頭孢雷特中主要降解產物的結構解析

宋艷霞 胡小愛 陳啟立 馬曉黎 何鋼 李直

收稿日期：2023-03-09

基金項目：天然產物化學與小分子催化四川省高校重點實驗室開放課題（TRCWYXFZCH2022B01，TRCWYXFZCH2022B02）；

四川省藥物制劑及裝備工程技術研究中心開放課題基金（ERCPEF21-04）；

成都大學人才培養質量和教學改革項目（cdjgb2022156）。

作者簡介：宋艷霞，助理研究員，主要從事藥物分析研究工作。

*通訊作者：李直，助理研究員，主要從事藥物分析研究工作。

摘要：目的 對頭孢雷特中的主要降解產物進行結構解析。方法 采用液質聯用技術對2個主要降解產物進行質譜分析，初步確認結構后通過TLC法、制備液相色譜法、化學合成等方法得到頭孢雷特中2個未知降解產物單體，并進一步利用核磁共振（NMR）技術、質譜（MS）等進行結構確證。結果 2個主要降解產物分別為5-巰基-1H-四氮唑乙酸和（6R，7R）-7-[[（鄰氨甲基苯）乙酰]氨基]-3-羥甲基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環[4，2，0]-辛-2-烯-2-甲酸。結論 本研究為頭孢雷特工藝生產和貯存條件的選擇提供了科學依據。

關鍵詞：頭孢雷特；降解產物；結構解析； LC-MS；NMR

中圖分類號：R978.1+1? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-8751（2023）06-0430-04

Structural Analysis of the Main Degradation Products of Ceforanide

Song Yan-xia1，? ?Hu Xiao-ai2，? ?Chen Qi-li3，? ?Ma Xiao-li1，? ?He Gang1，? ?Li Zhi1

（1 Sichuan Industria Institute of Antibiotics，Chengdu University，? ?Chengdu? ?610106;

2 Gansu Jingning County Hospital of Traditional Chinese medicine，? ?Jingning? ?743400;

3 China Medical University，? ?Shenyang? ?110122）

Abstract： Objective To identify the major degradation products of ceforanide. Methods LC-MS was adopted to preliminarily analyze the structure of two major degradation products， two unknown degradation products of ceforanide were obtained by TLC， preparative liquid chromatography and chemical synthesis， and their structures were further identified by NMR and MS. Results The two main degradation products were 5-mercapto-1H- tetarzole acetic acid and （6R，7R）-7-[[（ortho amino methyl benzene） acetyl] amino]-3-hydroxymethyl-8-oxo-5- dithia-1-azabicyclo [4，2，0]-symplectic-2-ene-2-acid. Conclusion This study provides a scientific basis for the production and storage conditions of ceforanide.

Key words： ceforanide;? ?degradation product;? ?structure analysis;? ?liquid chromatography-mass spectrometry; nuclear magnetic resonance

頭孢雷特（Ceforanide）是一種非腸道吸收的，由7-ACA經C7-和C3-位結構改造而得到的廣譜抗生素，屬于第二代頭孢菌素類藥物，主要用于革蘭陰性菌和部分革蘭陽性菌所引起的感染治療。于1984年由美國百時美（Bristol）公司研發成功并上市。頭孢雷特的化學結構式如圖1所示。為了更好地控制頭孢雷特原料藥的質量，本文更深入地對頭孢雷特的降解雜質進行研究。首先利用快速、簡便的高效液相色譜法對頭孢雷特強制降解試驗中的雜質進行分離，然后利用薄層色譜法（TLC）、制備液相色譜法、化學合成等方法得到頭孢雷特中2個未知雜質單體，最后采用核磁共振（NMR）和質譜（MS）等進行結構確認，解析出了未知雜質的結構，為頭孢雷特原料的雜質控制提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD（SHIMADZU）高效液相色譜儀；LC-8A（SHIMADZU）制備液相色譜儀；Spectrum One 紅外光譜儀；Agilent1100液質聯用儀；Brucker DRX-500MHz型核磁共振儀；MettlerAE163 電子天平。

1.2 藥品與試劑

頭孢雷特原料（四川抗菌素工業研究所提供，批號：150614）；乙腈為色譜純；水為去離子水；甲酸銨、甲酸均為分析純。

2 方法與結果

2.1 頭孢雷特降解產物液相色譜分離方法

2.1.1 液相色譜條件

采用phenomenex Luna 5 μ C18（2）（ 200×4.60 mm）色譜柱；以0.02 moL/L甲酸銨水溶液（用甲酸調節pH為 2.50）—乙腈（88：12）為流動相；檢測波長為254 nm；流速1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為 20 μL。

2.1.2 降解試驗的方法與結果

取本品（150614批）約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加1%的碳酸氫鈉溶液1.0 mL溶解后，用流動相稀釋制成每1 mL中含0.5 mg的溶液，搖勻，作為供試品溶液；取本品約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，分別進行如下降解試驗：（1）堿降解：用1%的碳酸氫鈉溶液溶解后，加入0.1 moL/L 氫氧化鈉溶液0.3 mL，室溫降解1 h，用0.1 moL/L鹽酸溶液0.3 mL中和；（2）酸降解：用1%的碳酸氫鈉溶液溶解后，加入0.1 moL/L鹽酸溶液0.3 mL，室溫降解1 h，用0.1 moL/L 氫氧化鈉溶液中和；（3）熱降解：在120℃降解2 h后，用1%的碳酸氫鈉溶液溶解；（4）氧化降解：加1%的碳酸氫鈉溶液1.0 mL溶解后，再加入30%的雙氧水0.1 mL，室溫放置30 min；（5）光降解：在照度為4500LX的強光下照射5 d，加1%的碳酸氫鈉溶液1.0 mL溶解；（6）未降解：用1%的碳酸氫鈉溶液1.0 mL溶解。將上述各樣品分別加流動相稀釋成每1 mL含0.5 mg的供試液。取以上降解試驗樣品溶液及未降解樣品溶液，按上述液相色譜條件對頭孢雷特進行色譜分析，得堿、酸、熱、氧化、光照降解溶液色譜圖及未降解溶液色譜圖，圖2為未降解溶液色譜圖，圖3為重疊色譜圖。

試驗結果表明，扣除溶劑峰后，頭孢雷特的主要降解產物有2個，按液相色譜相對保留時間（RT）先后順序將降解產物命名為雜質Ⅰ（2.9 min，RT=0.42～0.52）、雜質Ⅱ（4.3 min，RT=0.60～0.66）。頭孢雷特對光較穩定，對堿、酸、熱、氧化不穩定。在堿、酸、熱條件下，RT為0.42～0.52（雜質Ⅰ）及0.60～0.66（雜質Ⅱ）的雜質顯著增加，RT為0.91及1.20的雜質略有增加；在氧化條件下RT為0.60～0.66（雜質Ⅱ）的雜質稍有增加。

2.2 液質聯用分析

2.2.1 色譜條件

采用色譜柱Agilent ZOBAX SB-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm） ；以水（用甲酸調節pH2.5）—乙腈（88：12）為流動相；檢測波長為254 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為 20 μL。

2.2.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI），掃描方式為正負離子掃描，掃描范圍m/z70-1000，毛細管電壓為4.5 KV，干燥氣流速6.0 L/min，干燥氣溫度為220 ℃。

2.2.3 結果解析

取高溫降解樣品溶液利用上述條件對雜質Ⅰ和雜質Ⅱ進行液質聯用分析，測得雜質Ⅰm/z為158.9，推測為5-巰基-1H-四氮唑乙酸；測得雜質Ⅱm/z為378.0，推測為（6R，7R）-7-[[（鄰氨甲基苯）乙酰]氨基]- 3-羥甲基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環[4，2，0]-辛-2-烯-2-甲酸。雜質Ⅱ液質聯用的HPLC色譜圖見圖4，質譜圖見圖5。

2.3 雜質的制備及結構解析

2.3.1 雜質Ⅰ的制備及NMR、MS分析

將頭孢雷特樣品置高溫條件下加熱15 min后，用1%碳酸氫鈉溶液溶解稀釋，將溶液點樣于制備用薄層板上，陰涼處揮干后，置層析缸中展開，展開劑為二氯甲烷：甲醇：冰乙酸=75：25：0.5，于254 nm紫外燈下顯色，刮板將所需色帶的硅膠粉研細，用甲醇洗脫，洗脫液于低溫旋干即得雜質Ⅰ樣品。將得到的雜質Ⅰ樣品分別進行了NMR和MS分析，得到如下結果。

（1）NMR分析：將雜質Ⅰ用二甲基亞砜（DMSO）溶解，加入少量四甲基硅（TMS）作內標，在25℃條件下，采用600MHz核磁共振波譜儀進行核磁共振測試。雜質Ⅰ的δ1H-NMR（500Hz，DMSO）[1-2]：5.13（1H，s，7-COOH），4.16（1H，dd，5-SH），1.18（2H，t，6-CH2），δ13C-NMR（500Hz，DMSO）：167.2（C-7），165.0（C-5），47.4（C-6）。氫譜數據共計4個氫原子，與5-巰基四氮唑乙酸分子式C3H4N4O2S中4個氫原子相符。13C-NMR數據表明共計3個碳原子，亞甲基（-CH2-）1個，季碳原子共2個，與5-巰基-1H-四氮唑乙酸結構中1個亞甲基、2個季碳原子相符合。

（2）MS分析：質譜數據測得雜質Ⅰ的分子離子峰[M-1]+為159.0，與5-巰基-1H-四氮唑乙酸分子量m=160.0相符合。結合雜質Ⅰ1 H-NMR譜、13C-NMR譜和MS譜各項下的數據分析可知，所制備的雜質Ⅰ應為5-巰基-1H-四氮唑乙酸，結構如圖6所示。

2.3.2 雜質Ⅱ的制備及NMR、MS分析

三頸瓶中加入頭孢菌素（7-ACA） 5 g，二氯甲烷50 mL，乙酸銨10 mL，濃硫酸1滴，在45 ℃加熱回流30 min，至瓶內溶液全部透明。停止加熱，用冰冷卻，得溶液A。在另一三頸瓶中加入2-氨甲基苯乙酸鄧鹽11.0 g、二甲基甲酰胺90 mL、吡啶1.8 mL，冰浴。向三頸瓶中滴加次氯酸叔丁酯6.0 mL和二氯甲烷45 mL，再滴加三乙胺4 mL和二氯甲烷10 mL，最后滴加溶液A，在冰浴中攪拌過夜后，自然升溫至室溫，加入6%碳酸氫鈉溶液適量，加水50 mL，靜置分層，取上清液，調節pH至2.3，溶液呈渾濁狀，過濾后母液有固體析出，得固體A共1.6 g。在100 mL三頸瓶中，加入1 g固體A，冰浴冷卻至5 ℃，加入少量碳酸氫鈉、甲醇、水溶解，滴入少量20%NaOH至溶液澄清，采用制備液相色譜法分離制備得雜質Ⅱ，約100 mg，將得到的雜質Ⅱ樣品分別進行了NMR和MS分析，得到如下結果。

（1）NMR分析：雜質Ⅱ的1H-NMR[500MHz，DMSO，δ（ppm），J（Hz）][3-5]：3.76（s，2H，7γ-CH2-），3.78（s，2H，4-CH2-），4.12（t，2H，2'-CH2-），4.51（s，1H，3α-OH）5.02（d，J=18.4Hz，2H，3α-CH2-），5.06（d，J=5.1Hz，1H，6-CH-）， 5.77（dd， J=8.2，5.0Hz，1H，7-CH-），7.30（m，3H，6'、7'、8'-CH-），7.47（d，1H，5'-CH-），8.47（s，3H，1'-NH2、7α-NH-），9.55（d，J=8.2Hz，1H， 2α-OH）；13C-NMR[500MHz， DMSO，δ（ppm）]：171.58 （C-7β），166.40 （C-8），163.51 （C-2α），142.57（C-3'），134.81 （C-2），132.77 （C-4'），130.50-127.38（C-5'， C-6'、C-7'、C-8'），120.40（C-3），71.29 （C-3α），59.52 （C-7），56.91 （C-6），39.82 （C-2'），38.69 （C-7γ），22.49 （C-4）。氫譜數據顯示共計19個氫原子，與雜質Ⅱ分子式C17H19N3O5S中19個氫原子相符。13C-NMR數據表明共計16個碳原子，其中6'和7'位C的化學環境相同而重疊，故顯示為16組碳原子信號。結合雜質Ⅱ的DEPT（135°）譜解析：甲基與次甲基（-CH-、-CH3）共計5組（6個），亞甲基（-CH2-）4個，剩余的季碳共7個，與雜質Ⅱ結構符合。

（2）MS分析：質譜數據測得雜質Ⅱ的分子離子峰[M]+為377.8，與7-氨甲基苯乙酸-3-羥基頭孢烷酸分子量m=377.10相符合，與液-質聯用所測得雜質Ⅱ的m/z=378.0相符。結合雜質Ⅱ1H-NMR譜、13C-NMR譜和MS譜各單項下的數據分析可知，所制備的雜質Ⅱ應為（6R，7R）-7-[[（鄰氨甲基苯）乙酰]氨基] – 3-羥甲基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環[4，2，0] -辛-2-烯-2-甲酸，結構如圖7所示，氫譜見圖8，碳譜見圖9。

3 結論

雜質Ⅰ的結構確證中，雜質Ⅰ的質譜分別作正離子和負離子檢測，正離子檢測時，在分子區產生大量碎片離子峰，負離子檢測時僅有159.0和116.0離子峰。根據巰基四氮唑結構，分子中易失去H+產生分子離子峰。因此對于雜質Ⅰ采用負離子方式進行檢測。

綜上所述，本文制備了頭孢雷特原料降解過程中產生的主要雜質Ⅰ和雜質Ⅱ的結構，并利用核磁共振技術、質譜等進行了結構確證，為頭孢雷特的質量控制提供了科學依據。建議該產品在儲存和運輸過程中盡量避開酸、堿、高溫環境，以此來保證頭孢雷特的產品質量。

參 考 文 獻

黃滔， 金鑫， 于娜娜. 頭孢替坦二鈉一未知有關物質的結構解析[J].中國醫藥工業雜志， 2016， 47（5）：597-600.

李世文， 劉杰， 李銳. 頭孢雷特的合成與解析[J]. 山東化工， 2019， 84（18）：36-37，42.

沙沂， 張鵬， 李寧， 等. 頭孢菌素類化合物的核磁共振譜研究[J]. 波譜學雜志， 2007， 24（3）：347-352.

曾平莉， 王東， 何蘇萍. 頭孢雷特中間體2-氨基甲基苯乙酸合成研究[J]. 化學世界， 2017， 58（6）：359-362.

盧榮桂. 頭孢雷特的合成[J]. 化工中間體， 2015， 38（7）：38-39.