mol/L氫氧化鈉溶液中和，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻作為酸降解樣品溶液；堿降解樣品配制：按照表1中供試品溶液濃度配制，取供試品適量，分別置容量瓶中，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液5.0 mL，在室溫下放置15 h后加1 mol/L鹽酸溶液中和，加稀釋劑溶解并稀釋搖勻作為堿降解樣品溶液；氧化降解樣品配制：按照表1中供試品溶液濃度配制，取供試品適量，分別置容量瓶中，加入5%雙氧水溶液5.0 mL，在室溫下放置24 h后，加稀釋劑溶解并稀釋搖勻作為氧化降解樣品溶液。分別按表1中ChP2020和EP10.0色譜條件進(jìn)行測試，記錄色譜圖。

結(jié)果顯示，經(jīng)熱降解、酸降解、堿降解的注射用鹽酸萬古霉素樣品，雜質(zhì)數(shù)量及雜質(zhì)含量均明顯增加，同時(shí)氧化降解的注射用鹽酸萬古霉素樣品與未降解樣品相比，雜質(zhì)數(shù)量和總雜質(zhì)含量均未有明顯增加，說明注射用鹽酸萬古霉素在氧化條件下較穩(wěn)定。ChP2020和EP10.0方法測得的主峰峰純度均符合要求，主峰與相鄰峰之間均達(dá)到分離要求，總雜質(zhì)含量無明顯差異。經(jīng)熱降解、酸降解、堿降解的注射用鹽酸萬古霉素樣品采用ChP2020系統(tǒng)分析，可檢測到12～14個(gè)雜質(zhì)，在6～10 min處的雜質(zhì)色譜峰相連，分離較差，雜質(zhì)C和雜質(zhì)D可被有效分離，色譜圖詳見圖5。采用EP10.0液相系統(tǒng)分析，可檢測到13～19個(gè)雜質(zhì)，各雜質(zhì)分離度較好（圖6）。兩種測定方法在酸降解條件下，雜質(zhì)D均為最大雜質(zhì)。2.5 雜質(zhì)控制限度比較

ChP2020采用自身對照法計(jì)算雜質(zhì)含量，EP10.0采用面積歸一化法計(jì)算雜質(zhì)含量，并且雜質(zhì)控制策略明顯不同，見表4。

2.6 雜質(zhì)檢測結(jié)果比較

采用ChP2020及EP10.0有關(guān)物質(zhì)檢查方法對鹽酸萬古霉素原料藥、自制制劑及部分上市制劑進(jìn)行檢測，結(jié)果見表4，為全方位比較原料藥及其制劑中的有關(guān)物質(zhì)情況，本研究采用有效期內(nèi)上市制劑穩(wěn)可信（批號(hào)：C940434）、近效期上市制劑穩(wěn)可信（批號(hào)：C822077）、冷藏儲(chǔ)存原料藥（批號(hào)：1.0、2.0），以及在40 ℃±2 ℃/75%RH±5%RH條件下放置6個(gè)月的自制制劑（A、B、C）。

對樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果進(jìn)行比較，EP10.0方法測得的雜質(zhì)個(gè)數(shù)大于或等于ChP2020，兩種方法測定的七批樣品雜質(zhì)總量平均值見表5，可見兩種方法測得的結(jié)果相當(dāng)。

3 討論

3.1 系統(tǒng)適用性不同

ChP2020系統(tǒng)適用性要求兩個(gè)主峰間分離度大于5.0，并不能對已知雜質(zhì)進(jìn)行定位，也未對分離度作更具體的要求。而EP10.0系統(tǒng)適用性規(guī)定雜質(zhì)G與雜質(zhì)H的分離度在1.5～4.0之間，雜質(zhì)B與雜質(zhì)L之間分離度在1.5～5.0之間。

3.2 分離效能不同

系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)中，EP10.0方法可以有效分離各特定已知雜質(zhì)，根據(jù)破壞試驗(yàn)雜質(zhì)來源推測雜質(zhì)A（穩(wěn)可信中最大單個(gè)雜質(zhì)）及雜質(zhì)F為工藝來源，雜質(zhì)G（自制產(chǎn)品中最大單個(gè)雜質(zhì)）、雜質(zhì)J及雜質(zhì)D為降解產(chǎn)物。ChP2020有關(guān)物質(zhì)測定方法可以有效分離降解雜質(zhì)雜質(zhì)C和雜質(zhì)D，但不能很好的分離6～10 min處的雜質(zhì)，色譜峰相連或合并，對其余降解雜質(zhì)、工藝雜質(zhì)亦不能有效分離，由此說明EP10.0方法的分離效能優(yōu)于ChP2020。

3.3 雜質(zhì)控制策略不同

ChP2020標(biāo)準(zhǔn)僅對單個(gè)雜質(zhì)和總雜質(zhì)進(jìn)行控制，而EP10.0標(biāo)準(zhǔn)對特定雜質(zhì)，主峰前后未知雜質(zhì)和總雜質(zhì)均進(jìn)行了嚴(yán)格控制，更有利于鹽酸萬古霉素的質(zhì)量控制。

3.4 樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果不同

2批原料藥，5批制劑檢測結(jié)果均顯示EP10.0方法檢測得到的雜質(zhì)個(gè)數(shù)大于或等于ChP2020，ChP2020方法檢測到最大單雜為1.20%～1.70%，均大于相應(yīng)批次的EP10.0方法，提示ChP方法最大單雜為多個(gè)未知雜質(zhì)共洗脫，但兩種方法測定的總雜質(zhì)含量相當(dāng)，差值均小于0.20%，說明兩種方法在總雜測定方面等效。同時(shí)兩種方法檢測兩批原料藥以及穩(wěn)可信（批號(hào)：C940434）雜質(zhì)個(gè)數(shù)相同，但EP方法檢測的近效期穩(wěn)可信以及加速放置六個(gè)月的自研三批制劑雜質(zhì)個(gè)數(shù)均多于ChP2020方法，提示成品放置時(shí)間越長，放置條件越劇烈（溫度越高，濕度越大），EP檢測方法可檢測到的雜質(zhì)個(gè)數(shù)越多。

4 結(jié)語

目前，對鹽酸萬古霉素有關(guān)物質(zhì)研究報(bào)道的文獻(xiàn)并不是很多[6-8]，更缺少對各國藥典方法對比的相關(guān)文獻(xiàn)。本文采用ChP2020和EP10.0收載的注射用鹽酸萬古霉素和鹽酸萬古霉素有關(guān)物質(zhì)分析方法，分別對系統(tǒng)適用性、專屬性、強(qiáng)制降解試驗(yàn)和樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測，對色譜行為、已知雜質(zhì)、有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果和雜質(zhì)控制策略等進(jìn)行比較。ChP2020和EP10.0色譜條件中儀器、色譜柱、流動(dòng)相組成、梯度洗脫程序、流速、柱溫和進(jìn)樣量均不相同，且系統(tǒng)適用性要求存在較大差異。ChP2020系統(tǒng)中6～10min雜質(zhì)出現(xiàn)共洗脫，而EP10.0系統(tǒng)中各特定雜質(zhì)均能達(dá)到有效分離，分離效能優(yōu)于ChP2020。強(qiáng)制降解試驗(yàn)表明ChP2020和EP10.0方法對降解雜質(zhì)C和雜質(zhì)D分離效能無明顯差異。兩種藥典方法雜質(zhì)控制策略不同，EP10.0在控制單雜和總雜的基礎(chǔ)上，增加了對特定雜質(zhì)的控制，EP10.0系統(tǒng)測得樣品中的雜質(zhì)數(shù)量大于或等于ChP2020，測得的總雜含量無明顯差異。但EP10.0方法使用的超高效液相和色譜柱在成本上高于ChP2020方法。

綜上研究結(jié)果，為更好的控制注射用鹽酸萬古霉素有關(guān)物質(zhì)，建議采用EP10.0進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測。

參 考 文 獻(xiàn)

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