木薯少根根霉分離、鑒定及其對淀粉消化特性分析

摘要：微生物侵染木薯塊根導致病變而腐敗，通過對木薯少根根霉菌株（Ca-201613）的鑒定、優化培養，對衍生產物及其淀粉消化功能研究。結果表明：（1）菌株最適培養溫度為35.0 ℃，屬于嗜熱型真菌，而≥40.00 ℃會抑制生長；（2）添加20.0 g/L葡萄糖的培養條件下，獲得菌株最高生長量和代謝衍生物產量，而≥30.0 g/L會抑制生長；（3）添加10.0 g/L木薯淀粉，有利于促進菌株生長和代謝；（4）菌株代謝物的鑒定得到853個化合物，包括腺苷類、酸類、脂類和激素類；（5）菌株GR891和SC9塊根的衍生物中檢測出8種可溶性單糖，總糖含量為381.36 μg/mg和399.55 μg/mg，其中葡萄糖含量占87.42 %～92.30 %。木薯少根根霉是對淀粉具有糖化功能的益生菌株，為菌株“變弊為利”應用提供理論依據。

關鍵詞：少根根霉；鑒定；木薯；淀粉消化

中圖分類號：S533 文獻標志碼：A

Abstract： Microbial infection caused lesion and corruption in cassava root， and based on identification and optimized culture of Rhizopus arrizus in cassava （Ca-201613）， research on derivatives and starch digestion was carried out. The results showed that： （1）" The optimal culture temperature for R. arrhizus was 35.0 ℃， indicating it is thermophilic fungus and when temperature was ≥40.00 ℃， its growth was inhibited;（2） under the condition of 20.00 g/L glucose， the highest growth and metabolic derivatives was observed， but if glucose was ≥30.0 g/L， growth of the fungus could be" " " " " " inhibited; （3） adding 10.00 g/L cassava starch could help the strain grow and metabolize;（4） a total of 853 compounds such as adenylate， acids， lipids and hormones were identified; （5） 8 kinds of soluble monosaccharides were detected in derivatives in GR89 and SC9， with total sugar content of 381.36 μg/mg and 399.55 μg/mg respectively， of which glucose content took up 87.42 %-92.30 %. R. arrhizus in cassava was probiotic， with saccharification of starch， which can provide theoretical basis for “make weakness profitable”.

Key words： Rhizopus arrhizus; identification; cassava; starch digestion;

基金項目：廣西農業科學院科技發展基金（桂農科2021 JM122）；廣西科技計劃項目（桂科AD21238017、桂科AD1850003）。

第一作者：韋祖生（1981—），男，高級農藝師，主要從事木薯研究，E-mail：weizusheng137@sohu.com。

*通信作者：楊秀娟（1982—），高級農藝師，主要從事農產品質量安全評價研究，E-mail：yangxiujuan595@sina.com。

少根根霉（Rhizopus arrhizus），隸屬于真菌界-接合菌門-毛霉亞門-毛霉目-根霉科-根霉屬，具有生長繁殖快及代謝衍生物多等特點，環境適應性強，培養條件簡單[1]，而廣泛應用于釀酒、多糖（淀粉、纖維素）液化與糖化、淀粉發酵和薯蕷皂苷元生產[2]。近年來，少根根霉在誘變育種、發酵工藝優化，基因的克隆和異源表達等領域得到了廣泛的研究[3-5]。少根根霉N1023高效轉化技術，闡明脂肪酶表達的調控機制，有效提高了基因表達的水平[6]；還可應用于生產防控煙蚜的生物制劑[7]和治理環保的高性能生物吸附劑[8]研發，對推動化工產業升級具有重要意義。

木薯是重要的淀粉作物，為淀粉和酒精工業的重要原料[9]。淀粉工業的酶制劑主要來源于微生物（特別是少根根霉）代謝衍生物中的酶參與淀粉液化、糖化和異構化反應[10]，改變淀粉分子中的化學結構而產生可溶性單體糖，其工藝具有能耗少，產品純度高、節本高效等優點[11-13]。本文以木薯少根根霉（Ca-201613）菌株為研究對象，優化培養，開展淀粉消化功能驗證和代謝衍生物非靶向分析，為益生菌株應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌源

（1）菌源主材料（SC9）采集于廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所木薯種質資源圃（廣西，南寧），裝入無菌密封鋁盒中，4 ℃保存，備用；（2）市面銷售的木薯淀粉、馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉和玉米淀粉；（3）木薯GR891和SC9鮮塊根。

1.1.2 培養基

稱取200 g馬鈴薯切成薄片，加700 mL dd H2O煮沸40 min，100目濾網過濾，留濾液；加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂，混勻加熱，待瓊脂溶解完后，加入dd H2O定容到1000 mL，分裝三角瓶，密閉包扎、滅菌（1×105 Pa，121 ℃，20 min）后，冷卻至約70 ℃，制作固體培養基（M1）培養平板（直徑Φ=9 cm）；無添加瓊脂M1，分裝每瓶三角瓶" " " " " " " " 200 mL，滅菌（1×105 Pa，121 ℃，20 min）后，制成液體培養基（M2），備用。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離

在無菌條件下，取約0.50 cm3病變、腐敗材料，用75 %酒精表面消毒30 s，2次，0.1 %升汞浸泡30 s，dd H2O沖洗3次，無菌濾紙吸干，放置M1平板中央，25 ℃，黑暗培養，于24 h、36 h和48 h觀察、記錄菌落生長情況。

1.2.2 菌株純化培養

挑取生長圓形菌落（斑）轉置M1平板，25 ℃，黑暗，繼代培養24 h后，用無菌接種針挑取生長旺盛、規則、完整的菌落（斑），在M1劃線培養，重復步驟3～5次，直至獲得純化菌株，備用。

用無菌打孔器在純化菌株上取直徑0.2 cm菌餅，接種M1平板中央和M2液體（80 rpm，振蕩），25 ℃，黑暗培養，于24 h、36 h和48 h用顯微鏡（萊卡）鏡檢觀察菌落、孢子、菌絲和絮狀物以及生物學表型，記錄。

1.2.3 菌株鑒定

委托中國科學院微生物研究所對菌株進行ITS測序（rRNA基因序列）測試、鑒定工作。

1.2.4 溫度對菌株的生長的影響

設6個溫度處理15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃，取Φ=0.2 cm菌塊，接種M1平板中央和M2液體（80 rpm，振蕩），25 ℃，黑暗培養，5個重復。48 h后，用游標卡尺測取菌落生長直徑；72 h后，用無菌濾紙過濾菌液、混合物（濾紙一起）置于密閉鋁盒中，60 ℃，鼓風干燥48 h，獲得菌株代謝混合物（菌粉），備用。

1.2.5 不同糖源和濃度對菌株生長的影響

（1）改良培養基M1和M2，設葡萄糖濃度：10.0 mg/L、20.0 mg/L、30.0 mg/L和40.0 mg/L共4個處理，培養步驟同“1.2.4”。48 h后，用游標卡尺測取菌落生長直徑。

（2）改良培養基M1和M2，設葡萄糖濃度（mg/L）+木薯淀粉濃度（mg/L）：10.0 mg/L+10.0 mg/L、20.0 mg/L+10.0 mg/L和30.0 mg/L+10.0 mg/L共3個處理，培養步驟同“1.2.4”。48 h后，用游標卡尺測取菌落生長直徑。

1.2.6 菌株代謝產物非靶向分析

（1）樣品前處理稱取“1.2.4”中菌株代謝混合物樣品100 mg，加入100 μL預冷水，渦旋60 s，加入400 μL預冷甲醇乙腈溶液（1∶1，V/V），渦旋60 s，低溫超聲30 min，2次，-20 ℃放置1 h沉淀蛋白，12000 rpm，4 ℃離心20 min，取上清液真空干燥復溶于200 μL 30 %ACN，渦旋，12000 rpm ，4 ℃離心15 min，取上清液，檢測。

（2）參照Schmidt 等和Glauser 等的方法，使用Q Exactive HFX質譜儀（Thermo）、超高效液相色譜（Vanquish， UPLC， Thermo， USA）、高分辨質譜（Q Exactive HFX， Thermo， USA）和低溫高速離心機 （Eppendorf 5430 R）進行測試［14-15］。電噴霧離子源 （Electrospray ionization，ESI） 條件如下：鞘氣40 psi；輔助氣10 psi；離子噴霧電壓3000 V/-2800 V；溫度 350 ℃；離子傳輸管溫度320 ℃。掃描模式為Full-scan MS2模式；掃描方式為正離子/負離子。一級掃描范圍（Scan m/z range）為70～1050 Da；二級掃描為200～2000 Da。一級分辨率70000，二級17500。

1.2.7 菌株對淀粉的消化

稱取木薯淀粉、馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉和玉米淀粉制作（W/W）8.0 %淀粉混合液，加熱糊化，制作消化測試培養基M3；取Φ=2 mm菌塊接種，10個重復，35 ℃，黑暗培養，72 h后，測取半透明水漬狀消化暈圈直徑，記錄。

1.2.8 菌粉對木薯塊根的消化

（1）接種菌粉取GR891和SC9鮮塊根，清洗干凈，切成圓柱形，隔水蒸煮30 min，冷卻至約40 ℃，均勻接種菌粉于表面及兩端，用保鮮膜包扎嚴實，20個重復 ；20～25 ℃、干燥、避免直射光照，培養7 d后開始觀察塊根變化。10～14 d后，塊根變得松軟，有少量淺黃色、半透明狀粘稠液滲出，伴有濃郁香甜氣味，略微帶有酒精氣味；將材料置于密閉鋁盒中，60 ℃，48 h鼓風干燥，獲得測試樣品，備用。

（2）樣品前處理，取（1）中測試樣品10～100 mg于2 mL旋口管中，加入700 μL 80 %乙醇，50 ℃震蕩2 h后，加700 μL H2 O稀釋，10000 rpm離心3 min；分離上清液，備用。

（3）參照Zhou等的方法，使用Thermo ICS5000（Dionex，Thermo Scientific，Waltham，US）離子色譜系統對糖組分進行測試[16]。采用CarboPac? PA1（250 mm×4.0 mm）液相色譜柱；流動相A為H2O，B為100 mM NaOH；進樣量為10 uL，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。洗脫梯度：0 min" A相/B相（95∶5， V/V），9 min" A相/B相（95∶5， V/V），20 min" A相/B相（0∶100， V/V），40 min" A相/B相（0∶100， V/V），40.1 min" A相/B相（95∶5， V/V），60 min" A相/B相（95∶5， V/V）。

（4）驗證菌株生長將（1）獲得測試樣品放置于無菌透明盒中，同（1）培養，約5～7 d后，表面長出濃密菌絲和孢子堆，觀察、記錄。

1.3 數據分析

采用EXCEL 2017、SAS 9.0、Graph Pad Prism 5和SPSS 19.0軟件進行數據整理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 菌株描述與鑒定

菌源采自在田間受微生物侵染、為害的木薯（SC9）鮮塊根，表面布滿濃密菌落，內部組織腐爛、松軟，伴隨有淀粉發酵的甜、微酸氣味，螞蟻、蠅類等昆蟲喜好取食（圖1）。通過分離、純化菌株菌斑規整，菌絲純白色或略帶灰褐色，棉絮狀（圖2）。鏡檢發現匍匐菌絲及假根，褐色孢子梗（圖3-A），直徑5～25 μm；孢子囊呈圓、橢圓形，直徑60～140 μm，其中孢子球形，直徑3～" " "6 μm；成熟、脫落孢子近球形、卵形，直徑4～" " " " 8 μm，無色或淺灰色，孢子堆呈灰褐色或褐色，表面有條紋或棱角，未見接合孢子（圖3-B）。由中國科學院微生物研究所鑒定該菌株為少根根霉（Rhizopus arrhizus），編號：Ca-201613，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（登記注冊號：CGMCC No.1992）。

2.2 溫度對菌株生長的影響分析

不同溫度對菌株的生長分析表明，菌落直徑1.07～4.49 cm和衍生物重量4.14～14.15 g；35.00 ℃處理菌落生長顯著性增大32.08 %～231.07 %和衍生物產量顯著性增加23.88 %～242.17 %（圖4-A，B）。由此可見，菌株最佳生長溫度為35 ℃，屬于嗜熱型真菌。

2.3 不同糖源和濃度對菌株生長的影響分析

（1）添加不同濃度葡萄糖對菌株生長分析表明，菌落直徑1.59 ～ 4.47 cm和衍生物質量9.14 ～15.10 g；添加葡萄糖20 g/L比其它處理能促進菌落顯著增大12.89 %、43.57 %和180.65 %及生物產量顯著性增加25.46 %、37.25 %和65.11 %" " " " " " " " " " " " " （圖5-A， B）。

（2）添加不同濃度葡萄糖+木薯淀粉對菌株生長分析表明，菌落直徑3.84 ～5.22 cm和衍生物質量10.92 ～16.42 g；單一添加10.00 g/L木薯淀粉有利于促進菌落增大9.88 %和衍生物產量增加6.04 %；（3）添加20.0 g/L葡萄糖+10.00 g/L木薯淀粉比其他處理能促進菌落顯著增大27.97 %和54.14 %和衍生物產量顯著增加48.00 %和50.44 %（圖5-C， D）。因此，添加葡萄糖和木薯淀粉進而優化培養底物糖濃度，可以獲得菌株最佳生長量及衍生物產量。

2.4 菌株的不同培養模式分析

固體培養有利于菌絲間聚集生長產生灰白色或灰褐色粉末狀孢子堆（團）（圖6-A， B）；液體培養有利于菌株生長代謝，大量菌絲在振蕩作用下相互纏繞、增大，呈白色或乳黃色的菌絲球（團），與孢子和衍生物等混合構成的絮狀沉淀物（圖6-C， D）。因此，可以根據分離衍生物的需求而選擇培養模式。

2.5 菌粉非靶向分析

結果分析表明，菌粉在neg和pos測試模型下響應值范圍廣（1.49×103～1.45×108），鑒定出853個化合物，包括了腺苷類、酸類、脂類和激素類物質；其中同分異構體占10.20 %。在響應值排名前10個代謝物中，LPE 18∶2和LysoPE［18∶2（9Z，12Z）/0∶0）］為同分異構體（C23H44NO7P）（表1）。由此可見，菌株生長代謝過程中產生大量的復雜化合物，研究結果能為靶向鑒定、分析和目標化合物篩選提供了基礎。

2.6 菌株對淀粉消化分析

根據圖7分析表明，（1）乳白色木薯淀粉糊消化后呈透明、光亮、具有水漬狀邊緣的流體狀衍生物，伴有乳白色或白色小菌落生長（圖7-A），暈圈直徑7.58 cm；（2）乳白色馬鈴薯淀粉糊消化后呈透明、光亮、具有水漬狀邊緣的流體狀衍生物，伴有極少量乳白色小菌落生長（圖7-B），暈圈直徑2.52 cm；（3）乳白色的紅薯和玉米淀粉糊均無表現出消化反應，均生長有乳白色或白色菌落，紅薯淀粉糊菌落生長明顯優于玉米淀粉糊（圖7-C， D）；（4）菌株對木薯淀粉糊的消化能力是馬鈴薯淀粉糊的3倍，差異極顯著。

2.7 菌株代謝混合物對木薯塊根消化分析

糊化木薯塊根（SC9）接種菌粉共培養，完全消化塊根外部表皮褶皺、收縮，呈紅褐色，布滿乳白色絮狀菌絲，附有灰褐色或淺綠色孢子（團）；內部松軟，呈金黃色（圖8）；伴有濃郁的香甜氣味，略微帶有酒精氣味，擠壓有少量的粘稠物滲出。通過鏡檢菌株表型結果與“2.1”描述相吻合。對接種菌粉消化木薯塊根樣品（圖9-A）進行可溶性糖定性/定量分析結果表明：（1）共檢出8個可溶性單糖：葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）、鼠李糖（Rha）、麥芽糖（Mal）、海藻糖（Tre）、果糖（Fru）和水蘇糖（Sta），覆蓋了13個標準樣品組分的61.54%（圖9-B）；（2）GR891和SC9樣品中可溶性單糖總含量分別為381.36 μg/mg和399.55 μg/mg，其中葡萄糖含量最高；（3）少根根霉菌粉處理GR891和SC9鮮薯的可溶性糖轉化率28.21 %和為27.03 %。

3 結論與討論

少根根霉物種仍然處于劇烈的演化之中，種內形態、分子和生理分化較為活躍，但尚未形成獨立種群[17]。本研究獲得木薯少根根霉（Ca-201613）生長適應溫度范圍廣（15～40 ℃），屬于嗜熱型真菌，最佳培養溫度為35 ℃，而過高的溫度明顯抑制了菌株的生長發育。固體培養菌株產生大量孢子，而液體培養則可以產生大量的菌絲和代謝衍生物。通過該菌株的鑒定與獲得，豐富了少根根霉遺傳背景和種群。

碳源（單糖、雙糖和多糖）是影響菌株生長代謝的重要因子，優化反應系統中碳參數，能獲得最高生物產量[18]，菌株對木薯淀粉糊消化能力最強，馬鈴薯其次，而紅薯和玉米無反應，說明了具有專向性；而紅薯淀粉的單糖含量高，過高的碳濃度會抑制菌株生長。添加葡萄糖和木薯淀粉有利于少根根霉的生長[19]，利用木薯粉替代少根根霉菌株代謝碳源，同步糖化發酵獲得單糖，提高反應底物葡萄糖含量，循環利用，有效激發菌株生長、提高代謝物產量，增加其消化能力，生產上應用可以實現節本增效。

菌株對GR891和SC9塊根消化反應中產生糖化酶、果膠酶、蛋白酶等代謝產物，有利于淀粉底物液化、糖化，復雜的代謝衍生物對增加產品風味及品質的形成具有積極的效應[20-21]。淀粉和酒精工業生產中，主要是將淀粉類、多糖類液化—糖化發酵產生可溶性單糖，然后再生成下游產品：聚合糖類、醇類和脂類等[22]。同步糖化發酵中，利用菌株產生糖化酶和抑菌劑，降低發酵體系中還原糖類底物濃度，形成循環提供糖，穩定發酵反應體系，節能減耗、提質增效[23-24]。研究結果表明，木薯少根根霉（Ca-201613）是對淀粉具有糖化功能的益生菌株，為菌株“變弊為利”應用提供理論依據。

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責任編輯：李菊馨