秋水仙素在誘導我國果樹多倍體的應用研究進展

摘要：多倍體育種是創造和選育果樹新品種的重要途徑，秋水仙素是目前果樹多倍體誘導使用最廣泛和有效的試劑。對近年來我國果樹在秋水仙素多倍體誘導方面的應用進行了概述。包括利用秋水仙素誘變已經獲得多倍體的果樹種類及其品種，誘導多倍體的途徑及倍性鑒定方法，指出目前果樹存在獲得新品種較少及嵌合體問題，并對上述問題給出相應的解決策略及建議。

關鍵詞：秋水仙素；果樹；多倍體；研究進展

中圖分類號：S66 文獻標志碼：A

Abstract： Polyploid breeding is an important way to create and select new cultivars of fruit trees. At present， colchicine is the most widely used and effective reagent for fruit trees polyploid induction. This paper reviewed research progress on polyploid induction of fruit trees using colchicine in recent years， including achievements of polyploid species and varieties， induction pathways and identification methods and figured out problems of lack of new cultivars and chimera. Then， corresponding solutions and suggestions were given.

Key words： Colchicine; fruit trees; polyploid; research progress

基金項目：廣西農業科學院科技發展基金項目（桂農科2022JM94）。

第一作者：張美華（1982—），助理工程師，主要從事農產品加工、農作物種植及推廣工作，E-mail：2772626509@qq.com。

*通信作者：李慧敏（1984—），助理研究員，主要從事植物營養與環境生態工作，E-mail：lihuimin131@qq.com。

果樹多倍體具有生長旺盛、枝條粗壯、果實大、豐產、對環境適應力強等優點，日益受到果樹育種者的重視。秋水仙素（Colchicine）為微管特異性藥物，自1937年被發現能誘導染色體加倍的效果以來，在人工誘導果樹多倍體育種中得到了廣泛應用。誘導機理是在適宜的濃度下，秋水仙素能夠使染色體在細胞分裂時不分向兩極，從而使新生細胞的染色體加倍[1]。迄今，秋水仙素是誘導植物體細胞染色體加倍的最有效、也是使用最多的化學誘變劑，通過該法誘導培育出的良種已在生產中推廣[2]。利用秋水仙素誘導果樹多倍體具有處理方法簡單、受眾廣泛、對染色體結構無顯著影響等優點，在經濟效益和育種理論上具有重要意義。本文就近年來秋水仙素在我國果樹多倍體育種中取得的成就作一概述。

1 秋水仙素誘導果樹多倍體成果

1978年，黃金松等[3]應用秋水仙素進行枇杷的育種研究，取得了多倍體植株。此后，國內研究者利用秋水仙素對果樹進行誘變，已在喬木（蘋果、梨、核桃、枇杷等）、灌木（越橘、醋栗、樹莓等）、藤本（葡萄、獼猴桃、西番蓮等）、草本（香蕉、草莓等）等果樹上陸續取得了多倍體植株，已獲得新品種（系）葡萄6個、棗2個、果葉兼用型桑3個，獲得的多倍體植株或新品種（系）具有葉片增厚增大、短枝、莖矮化、早熟及抗逆性強等性狀，在果實果形、色澤、風味等果實品質方面也取得了一定的成果（表1）。

2 秋水仙素誘導果樹多倍體技術

2.1 誘導途徑

根據處理方式的不同，誘導途徑可以分為在體（In vivo）誘導、離體（In vitro）誘導。在體誘導是指對果樹田間活體器官進行誘導。對木本植物而言，通過離體組培誘導獲得多倍體種質到田間評價需要時間較長，因此需要更快捷的誘導途徑。在體誘導解決了這一難題。陳大成等[79]通過田間誘導方式，利用秋水仙素對十月桔進行誘變實驗，獲得21株四倍體十月桔，穩定地表現出優于二倍體品質的特性，如果實增大、單果重增加、果實種子減少，更脆嫩、化渣。劉孟軍團隊選取大田生長的健壯棗樹枝條，進行截面，對截面進行秋水仙素誘導多倍體研究，結果表明，經適宜濃度的秋水仙素處理一定時間后，在截面上可獲得臨猗梨棗、冬棗和辣椒棗的純四倍體芽以及辣椒棗的八倍體芽，這些多倍體當年即可開花，大大縮短了育種時間[31，36]。

離體誘導一般指利用組織培養技術，以種子、愈傷組織、葉片、帶腋芽莖段等為材料，以浸漬法和混培法進行誘導。浸漬法是指將材料接種于含秋水仙素的液體中，浸漬一定時間后轉移到無秋水仙素的培養基上培養；其優點是操作簡單、效率高、材料可充分接觸秋水仙素致使細胞分裂程度高，但也存在秋水仙素用量多、對材料傷害大的情況。混培法是指將材料接種于含秋水仙素的固體培養基上，誘導一定時間后轉移到無秋水仙素的培養基上培養；其優點是可減少秋水仙素的用量，且材料與秋水仙素接觸面小、受傷害小。

2.2 內在影響因素

2.2.1 材料的生長狀態

從已有的報道來看，果樹誘導材料有種子、離體葉片、離體莖尖、愈傷組織、胚性愈傷懸浮系等。由于不同材料的生理生化狀態不同，如內源激素各有差異，這導致了不同材料的多倍體誘導頻率各異。張淑愛等在對秋水仙素誘導葡萄多倍體研究中發現，不同葡萄品種對秋水仙素誘導反應差別很大，‘乍娜’‘京早晶’無加倍效果，而里查馬特的染色體加倍效果較好[14]。張仕超以 ‘南紅梨’葉片和杜梨子葉進行多倍研究中發現，適宜‘南紅梨’的秋水仙素濃度為0.2 %，而適宜杜梨的秋水仙素濃度為0.1 %，經秋水仙素處理后，均可獲得四倍體植株，誘導率皆達到32%以上[77]。李鎮剛等在桑樹多倍體誘導研究中發現，利用大田桑樹冬芽誘導四倍體桑樹，獲得了桑樹新品種[74]。由此可知，材料的來源對誘導效果很重要；另外，在材料的不同時期進行處理，效果也有差異，種子可以在休眠狀態就進行處理，而芽等其他部位則在代謝旺盛時期處理的越早，獲得的多倍體就越多。

2.2.2 材料的倍性水平

雷家軍等在利用草莓莖尖進行誘導時發現，不同倍性的材料誘導多倍體的成功率不同，二倍體（2x，五葉草莓）較易誘導成功，五倍體（5x，中間雜種一號）較難獲得，2x加倍成4x株系19個，5x加倍成10x株系5個，8x加倍成16x株系3個[38]。張計育在對八倍體草莓品種‘雪蜜’誘導多倍體中發現，不同濃度秋水仙素處理能夠產生倍性為9x、10x、11x、12x、14x、16x的多倍體，誘導率隨濃度呈先上升后下降的變化趨勢[39]。王愛華等在草莓多倍體誘導研究中發現，利用秋水仙素誘導五倍體的愈傷組織能成功誘導得到十倍體植株[41]。

2.3 外在影響因素

2.3.1 濃度及時間

從已有報道可知，濃度是決定誘導效果的最關鍵因素。秋水仙素濃度到達一定程度，才能起到誘導作用，過高則可能導致材料受到毒害甚至死亡。比較有效的秋水仙素濃度范圍0.001 %～1 %（表1）。李映樂等用不同濃度梯度的秋水仙素浸泡人參果莖段，濃度為0.1 %時，誘變率為6.9 %；誘變率隨著濃度升高而升高，誘導濃度達到半致死率時（0.2 %）誘導效率最高（53.33 %）[70]。Gu等[80]研究發現在不同濃度的秋水仙素（0.01 %、0.03 %、0.05 %、0.1 %、0.3 %）處理沾化冬棗離體莖尖，處理濃度為0.05 %和0.1 %能獲得誘導率大于3 %的四倍體。郭燁等設置了0.007 %和0.009 %" 2個濃度梯度的秋水仙素浸泡茶壺棗離體葉片，研究發現，處理8 d后，0.007 %的秋水仙素誘導率最高，達4.11 %，成果獲得8株純合四倍體[34]。

時間是決定誘導效果的另一個關鍵因素。目前已知秋水仙素誘導果樹多倍體的誘導時間范圍為4～720 h（表1）。一般通過設置不同的濃度和時間梯度，探討秋水仙素誘導果樹多倍體的最優組合。劉麗等在對獼猴桃‘瓊露’‘紅陽’加倍時，適宜的秋水仙素濃度為0.05 %，處理時間為" " " " " " " " " " " 4 h[45，81]；而在誘導藍莓多倍體時，適宜濃度0.2 %，處理時間10 h為最佳組合[75]。不同的誘導材料對秋水仙素的敏感程度、耐受程度的反應不同。如利用石榴離體單芽段進行多倍體誘導，采用0.001 %濃度秋水仙素浸漬30 d，誘變效果最佳，誘變率為20 %[65]。而利用蘋果離體葉片要達到20 %的誘變率，秋水仙素的濃度需提高到0.005 %，處理時間縮短到只需要5 d[9，10]。目前已知的研究中，秋水仙素濃度使用頻率最高的為0.2 %，處理時間為24 h。在蘋果[13]、獼猴桃[46]上利用0.2 %濃度的秋水仙素誘導24 h，均可成功獲得多倍體植株。利用濃度為0.2 %的秋水仙素誘導不同種類的果樹，誘導時間各異，枇杷的為30 h[3]；葡萄的為96～120 h、2～3 d、45 h、4 d、2 h[15，16-19，26，29，30]；獼猴桃的為24 h、48 h[46，47]；香蕉的為10 d[60]；石榴的為8 d[64]；人參果的為18 h[70]；桑樹的為5 d或" " " " " " " " " " "2.5 d[72，32]；藍莓的為10 h[75]；梨的為12 h[76，77]；西番蓮的為5 d[78]。同一種類的果樹，處理濃度和時間不同，效果也有差異；曹嘉雯用0.01 %的秋水仙素誘導軟棗獼猴桃24 h時誘導率為13.33%，當濃度升到0.02 %，處理時間為2 h時，誘導率可達到20 %[82]。而奚登賢等用0.15 %的秋水仙素處理中華獼猴桃168 h時誘導效果最好，誘導率為26.67 %[83]。

2.3.2 處理方法

處理方法包括浸漬法、混培法、滴液法、注射法、包埋法等，在實際應用中一般根據不同材料和不同處理部位靈活使用。浸漬法（也稱浸泡法）是將材料放入一定濃度的秋水仙素溶液中浸泡，之后放置在無秋水仙素的培養基上進行培養，具有操作簡單，能使誘導材料充分接觸溶液，加速細胞分裂等優點；若處理時間過長，則可能對誘導材料造成毒害，或者導致誘導材料缺氧而死[77]。浸漬法是秋水仙素誘導果樹多倍體使用最多的處理方法，適合采用浸漬法的材料包括葉片、種子、莖尖、芽段、愈傷組織、原生質體、胚性細胞懸浮系等（表1）。混培法是將材料放入含一定濃度的秋水仙素培養基上，之后轉入無秋水仙素的培養基上進行培養。具有材料與秋水仙素接觸面積小、受傷害小、用量少的優點[77]。采用混培法成功誘導多倍體的材料包括離體葉片[9-11，67]、叢芽[32]、莖尖[38]、離體愈傷[41，49]、種子[42]、莖段[43]、無菌苗[69]、不定芽[78]等。滴液法是將蘸有秋水仙素的脫脂棉包裹在果樹材料的表面，滴一定量的秋水仙素溶液，以溶液不滴落為標準[33，54，64，72]。注射法是將秋水仙素溶液注射到果樹生長點的方式[20，21，71，74]。包埋法是將浸有秋水仙素溶液的棉花覆蓋于果樹生長點上的方法[35，55]。

2.3.3 其他影響因素

除上述因素外，溫度、光照、水分、樹勢、化學滲透劑等也會影響到結果。從已有研究可知，由于秋水仙素見光易分解，故誘導一般在黑暗條件下進行。添加化學滲透劑二甲基亞砜（DMSO）或細胞分裂素可以提高誘導效果，降低嵌合體的發生率[35，71，76]。DMSO在蘋果、棗樹、山楂、桑樹、梨樹等木本果樹上的用量一般在0.2 %～2 %[5，8，35，68，73，74，76]；用量過多會使材料受毒害，與不添加DMSO相比，添加2 %DMSO導致棗樹的出愈延遲[84]。采用浸漬法進行誘導時，可以配合震蕩處理，提高秋水仙素溶液與材料的接觸面，更好地促進誘變，從已知的研究可知，震蕩和化學滲透劑一般在秋水仙素濃度較低，處理時間較短的情況下即可獲得最佳誘導率。

3 鑒定方法

果樹多倍體的鑒定方法包括：形態學鑒定法、染色體計數法、流式細胞鑒定法等。在實際鑒定操作中，常采用多種方法互相驗證，以獲得更準確的鑒定結果。

3.1 形態學鑒定法

果樹多倍體最普遍的特性是“巨大性”。因此形態學鑒定法為最簡單、最直接的方法。多倍體植株在試管苗階段就表現葉片增大，葉色加深；葉形指數趨小化，節間變短，葉片變圓，葉片氣孔密度變大，植株變矮等多倍體特征，這對于誘變植株的早期選擇是非常有利的[8]。石慶華[35]根據新生棗吊上不同倍性嫩葉形態估測，各個倍性的估測準確性和流水細胞儀測定的精確結果差異不顯著，根據成熟葉片形態估測結果和棗吊嫩葉形態估測準確性完全相同。

3.2 染色體計數鑒定法

此法為最主要和最準確的倍性鑒定方法，該方法可以準確數出植株的染色體數，對于植株的倍性鑒定及植株是否是整倍體可以給出明確的答案。譚平等[59]通過染色體計數分析抗枯1號香蕉變異植株，大部分的變異屬于非8整倍體變異，染色體數目變化較大，染色體數目18～71條不等。

3.3 流式細胞鑒定法

該技術是目前最快的植物倍性高效鑒定技術。基于細胞核中的DNA相對含量與植株的倍性成正比的原理，利用流式細胞儀對細胞進行分析和分選，有效鑒定植物的倍性。程志號等[69]利用流式細胞儀快速、有效鑒定出同源四倍體和多倍體混倍體火龍果。

4 存在的問題及解決策略

4.1 新品種的獲得較少

目前，較多果樹品種使用秋水仙素處理后，鑒定出了大量染色體加倍及變異植株，但獲得的新品種較少，且以離體誘導為主。通過離體培養途徑誘導的研究，主要集中在探討秋水仙素施用的適宜濃度和處理的最佳時間，雖提高了誘變效果得到了更多的純合多倍體，但通過離體培養的多倍體鮮有田間評價的報道。秋水仙素處理獲得的多倍體只是多倍體育種的原始材料，需提高植株的雜合性[23]。通過將其與其他四倍體品種雜交以提高多倍體的雜合性，從而提高誘變株的利用價值，獲得結合雙親優勢的植株[21]。

4.2 嵌合體的鑒別分離及純化

嵌合體的產生是多倍體誘導過程中常見的問題。嵌合體的干擾也是困擾多倍體育種工作 的一個大難題。可利用流式細胞儀將嵌合體從變異植株中區分出來，利用葉片再生技術，將四倍體分離出來，提高嵌合體的分離效率[8]；也可選擇適宜的誘導時期和創造有利的誘導條件進行四倍體誘導，嵌合體的發生率并不高，且可能沒有嵌合體，得到純四倍體[55]；還可通過田間愈傷組織方式誘導愈傷后處理適當時間，獲得的變異芽均為純多倍體，不存在混倍體現象[35]。

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責任編輯：李菊馨