鹽堿水中地衣芽孢桿菌抑制銅綠微囊藻生長研究

周成夷　么宗利　來琦芳　袁春營　高鵬程　陸建學　李燕　周凱　劉一萌　孫真

摘要：基于菌藻平衡原理控制藍藻，可降低鹽堿地養殖池塘銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）對養殖生物的危害。在實驗室條件下，研究了鹽堿水中地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）對銅綠微囊藻生長的抑制效果并探索其抑藻途徑。結果顯示，在碳酸鹽堿度6.4 mmol/L、鹽度3.5、pH 8.9的鹽堿水中，地衣芽孢桿菌對初始密度為1.0×106、6.0×106、20×106 個/mL的銅綠微囊藻均有明顯抑制作用，抑制率分別達到51.8%、71.1%、65.7%；地衣芽孢桿菌無菌濾液對銅綠微囊藻生長也表現出顯著的抑制效果，其中無菌濾液加入量為實驗水體2%時的抑制效果最好，培養6 d后藻密度僅為4.5×106 個/mL，處理組葉綠素a含量較對照組降低了58.8%，與銅綠微囊藻光合作用相關的PSBA1和PSBD1基因表達下降，光合作用途徑受到抑制；鹽堿水中地衣芽孢桿菌對銅綠微囊藻具有較好的抑制效果。

關鍵詞：地衣芽孢桿菌；銅綠微囊藻；藻類抑制；無菌濾液；鹽堿水

中圖分類號：X835? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? 文章編號：1674-3075（2023）06-0136-06

我國有4 600 萬hm2鹽堿水域，遍及19個?。▍^、市），主要分布在東北、華北、西北內陸地區以及長江以北沿海地帶；因其水質類型多，水化學組成復雜，絕大部分長期以來處于荒置狀態，發展鹽堿地水產養殖，合理利用鹽堿水資源，不僅能夠拓展漁業發展空間，對于鹽堿地的生態治理也有重要意義（來琦芳等，2021）。由于鹽堿水高pH、高碳酸鹽堿度、高離子系數以及水質類型多的特點，鹽堿池塘極易暴發藍藻水華，在水產養殖過程中控制藍藻成為丞待解決的水質問題。

藻類通過光合作用為養殖水體提供充足的O2，但也會大量消耗水體中的CO2以及HCO3-，引起碳酸鹽體系失去平衡，導致水體pH升高，造成水環境惡化與水體功能下降（張小倩等，2017；Dos Santos et al，2020）。在鹽堿池塘養殖中，部分藻類會對養殖生物造成損害，如銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）、三毛金藻（Prymnesiacee）以及裸甲藻（Gymnodinium aerucyinosum）等，銅綠微囊藻是鹽堿地藍藻水華的主要來源之一（許海等，2019）。在養殖進程中，三毛金藻引起養殖魚類發病后很難治愈，因此常采用防治辦法，其中定期施用EM菌、光合細菌等是有效措施（石偉，2011）。裸甲藻屬于甲藻綱，喜高pH值、高溫，且大量繁殖后易形成紅褐色藻華，危害水生動物，在鹽堿池塘防治中，常采用定期施加微生態制劑以保持水質，或施用三氯異氰尿酸消毒，同時補充有益菌等方法（孫煒等，2018）。銅綠微囊藻暴發可產生大量毒性較強的毒素，破壞生態系統結構與平衡，造成養殖水環境pH升高，危害養殖生物（蘇發文等，2016）。水環境中一些細菌對藻類有抑制作用，這類細菌被稱作抑藻菌或溶藻菌，能夠在很大程度上改變藻類群落結構（傅麗君等，2021）。有研究表明，淡水中的短短芽孢桿菌（張小倩等，2017）、枯草芽孢桿菌（Liu et al，2019）、放線菌（李漢全等，2015）等對銅綠微囊藻有良好的抑制效果；海洋溶藻細菌DHQ25的培養上清液能夠通過抑制藻類光系統來裂解塔瑪亞歷山大藻（Zhang et al，2014）；海桿菌屬D-2對米氏凱倫藻有高效的抑制作用（杜文俊等，2021）；而關于鹽堿水中菌抑藻的研究鮮有報道。

目前，鹽堿地水產養殖缺乏有效的藍藻處理方法，其中物理方法工作量大、且維持時間較短；而化學法容易留下殘留，污染養殖水體，對養殖生物的生長不利。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是一種革蘭氏陽性兼性厭氧菌，在生長代謝中不僅能產生多種抗菌物質，同時能夠抑制病原微生物的生長并改良水質。有研究發現，在淡水環境中的地衣芽孢桿菌能夠對銅綠微囊藻的生長產生抑制效果，并控制其暴發（Liu et al，2019）。本文通過探究鹽堿水環境中地衣芽孢桿菌對銅綠微囊藻的抑制效果，以期為鹽堿地水產養殖控制藍藻暴發提供基礎數據，為鹽堿水質調控提供新途徑。

1? ?材料與方法

1.1? ?實驗材料

實驗用地衣芽孢桿菌為經鹽堿水篩選后保存的菌株，將未篩選的地衣芽孢桿菌菌粉加入到鹽堿水LB液體培養基中，30℃恒溫培養24 h，取1 mL加入到新的液體培養基中，重復篩選3次。取篩選培養后的菌液5 mL配置稀釋液，于鹽堿水LB固體培養基中涂布分離單株菌，將所得純菌株低溫保存。

銅綠微囊藻藻種來源于中國科學院淡水藻種庫（編號：FACHB-905），將所得藻種在BG-11培養基中逐步擴大培養，以滿足實驗所需。地衣芽孢桿菌采用LB培養基培養（曹禮等，2018）；銅綠微囊藻采用BG-11培養基培養（邱森森等，2018）；實驗所用培養基均采取121℃滅菌20 min。

預實驗發現地衣芽孢桿菌在鹽堿水中能正常生長，且10 h后達到指數生長期，為7.1×106 CFU/mL。為了保證實驗結果的可靠性，在預實驗階段采用7.1×106 CFU/mL的地衣芽孢桿菌進行多次重復實驗，取得較好效果，所得抑制率均大于50%。

實驗所用鹽堿水均模擬河北鹽堿水的水質組成進行配置，碳酸鹽堿度6.4 mmol/L、pH 8.9、鹽度3.5，主要離子組成見表1。

1.2? ?銅綠微囊藻培養和生長測定

1.2.1? ?微藻培養? ?將銅綠微囊藻轉接入1 L的三角燒瓶內，在恒溫光照培養箱中培養，光暗周期為12 h：12 h，光照強度2 500 lx，溫度為（25±1）℃。

1.2.2? ?回歸曲線? ?取1 mL指數生長期的銅綠微囊藻，參照馬欠等（2019）方法繪制吸光度值和藻細胞密度（0、0.3[×]105、0.68[×]105、3.2[×]105、2.4[×]106、8.2[×]106、2.2[×]107 個/mL）回歸曲線。所得回歸曲線用于計算水體中銅綠微囊藻的藻細胞密度（圖1）。

1.3? ?地衣芽孢桿菌抑藻實驗

藍藻水華時，藻細胞密度一般在10×106 個/mL（李穎等，2014），據此設置1×106、6×106、20×106 個/mL共3個藻細胞密度實驗組。在250 mL錐形瓶中加入含有不同密度銅綠微囊藻藻液的配置鹽堿水100 mL，實驗組加入地衣芽孢桿菌，濃度為7.1×106 CFU/mL，對照組不加菌。實驗設3個平行，通氣培養7 d，每隔3 d測定銅綠微囊藻吸光度，根據生長曲線計算銅綠微囊藻藻細胞密度。藻抑制率（蘇躍龍等，2014）計算如下：

IR = （1 - Nt/Mt）×100%? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?①

式中：IR為抑制率，Nt為處理組第t天藻細胞密度值，Mt為對照組第t天藻細胞密度值。

1.4? ?地衣芽孢桿菌無菌濾液抑藻實驗

1.4.1? ?濾液制備? ?將濃度7.1×106 CFU/mL地衣芽孢桿菌菌液冷凍離心（日立CF15R）10 000 r/min，4 ℃離心10 min后收集上清液，用0.22 ?m濾膜過濾后得到無菌濾液，低溫保存（Akiyama et al，2001）。

1.4.2? ?抑藻實驗? ?在250 mL錐形瓶中加入含有106 個/mL銅綠微囊藻藻液的配置鹽堿水100 mL，實驗組分別按體積比0.5%、1%、2%加入地衣芽孢桿菌無菌濾液。在恒溫光照培養箱中通氣培養7 d，每隔3 d檢測實驗組和對照組中藻細胞密度，實驗設置3個平行。

1.5? ?銅綠微囊藻葉綠素a含量測定

根據抑藻實驗結果，在實驗組中加入2%無菌濾液共培養7 d，每隔3 d測量實驗組溶液葉綠素a含量。葉綠素a提取方法采用丙酮提取-反復凍融法（李孟珂等，2019），采用分光光度法測量銅綠微囊藻中葉綠素a的含量，計算公式如下：

C = 0.0604×A632-4.5224×A649+13.2969A665-1.7453×A696? ? ? ? ?②

式中：C為葉綠素a含量，A632、A649、A665、A696分別為632、649、665、696 nm的吸光度值。

1.6? ?地衣芽孢桿菌對銅綠微囊藻光合基因表達

實驗在250 mL錐形瓶中進行。為了探究地衣芽孢桿菌無菌濾液對銅綠微囊藻中與光合作用有關的PSBA1和PSBD1基因表達的影響，將銅綠微囊藻（初始密度為106 個/mL）與地衣芽孢桿菌的無菌濾液（加入量為2%體積）進行共培養，每隔3 d進行取樣，每次取樣體積為50 mL。

1.6.1? ?總RNA提取? ?取50 mL的共培養液3 000 r/min 離心10 min，棄去上清。用TaKaRa Mini-BEST通用RNA提取試劑盒（中國大連）操作方法提取藻類RNA。

1.6.2? ?反轉錄合成cDNA? ?以銅綠微囊藻RNA為模板，根據RNA濃度測定結果，使用 PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）（TaKaRa）反轉錄試劑盒合成cDNA。

1.6.3? ?熒光定量PCR? ?采用TB Green premix Ex TaqTM（Tli RnaseH Plus）（TaKaRa） 試劑盒在CFX96 Real Time PCR Detection System（Bio-Rad） 上進行熒光定量PCR分析。每個樣品重復3次，引物序列如表2。內參基因為16S rDNA基因，采用2-△△Ct法計算基因表達相對量（Zhang et al，2020）。

1.7? ?數據分析

統計數據表示為平均值±標準差（Mean±SD）。所有數據符合正態分布并通過方差齊性檢驗。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）各組別間差異，LSD法進行多重比較，顯著性水平為P<0.05，統計分析使用SPSS 25.0軟件。

2? ?結果

2.1? ?地衣芽孢桿菌與銅綠微囊藻生長

在初始藻密度為1×106、6×106、20×106 個/mL組加入地衣芽孢桿菌，銅綠微囊藻生長均出現抑制現象，處理第6天，3個組別抑制率分別為51.8%、71.1%、65.7%（圖2）。處理第3天，3個組別抑藻率出現顯著性差異（P<0.05）。其中，6×106 個/mL密度組抑藻率最高，達到了53.2%；其次為20×106 個/mL組，抑制率為42.3%；1×106 個/mL組最低，僅34.1%。3個組別在第6天對銅綠微囊藻的生長抑制作用與第3天趨勢一致。地衣芽孢桿菌對3種密度下銅綠微囊藻的抑制率在第6天均超過50%，抑制效果顯著。

不加無菌濾液的對照組，藻細胞密度快速上升（圖3），第6天達到了2.2×107個/mL；加入無菌濾液的實驗組銅綠微囊藻生長受到顯著抑制，其中2%實驗組抑制效果最好，培養6 d后藻密度僅為4.5×106個/mL；0.5%處理組藻密度為1.13×107 個/mL，1%處理組藻密度為7.2×106 個/mL。

2.2? ?地衣芽孢桿菌與銅綠微囊藻葉綠素a含量

地衣芽孢桿菌無菌濾液對銅綠微囊藻葉綠素a含量也有顯著抑制效果（圖4）。相同培養條件下，實驗組葉綠素a含量在第3天就出現抑制效果，相比對照組顯著減少，對照組在第6天達到了1.7 mg/L（P<0.05）；而加入無菌濾液的實驗組，葉綠素含量在第6天為0.7 mg/L，僅為對照組的58.8%，表現出顯著的抑制效應（P<0.05）。

2.3? ?地衣芽孢桿菌與銅綠微囊藻光合作用基因表達

地衣芽孢桿菌無菌濾液抑制了銅綠微囊藻中光合作用相關PSBA1基因與PSBD1基因表達（圖5）。實驗組的PSBA1基因表達在第3天開始出現顯著下降（P<0.05），僅為對照組的49.5%，在第6天有所恢復，但仍顯著低于對照組（P<0.05）；實驗組的PSBD1基因表達則從第3天開始一直處于顯著下降狀態（P<0.05）。

3? ?討論

3.1? ?地衣芽孢桿菌的抑藻途徑與作用機制

抑藻菌對藻類的抑制途徑有2種，一種是通過細胞間直接攻擊抑制藻細胞；另一種是通過釋放活性物質等間接攻擊抑制藻細胞（杜青波等，2017）。本實驗范圍內，地衣芽孢桿菌抑藻途徑屬于間接抑制，其無菌濾液中含有的胞外活性物質能降低銅綠微囊藻葉綠素a含量，使PSBA1與PSBD1基因表達下降，推測其作用機制主要是通過影響光合作用中的光系統Ⅱ來抑制銅綠微囊藻生長。有研究發現，B1芽孢桿菌分泌的抑藻物質可以破壞球形棕囊藻細胞結構，損傷葉綠體，影響葉綠素a的合成（李薔，2012），這也可能是地衣芽孢桿菌無菌濾液降低葉綠素a含量的原因之一；PSBA1基因和PSBD1基因是編碼PS II反應中心的重要成分，與藻類的光合作用密切相關。Qian等（2010）研究發現，植物體中PSBA1和PSBD1基因表達下降能導致光合作用系統的電子傳遞鏈中斷，最終影響CO2固定過程；此外，賈雯等（2013）研究發現，側孢短芽孢桿菌抑藻活性物質的介入，導致銅綠微囊藻內光系統的D1蛋白被破壞，電子傳遞鏈受阻，從而抑制光合作用。微生物抑制藻類的機制，在生理水平上還包括細胞膜的損傷、脂質過氧化、影響藻體活性氧清除或光合作用相關酶的活性等（Zeng et al，2021）；在分子水平上，包括阻礙參與呼吸作用以及細胞增殖相關基因的表達（林澤宏，2020）。

3.2? ?不同環境條件下地衣芽孢桿菌的抑藻效果

本次研究發現，指數生長期的地衣芽孢桿菌對1.0×106、6.0[×]106、20[×]106 個/mL銅綠微囊藻均表現出抑制作用，抑制率分別為51.8%、71.1%、65.7%，表明在鹽堿水中地衣芽孢桿菌的抑藻效果明顯；但當藻密度達到一定范圍后，抑藻效果有一定程度降低，推測其通過釋放胞外活性物質影響銅綠微囊藻生長，進而達到抑藻效果。銅綠微囊藻是極易暴發的藍藻，當前缺乏有效防控方法。以環境友好的微生物控制池塘藻類暴發，近年來受到了廣泛關注，芽孢桿菌（許艷婷等，2018）、酵母菌（陳明華，2019）等微生物對藻類均有一定的抑制效果。淡水環境中地衣芽孢桿菌Sp34對銅綠微囊藻抑制率達39.6%～75.2%（Liu et al，2019）；枯草芽孢桿菌的抑制率在50%～60%，但在pH大于8的堿性環境下，枯草芽孢桿菌的生長受到顯著影響（程新等，2017）。以菌抑藻為鹽堿池塘防控銅綠微囊藻提供了新途徑。對比田照輝等（2021）淡水培養基中的芽孢桿菌4 h進入指數生長期，本研究耗時10 h，表明鹽堿水環境對地衣芽孢桿菌生長存在一定的影響，濃度可達到106 CFU/mL，說明地衣芽孢桿菌對鹽堿水環境有較強的耐受適應能力，今后應加強對耐鹽堿性抑藻菌株的篩選。

本實驗范圍內，與菌液對比，無菌濾液抑藻效果更為明顯，抑藻率最高可達79.5%。比較不同體積比的抑藻效果，2%在抑藻絕對量上具有優勢，而0.5%在抑藻相對量上具有優勢。因此，在養殖生產中還需要進一步確定適宜的無菌濾液濃度。

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（責任編輯? ?萬月華）

Growth Inhibition of Microcystis aeruginosa by Bacillus licheniformis

in Saline-Alkaline Water

ZHOU Cheng‐yi1，2， YAO Zong‐li2， LAI Qi‐fang2， YUAN Chun‐ying1， GAO Peng‐cheng2，

LU Jian‐xue2， LI Yan2， ZHOU Kai2， LIU Yi‐meng2， SUN Zhen2

（1. Tianjin University of Science and Technology School of Oceanography and Environment，

Tianjin? ?300457， P.R. China;

2. Key Laboratory of Aquaculture on Saline-Alkaline Land ， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

East China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Fishery Engineering

Technology Research Center for Saline-Alkaline Waters， Shanghai? ?200090， P.R. China）

Abstract：Cyanobacteria such as Microcystis aeruginosa are the primary source of algal blooms in saline-alkaline ponds and endanger aquaculture organisms. Microbe-based algae control has attracted attention because of potential effectiveness， species specificity， and eco-friendliness. Previous research has shown that Bacillus licheniformis can inhibit M. Aeruginosa growth in fresh water. In this study， the growth inhibition of M. aeruginosa by B. licheniformis and its inhibition mechanism were investigated under laboratory conditions. We aimed to provide basic data for the control of cyanobacteria blooms in saline-alkaline aquaculture and propose a feasible method for regulating the quality of saline-alkaline water. In this study， there were two groups of experiments. One group was set as follows： three treatments with initial M. aeruginosa concentrations of 1×106， 6×106， and 20×106 cells/mL， and an initial concentration of B. licheniformis of 7.1×106 CFU/mL. The second group of experiments was set as follows： three treatments with an initial M. aeruginosa concentration of 1×106 cells/mL， and cell-free filtrates of B. licheniformis solution at concentrations of 0.5%， 1% and 2%. Each treatment was run in triplicate with a control， and the experiment lasted seven days. Cell density and absorbance of M. aeruginosa in each treatment was determined every three days. Growth of M. aeruginosa was significantly inhibited by B. licheniformis in saline-alkaline water under experimental conditions： carbonate alkalinity， 6.4 mmol/L; pH， 8.9 and salinity， 3.5. The inhibition rates of M. aeruginosa at initial M. aeruginosa concentrations of 1×106 cells/mL， 6×106 cells/mL and 20×106 cells/mL were， respectively， 51.8%， 71.1% and 65.7%， with normal M. aeruginosa growth in the control. The cell-free filtrate of B. licheniformis also showed a strong inhibitory effect on the growth of M. aeruginosa， and was most pronounced at the highest concentration （2%），with the M.aeruginosa concentration of 4.5×106 cells/mL after culture for 6 d. At a filtrate concentration of 2%， the chlorophyll-a content in the experimental group was 58.8% lower than that in the control group， a significant reduction. B. licheniformis affected the expression of key M. aeruginosa genes involved in photosynthesis， such as PSBA1 and PSBD1， with significant downward regulation. In conclusion， B. licheniformis was found to inhibit M. aeruginosa photosynthesis in saline-alkaline water， consequently inhibiting growth.

Key words：Bacillus licheniformis; Microcystis aeruginosa; algae inhibition; cell-free filtrate; saline-alkaline water

收稿日期：2022-04-14? ? ? 修回日期：2023-07-03

基金項目：國家重點研究計劃（NO.2020YFD0900400）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（2021XT04，2020TD52）。

作者簡介：周成夷，1996年生，男，碩士研究生，研究方向為鹽堿地水質調控。E-mail：530495074@qq.com

通信作者：來琦芳，1970年生，女，研究員，主要從事鹽堿地水產養殖研究。E-mail：laiqf@ecsf.ac.cn