火龍果種子無菌苗組培育苗技術體系的建立

摘要：以火龍果種子在無菌條件下萌發的幼苗作為外植體供體，子葉切段作為初代培養接種材料，通過調節不同外源激素及其濃度組合，選擇最佳初代培養基、繼代培養基和生根培養基，對建立火龍果組培育苗技術體系進行研究。結果表明：（1）種子經預處理后，用75 %酒精浸泡10 s，再用0.1 % HgCl2浸泡5 min的消毒效果最好，污染率為11.67 %，萌發率為92.48 %；（2）初代培養的最適培養基為MS+6-BA 2.0 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1+蔗糖30 g?L-1，不定芽誘導率高達98.89 %；（3）繼代培養的最適培養基為MS+6-BA 1.5 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1+蔗糖30 g?L-1，不定芽增殖系數達到6.52，不定芽粗壯，長勢旺盛；（4）最佳生根培養基為1/2 MS+NAA 0.5 mg?L-1+IBA 0.1 mg?L-1+蔗糖30 g?L-1+AC 500 mg?L-1，生根率達98.89 %，生根數為6.40條；（5）生根苗移栽30 d后成活率達97 %。本研究以種子獲取無菌苗作為外植體建立了火龍果組培技術體系，較莖段作為外植體有污染低，取材方便的優點。

關鍵詞：火龍果；種子；組培；快速繁殖

中圖分類號：S667.9 文獻標志碼：A

Abstract： Taking pitaya seedlings sprouted under sterile conditions as explant donors， and cotyledon cuts as inoculation material of primary culture， the optimal primary culture medium， subculture culture medium and rooting medium were selected by adjusting combinations of different" " " "exogenous hormones and their concentrations， so as to study how to establish breeding technology system of pitaya tissue culture. The results showed that： （1） Immersing the seeds in 75% alcohol for 10 s and then in 0.1%HgCl2 for 5 min after pretreatment could gain optimal disinfection， with a contamination rate of 11.67%， and germination rate 92.48%; （2） the optimal medium for primary culture was MS+6-BA 2.0mg?L-1+NAA 0.2mg?L-1+ sucrose 30g?L-1， leading to adventitious bud induction rate up to 98.89%; （3） MS+6-BA 1.5 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1+sucrose 30g?L-1 was the most suitable for the subculture， leading to multiplication coefficient of 6.52， stout adventitious buds that grew vigorously; （4） the optimal rooting medium was 1/2 MS+NAA 0.5 mg?L-1+IBA 0.1 mg?L-1+sucrose" " " "30g?L-1+AC 500mg?L-1， leading to a rooting rate of 98.89% and rooting number 6.40; （5） survival rate of rooting plantlets reached 97% 30d after transplantion. In this study， the tissue culture technology system of pitaya was established by using sterile seedlings as explant donors， and compared with using stem segments as explants， it has the advantages of low pollution and convenient sampling.

Key words： Pitaya; seed; tissue culture; rapid propagation

基金項目：廣西農業科學院科技發展基金資助項目（桂農科2021JM124，桂農科2020YM134）；廣西重點研發計劃（桂科AB16380076）；南寧市重點研發計劃（20172011-2）；南寧市重大科技專項（20162008）。

第一作者：葉維雁（1988—），碩士研究生，助理研究員，主要從事果樹生物技術研究，E-mail：flyingywy@163.com。

火龍果（Hylocereus undulates Britt.）又稱紅龍果、龍珠果、青龍果和仙蜜果等，是仙人掌（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）多年生植物[1-3]。近年來，火龍果發展迅速，具有較大的發展潛力[4，5]，果實外形獨特、口感清甜[6，7]，含有豐富的白蛋白、維生素、甜菜紅素、可溶性膳食纖維、低聚糖和氨基酸，經常食用火龍果能降血壓、降血脂、潤肺、解毒、養顏和明目，對便秘和糖尿病有輔助治療的作用，具有很高的食用價值[8-14]。

火龍果可通過扦插、嫁接和組織培養等無性繁殖方式繁育種苗，扦插和嫁接容易受母體材料、季節和氣候的限制，且繁殖系數低，不能滿足產業對種苗的大量需求，組織培養繁殖系數高、繁殖速度快，是短期內獲得大量健康種苗的有效途徑，有利于大范圍推廣應用[15，16]。‘桂熱1號’為紅皮紅肉火龍果新品種，自花授粉結實率高，果形較大，果品優良，商品性佳，抗逆性好，耐貯運，適合在生產上應用推廣。本文以‘桂熱1號’火龍果成熟種子為試材，利用種子作為組培外植體來源具有污染率低、出苗快、成活率高的特點[17]，快速建立火龍果組培技術體系，探討不同外源激素配比對組培效果的影響，以期為火龍果組培育苗技術的優化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2021年8月在廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所火龍果種質資源圃采收“桂熱1號”火龍果無病蟲害的成熟果實，取其種子作為試驗材料。供試的外源激素為6-苯甲基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA），其他藥品有MS培養基、蔗糖、瓊脂和活性炭（AC）等。

1.2 方法

1.2.1 種子的消毒及無菌實生苗的獲得

剖開火龍果果實，取出種子清洗干凈，挑選成熟個大、飽滿的種子裝于無菌組培瓶，在無菌超凈工作臺中用75 %酒精浸泡處理種子，浸泡時間分別設置10 s、20 s；無菌水清洗1次，再用0.1 %HgCl2 浸泡處理種子，分別設置2、5、10 min；接著用無菌水清洗6次。消毒后將種子接種于1/2MS培養基，每處理接20粒種子，每粒種子單獨1瓶，重復3次。25 d后統計種子污染率與萌發率。

1.2.2 初代培養基配方及不定芽誘導效果

初代培養以MS為基本培養基，添加不同濃度6-BA（0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mg?L-1），NAA均為0.2 mg?L-1。選長勢好、大小一致的無菌實生苗，將實生苗自上而下分成頂芽切段、子葉切段和根切段，切取大小相同的子葉切段（帶子葉，長約2.5 cm），按原來的極性接入初代誘導培養基，每處理接種30個子葉切段，重復3次。40 d后統計不定芽誘導率和增殖系數，觀察不定芽的生長狀況。

1.2.3 繼代培養基配方及不定芽增殖效果

繼代培養以MS為基本培養基，添加不同濃度6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mg?L-1），NAA均為0.2 mg?L-1。從初代培養長出的不定芽中切取大小一致（長約2.5 cm）的單芽接入繼代培養基，每處理接種30個芽，重復3次。40 d后統計不定芽增殖系數，觀察不定芽的生長狀況。

1.2.4 生根培養效果

生根培養以1/2 MS+AC 500 mg?L-1為基本培養基，添加不同濃度NAA（0.2、0.5、1.0 mg?L-1），IBA均為0.1 mg?L-1。從繼代培養長出的不定芽中切取大小一致（長約3 cm）的單芽接入生根培養基，每處理接種30個芽，重復3次。45 d后統計生根率和生根數，觀察根的生長狀況。

1.2.5 培養條件

MS培養基添加蔗糖30 g?L-1、瓊脂6 g?L-1；1/2 MS培養基所有元素含量減為MS培養基的1/2，添加蔗糖30 g?L-1、瓊脂6 g?L-1；pH值均為5.8 ± 0.1。培養溫度（27±1）℃，光照強度2000 lx，光照時間14 h?d-1。

1.2.6 數據統計分析

使用SPSS 25.0軟件對數據進行方差分析、多重比較。

污染率（%）=種子污染數/供試種子數×100；

萌發率（%）=種子發芽數/（供試種子數－種子污染數）×100；

誘導率（%）=長不定芽子葉切段數/接種子葉切段數×100；

生根率（%）=生根芽數/接種芽數×100；

移栽成活率（%）=成活組培苗數/移栽組培苗數×100；

增殖系數=增殖后芽數/接種植物材料數；

生根數=一級根數/生根苗數。

2 結果與分析

2.1 不同處理的消毒效果

從表1可以看出，75 %酒精浸泡時間相同情況下，0.1 %HgCl2浸泡5 min的污染率極顯著低于浸泡2 min的污染率，與浸泡10 min的污染率差異不顯著；0.1 %HgCl2浸泡5 min的萌發率與浸泡2 min的萌發率差異不顯著，但極顯著高于浸泡10 min的萌發率；因此0.1 %HgCl2的最佳浸泡時間為5 min。0.1 %HgCl2浸泡時間相同情況下，75 %酒精浸泡10 s的污染率與浸泡20 s的污染率無顯著差異，但前者萌發率顯著高于后者，因此75 %酒精的浸泡時間為10 s消毒效果較好。綜合考慮，火龍果種子消毒以75 %酒精浸泡10 s、0.1 %HgCl2浸泡5 min效果最好，污染率低至11.67 %，萌發率達92.48 %。

2.2 不同激素濃度組合對初代培養的影響

如表2所示，取子葉切段接入初代培養基，實現不定芽的啟動，也在一定程度上獲得芽的增殖。隨著6-BA濃度升高，不定芽誘導率和增殖系數先升高后降低，不定芽生長表現為由細小、長勢較弱到粗壯、長勢旺盛再到細小、長勢較弱，其中6-BA濃度為2.0 mg?L-1時誘導率高達98.89 %，增殖系數為5.83，均顯著高于其他處理，不定芽粗壯，長勢旺盛。表明6-BA濃度為2.0 mg?L-1時不定芽誘導效果最佳。因此，培養基MS+6-BA2.0 mg?L-1+NAA0.2 mg?L-1最適合初代培養。

2.3 不同激素濃度組合對繼代培養的影響

由表3可知，在繼代培養中不同濃度6-BA對不定芽增殖表現出不同的影響，NAA濃度為" " " " " "0.2 mg?L-1時，不定芽增殖系數在6-BA的5個濃度水平上相互間差異極顯著，且隨著6-BA濃度的增加先提高后降低；6-BA濃度為1.5 mg?L-1時不定芽的增殖系數達到6.52，極顯著高于其他濃度下的增殖系數，芽粗壯，長勢旺盛。綜合增殖系數及不定芽生長狀況，處理3效果最好，即MS+6-BA" " " 1.5 mg?L-1+NAA 0.2 mg?L-1是繼代增殖的最佳培養基。

由表4可知，3種處理均能誘導生根，NAA濃度對不定芽誘導生根具有一定的影響。NAA濃度由0.2 mg?L-1增加到0.5 mg?L-1時，生根率和生根數均極顯著提高，生根率由90.00 %提高到98.89 %，生根數由5.83條提高到6.40條。NAA濃度由" " " " " " 0.5 mg?L-1增加到1.0 mg?L-1時，生根率由98.89 %降低到97.78 %，不顯著，而生根數由6.40條顯著減少到6.09條。NAA濃度為0.5 mg?L-1時根的生長狀況最好，根長且粗壯，長勢旺盛，二級根數量多。綜合比較，培養基1/2 MS+NAA0.5 mg?L-1+IBA" " " "0.1 mg?L-1+AC 500 mg?L-1的生根效果較好，生根率達98.89 %，生根數為6.40條。

2.4 生根苗移栽及管理

挑選生長粗壯、株高約4 cm的生根苗100株，移到室內自然光下放置10 d，逐漸擰開瓶蓋進行煉苗。取出生根苗，沖洗干凈根部培養基，移栽到混合基質（泥炭土：椰糠：蛭石=2∶1∶1，以1000倍多菌靈液澆透消毒）中，澆足定根水，管控好水分、光照等，經統計移栽成活率達97 %。

3 結論與討論

在植物組織培養中，獲得無菌材料是獲得成功的必要前提，通過化學藥劑消除外植體上的雜菌是其中一個重要環節[18]。本研究中以75 %酒精處理10 s、0.1 %HgCl2處理5 min對‘桂熱1號’火龍果種子進行消毒，污染率低至11.67 %，同時種子萌發率為92.48 %，而李清香等[19]以火龍果新萌發的莖段為外植體進行消毒，污染率為55.70 %。由此可見，火龍果成熟種子藏于果實中，取出來后攜帶的微生物也比較少，以種子作為外植體來源可有效避免以莖段作為外植體帶菌多、污染多的缺點，種子萌發長成的無菌小苗可作為無菌材料直接用于不定芽的初代誘導，且火龍果種子取材方便，受季節限制較小。

本研究將“桂熱1號”火龍果無菌實生苗的子葉切段接種于初代培養基，實現了不定芽的啟動，也一定程度上獲得了芽的增殖，以培養基MS+" " " " 6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1的效果最好，不定芽誘導率高達98.89 %，增殖系數達5.83，芽粗壯，長勢旺盛。洪青梅等[20]和楊紅超等[21]以火龍果莖段為外植體進行初代誘導培養，誘導率分別為80 %和70 %，可見，火龍果組織培養以無菌的子葉切段作為啟動培養材料可以有效避免化學藥劑的傷害，不定芽誘導效果優于直接以莖段為材料進行啟動培養。繼代培養是植物組織培養中材料增殖至一定數量的必須過程，尤其是增殖系數對整個快繁技術能否成功的影響很大，有些植物快繁不能推廣的一個重要原因是增殖系數偏低，間接地提高生產成本[22]。謝志亮等[23]認為最適合白玉龍火龍果不定芽增殖的6-BA濃度為0.5～1.0 mg·L-1，增殖系數達3.55～4.39。黃彩枝[17]以培養基MS+" " " " " nbsp; "6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.6 mg·L-1對海南紅心火龍果進行增殖培養，增殖系數達5.1。本研究在繼代培養中沿用了初代誘導6-BA和NAA的基本組合，結果表明6-BA濃度對繼代培養影響較大，濃度為" "1.5 mg·L-1時最適合不定芽的增殖，增殖系數達到6.52，且不定芽粗壯，長勢旺盛。“桂熱1號”火龍果不定芽生根較為容易，以培養基1/2 MS+NAA0.5 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1+AC500 mg·L-1的生根效果最好，生根率達98.89 %，平均生根數為6.40條。

本研究以種子獲取無菌苗作為外植體供體建立了火龍果組培技術體系，下一步可以此作為參考對以莖段為外植體的火龍果組培育苗技術進行優化。

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責任編輯：李菊馨