黃芪多糖調控Nrf2/HO-1通路對阿爾茨海默病大鼠海馬神經元損傷的作用機制研究

摘要目的：探討黃芪多糖（APS）對阿爾茨海默病（AD）大鼠海馬神經元損傷的影響及其機制。方法：按隨機數字表法將180只健康Wistar大鼠平均分為正常組、模型組、APS低劑量組（APS-L組）、APS中劑量組（APS-M組）、APS高劑量組（APS-H組）和吡拉西坦片組。除正常組外，其他各組采用雙側海馬定向注射β-淀粉樣蛋白1～42片段（Aβ1～42）的方法制備AD大鼠模型，APS-L組、APS-M組、APS-H組分別給予200、400、800 mg/kg APS灌胃，吡拉西坦片組給予500 mg/kg吡拉西坦片灌胃，正常組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，每日1次，連續給予30 d。蘇木精-伊紅染色觀察海馬CA1區神經元病理改變，透射電子顯微鏡觀察神經元超微結構，分光光度法檢測海馬組織超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量，酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6水平，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法測核因子E2相關因子2（Nrf2）、血紅素加氧酶1（HO-1）mRNA表達，蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測Nrf2、HO-1、胞漿核因子-κB p65（NF-κB p65）、胞核NF-κB p65蛋白表達。結果：與模型組比較，APS-L組、APS-M組、APS-H組和吡拉西坦片組大鼠海馬CA1區神經元病理性形態結構改變、超微結構病變呈不同程度改善。APS-M組、APS-H組和吡拉西坦片組海馬CA1區神經元病理分級明顯降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px活性明顯升高且MDA含量明顯降低（P＜0.05），TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低（P＜0.05），Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表達量均明顯升高（P＜0.05），胞核NF-κB p65表達量和胞核NF-κB p65/胞漿NF-κB p65明顯降低（P＜0.05）。APS對各檢測指標的影響具有一定劑量依賴性，APS-H組對各指標的影響均優于吡拉西坦片組（P＜0.05）。結論：APS對AD大鼠海馬神經元損傷具有保護作用，該作用具有一定的劑量依賴性，其機制可能與激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB核轉位進而抑制氧化應激和炎癥反應有關。

關鍵詞阿爾茨海默病；黃芪多糖；海馬神經元；核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶1通路；氧化應激

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.23.012

Effect of Astragalus Polysaccharide" on Hippocampal Neuron Injury in Alzheimer′s Disease Rats

FAN Hongjuan， LI Shurui， KANG Kaining， GUAN Lianying

Handan Central Hospital， Handan 056000， Hebei， China， E-mail： lfsyry@163.com

AbstractObjective：To investigate the effects of astragalus polysaccharide（APS） on hippocampal neuron injury in rats with Alzheimer′s disease（AD）.Methods：A total of 180 healthy Wistar rats were divided into normal group，model group，low APS（APS-L），medium APS（APS-M），high APS dose（APS-H） group and piracetam（PIR） group by random number table method.Except the normal group，the AD rat model was prepared by bilateral hippocampal injection of β-amyloid 1-42 fragments（Aβ1-42）.APS-L，APS-M and APS-H groups were given 200，400 and 800 mg/kg APS intragastatically，respectively.The PIR group were given 500 mg/kg PIR intragastatically.The normal group and model group were given 0.9% sodium chloride solution intragastatically，once a day，for 30 days.Hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the pathological changes of neurons in CA1 region of hippocampus.Transmission electron microscopy was uesd to observe the ultrastructure of neurons.Superoxide dismutase（SOD），glutamate glutathione peroxidase（GSH-Px） activity and malondialdehyde（MDA） content in hippocampus were detected by spectrophotometry.The levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin（IL）-1β and IL-6 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The mRNA expression of nuclear factor E2-related factor 2（Nrf2） and heme oxygenase-1（HO-1） were measured by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.The expressions of Nrf2，HO-1，cytoplasmic nuclear factor-κB p65（NF-κB p65），and nuclear NF-κB p65 were detected by Western Blot.Results：Compared with model group，the pathological morphological and ultrastructural changes of neurons in hippocampal CA1 region of rats in APS-L，APS-M，APS-H group，and PIR group" improved with different degrees.The pathological grade of neurons in hippocampal CA1 region" significantly decreased in APS-M，APS-H and PIR groups（P＜0.05），the activities of SOD and GSH-Px significantly increased and the content of MDA" significantly decreased（P＜0.05），and the levels of TNF-α，IL-1β and IL-6" significantly decreased（P＜0.05），Nrf2 and HO-1 mRNA and protein expressions" significantly increased（P＜0.05），while nuclear NF-κB p65 expression and nuclear NF-κB p65/cytoplasmic NF-κB p65 expression" significantly decreased（P＜0.05）.APS showed a dose-dependent effect on each index，and the effect of APS-H group on each index was better than piracetam group（P＜0.05）.Conclusion：APS shows a dose-dependent protective effect on hippocampal neuron injury in AD rats.The mechanism may be related to activation of Nrf2/HO-1 pathway，inhibition of NF-κB nuclear translocation，and inhibition of oxidative stress.

KeywordsAlzheimer′s disease; astragalus polysaccharide; hippocampal neuron; nuclear factor E2-related factor 2/heme oxygenase-1 pathway; oxidative stress

阿爾茨海默病（AD）是老年人群中較為常見的一種中樞神經系統退行性疾病，是導致老年人癡呆的主要因素，主要表現為認知障礙、記憶力減退、人格及行為改變等［1］。在我國，隨著人口老齡化的加劇，AD發病率呈明顯上升趨勢，已成為我國亟待解決的社會問題和醫學難題。海馬是與認知、記憶等密切相關的腦功能區，有研究發現，減輕海馬神經元損傷能夠有效改善AD癥狀并延緩其進展［2-3］。病理生理學研究發現，氧化應激和炎癥反應是AD所致海馬神經元損傷的重要機制［4-5］。黃芪多糖（APS）是中藥黃芪中的一類水溶性多糖，由葡萄糖、葡萄糖醛酸、己糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等組成，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理學作用［6-8］。核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶1（Nrf2/HO-1）是氧化應激反應重要的信號通路［9］。研究發現，APS通過調控Nrf2/HO-1通路抑制氧化應激、炎癥反應，可有效改善結腸炎小鼠癥狀和減輕糖尿病大鼠肝損傷［10-11］。本研究探討APS對AD大鼠海馬神經元損傷的影響及其機制。

1材料與方法

1.1實驗動物

8周齡清潔級雄性Wistar大鼠180只，體質量220～250 g，購自河北醫科大學實驗動物公共服務平臺［SYXK（冀）2020-001］，動物合格證號為20200713008。分籠飼養（室溫23～25 ℃、相對濕度55%～65%、自由飲水進食），本研究獲得邯鄲市中心醫院倫理委員批準［批件號：HDZXLL（K）2020-014］。

1.2實驗藥物與試劑

APS（純度≥97%）購自南京澤朗醫藥科技集團公司（批號：2003016）；吡拉西坦片（Piracetam，PIR）購自石藥集團歐意藥業有限公司（批號：1200413）。β-淀粉樣蛋白1～42片段（Aβ1～42）凍干粉購自美國Sigma公司（批號：119M8714V）；TriQuick Reagent總RNA提取試劑盒購自北京索萊寶生物技術有限公司（貨號：R1100）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：200127、200319、200114、200407、191230、200319）；逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司（批號：1841432）；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒購自上海novoprotein公司（批號：0511171）；胞漿胞核蛋白制備試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司（批號：0918A20）；Nrf2、HO-1、核因子-κB p65（NF-κB p65）抗體購自北京博奧森生物技術有限公司（批號：bs-1074R、bs-23397R、bs-3485R）；β-actin抗體購自美國Abclonal公司（批號：AC026）；IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司（批號：180511）；增強型化學發光（ECL）試劑盒上海碧云天生物技術有限公司（批號：P0018AS）。

1.3實驗儀器

MD-3000型動物腦立體定位注射儀（美國BAS公司生產），RM2016型石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司生產），BMJ-A型包埋機（常州郊區中威電子儀器廠生產），EMUC7型超薄切片機（德國Leica公司生產），DVM6型透射電鏡（德國Leica公司生產），5424R型離心機（德國Eppendorf公司生產），MK3 型酶標儀（美國Thermo公司生產），DU640型蛋白核酸分析儀（美國Beckman公司生產），Rotor-Gene Q型Real-time PCR儀（德國Qiagen公司生產），DYCZ-24DN型電泳儀（北京六一生物科技有限公司生產），JY200C型電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司生產），S1000TM型逆轉錄儀、GelDoc XR型凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司生產）。

1.4實驗方法

1.4.1分組、造模與給藥

大鼠適應性飼養1周后，按照隨機數字表法分為正常組、模型組、APS低劑量（APS-L）組、APS中劑量（APS-M）組、APS高劑量（APS-H）組和吡拉西坦片組，每組30只。除正常組外，其余各組均參照文獻［12］中的方法復制AD大鼠模型：3 mL/kg腹腔注射10%的水合氯醛溶液實施麻醉后，將大鼠固定于腦立體定位注射儀，于前囟后3.0 mm、正中矢狀縫左旁和右旁3.0 mm、顱骨表面下3.5 mm處分別緩慢注射2.5 μL的Aβ1～42溶液（濃度4 mg/mL），注射時間10 min；正常組以同樣的方法注射10 μL 0.9%氯化鈉溶液。造模完成后，APS-L、APS-M、APS-H組分別給予200、400、800 mg/kg APS灌胃，每日1次；吡拉西坦片組給予500 mg/kg吡拉西坦灌胃，每日1次；正常組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，每日1次，灌胃體積均為5 mL/kg，連續干預30 d［13］。

1.4.2蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察海馬CA1區神經元病理改變及病理分級

末次給藥24 h后，各組分別選取10只大鼠，麻醉、頸椎脫臼處死、取腦組織并去除小腦、腦干、嗅球，置于10%中性甲醛溶液中固定3 d后，石蠟浸潤包埋、5 μm連續切片，部分切片經梯度乙醇脫蠟水化后行常規HE染色，通過光學顯微鏡觀察海馬CA1區神經元病理特點。參照文獻［14］中的方法對神經元病理改變進行分級：神經元形態和結構正常為（－），少量神經元形態改變為（＋），部分神經元胞核固縮或溶解、神經元排列疏松為（＋＋），大部分神經元胞核固縮或溶解、神經元層次紊亂為（＋＋＋）。

1.4.3透射電子顯微鏡觀察海馬CA1區神經元超微結構

末次給藥24 h后，各組分別選取10只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，取腦組織并剝取海馬，切取海馬CA1區域修飾成1 mm3小塊后置于4 ℃、3%戊二醛溶液固定2 h，經梯度乙醇脫水、環氧丙烷置換、環氧樹脂浸潤包埋、60 nm超薄切片后，行醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，之后通過透射電子顯微鏡觀察海馬CA1區神經元超微結構變化。

1.4.4海馬組織SOD、GSH-Px活性、MDA含量及TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測

分別取各組剩余的10只大鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，冰上取腦組織并剝取海馬體，剪碎后加入6倍量4 ℃裂解液研磨勻漿，4 ℃、2 000 r/min離心5 min取上清液，按照試劑盒說明檢測SOD、GSH-Px活性，MDA含量和TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.4.5RT-PCR法檢測海馬神經元Nrf2、HO-1 mRNA表達

取海馬神經元裂解勻漿液100 mg，采用總RNA提取試劑盒分離純化總RNA，通過核酸分析儀檢測RNA濃度和純度，采用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA后，進行RT-PCR擴增，程序設置為94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共進行40個循環，然后通過凝膠分析儀成像。目的基因的相對表達量采用2－ΔΔCt法計算（以β-actin為內參）。Nrf2、HO-1、β-actin的RT-PCR引物序列見表1。

1.4.6蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測海馬神經元Nrf2、HO-1、胞漿NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白表達

取海馬神經元100 mg，按照胞漿胞核蛋白提取試劑盒操作說明制備胞漿胞核蛋白，二奎啉甲酸（BCA）法測定總蛋白含量和沸水浴變性，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白、聚偏氟乙烯（PVDF）轉膜、5%脫脂奶粉封閉處理后，滴加Nrf2抗體（1∶500）、HO-1抗體（1∶500）、NF-κB p65（1∶800）、β-actin抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，滴加IgG二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，滴加ECL顯影后通過Image J軟件計算蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶與β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.5統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；病理分級為等級資料，多組間平均秩次比較采用Kruskall-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組大鼠海馬CA1區神經元病理改變及病理分級比較

HE染色結果顯示，正常組海馬CA1區神經元形態呈圓形或橢圓形，排列整齊，層次清晰；與正常組比較，模型組海馬CA1區神經元數量明顯減少，形態呈三角形或不規則多邊形，排列紊亂，層次不清，胞體固縮深染等病理改變；與模型組比較，APS-L組、APS-M組、APS-H組和吡拉西坦片組海馬CA1區神經元病理學改變呈不同程度減輕，APS-H組改善效果優于其他組。與正常組比較，模型組病理分級明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，APS-M、APS-H組和吡拉西坦片組病理分級明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；隨APS劑量升高病理分級降低，APS-L組、APS-M組、APS-H組間病理分級差異有統計學意義（P＜0.05）；與吡拉西坦片組比較，APS-H組病理分級明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖1、表2。

2.2各組大鼠海馬CA1區神經元超微結構改變比較

透射電子顯微鏡下觀察發現，正常組海馬CA1區神經元染色質分布均勻，線粒體、高爾基體、粗面內質網等細胞器數量豐富、結構正常；與正常組比較，模型組海馬體CA1區神經元可見染色質凝集或溶解，線粒體腫脹、脊斷裂，高爾基體腫脹呈泡狀，粗面內質網擴張等超微結構改變；與模型組比較，APS-L組、APS-M組、APS-H組和吡拉西坦片組海馬體CA1區神經元染色質及各細胞器超微結構損傷不同程度減輕，APS-H組效果最為明顯。詳見圖2。

2.3各組大鼠海馬組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較

與正常組比較，模型組海馬組織SOD、GSH-Px活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，APS-M組、APS-H組和吡拉西坦片組SOD、GSH-Px活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；隨APS劑量升高SOD、GSH-Px活性升高且MDA含量降低，APS-L組、APS-M組、APS-H組SOD、GSH-Px活性及MDA含量差異均具有統計學意義（P＜0.05）；與吡拉西坦片組比較，APS-H組SOD、GSH-Px活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見表3。

2.4各組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

與正常組比較，模型組海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，APS-M組、APS-H組和吡拉西坦片組TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；隨APS劑量升高TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，APS-L組、APS-M組、APS-H組TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異均具有統計學意義（P＜0.05）；與吡拉西坦片組比較，APS-H組TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見表4。

2.5各組大鼠海馬神經元Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表達比較

與正常組比較，模型組海馬神經元Nrf2、HO-1 mRNA表達量和蛋白表達量明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，APS-M、APS-H組和吡拉西坦片組Nrf2、HO-1 mRNA表達量和蛋白表達量明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；隨APS劑量升高Nrf2、HO-1 mRNA表達量和蛋白表達量升高，APS-L組、APS-M組、APS-H組、Nrf2、HO-1 mRNA表達量和蛋白表達量差異均有統計學意義（P＜0.05）；與吡拉西坦片組比較，APS-H組Nrf2、HO-1 mRNA表達量和蛋白表達量明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖3、圖4、表5。

2.6各組大鼠海馬神經元胞漿NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白表達比較

與正常組比較，模型組海馬神經元胞核NF-κB p65蛋白表達量及胞核NF-κB p65/胞漿NF-κB p65明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，APS-M組、APS-H組和吡拉西坦片組胞核NF-κB p65蛋白表達量及胞核NF-κB p65/胞漿NF-κB p65降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；隨APS劑量升高胞核NF-κB p65蛋白表達量及胞核NF-κB p65/胞漿NF-κB p65降低，APS-L組、APS-M組、APS-H組NF-κB p65蛋白表達量和胞核NF-κB p65/胞漿NF-κBp65差異均具有統計學意義（P＜0.05）；與吡拉西坦片組比較，APS-H組胞核NF-κB p65蛋白表達量及胞核NF-κB p65/胞漿NF-κB p65明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖5、表6。

3討論

AD是誘發老年癡呆的主要原因，其全球致死率居疾病譜第4位，僅次于心血管疾病、腫瘤和腦卒中，嚴重影響老年人的生活質量和生命健康［15］。目前，臨床治療AD主要采取膽堿酯酶抑制劑（多奈哌齊、卡巴拉汀）、N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑（美金剛）等藥物治療，預后不甚理想［16］。近年來，病理學研究發現，β淀粉樣蛋白（Aβ）病理性沉積是AD主要的病理學改變，而氧化應激和炎癥反應在其病變過程中發揮著重要作用［17-18］。因此，探索以抑制氧化應激和炎癥反應為治療靶點的新型藥物，對改善AD療效具有重要意義。

雙側海馬定向注射Aβ1～42制備AD大鼠模型的方法具有操作簡單、重復性好、與人類AD病理特點近似等優勢，是國內外普遍認可的造模方法［19］。吡拉西坦片是一種神經細胞保護劑，對AD所致認知障礙、思維功能減退等具有明顯改善作用，常用做AD新型藥物實驗研究的陽性對照藥物［20］。APS已被國內外大量研究證實具有抗氧化、抗炎等多種藥理學作用［6-8］。本研究結果顯示，AD模型大鼠大腦海馬CA1區呈現神經元數量減少、形態改變、排列紊亂、層次不清、胞核固縮深染等病理改變，染色質及線粒體、高爾基體、粗面內質網等細胞器超微結構病變，與宋彥等［12］研究報道一致。經APS干預則能夠明顯改善AD大鼠海馬CA1區神經元病變及染色質、細胞器等超微結構病變，APS上述作用具有劑量依賴性，且APS-H組作用優于吡拉西坦片組，提示APS對AD大鼠海馬神經元損傷具有劑量依賴性的保護作用。

海馬CA1區是學習認知、記憶形成轉存等過程的關鍵部位，該部位對氧化應激和炎癥反應異常敏感［21］。Aβ沉積誘發炎性因子大量釋放而引發炎癥反應，其中具有趨化因子屬性的TNF-α、IL-1β、IL-6能夠刺激粒細胞等進一步釋放炎性因子而加重炎癥反應［22-23］。Li等［24］研究發現，Aβ沉積導致活性氧（ROS）大量生成，致使SOD、GSH-Px等抗氧化酶過度消耗，不能及時清除的ROS將攻擊生物膜和生物大分子引發氧化應激損傷并誘發細胞凋亡［25］。Nrf2普遍存在于真核細胞中，能夠誘導SOD、GSH-Px等抗氧化酶表達而抑制氧化應激，并且Nrf2能夠誘導HO-1轉錄與表達，HO-1則能夠催化血紅素分解成亞鐵、一氧化碳、膽綠素，其中膽綠素對ROS具有較強的還原活性，從而降低氧化應激損傷［26］。NF-κB是一種以p50/p65二聚體形式存在的核轉錄因子，生理狀態下與特異性酶抑制劑結合而無生理活性；病理狀態下，ROS等將誘導NF-κB與酶抑制劑解離而使其活化，核轉位后p65亞基與DNA特異性位點結合而誘導炎性因子表達與釋放，進而加重炎癥反應［27］。HO-1則能夠抑制NF-κB活化與核轉位，從而間接抑制機體炎癥反應［28］。本研究發現，經APS治療能夠明顯提高AD大鼠大腦海馬組織SOD、GSH-Px活性并降低MDA含量，降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平，提高Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表達量，降低胞核NF-κB p65蛋白表達量及胞核NF-κB p65/胞漿NF-κB p65，APS上述作用具有劑量依賴性，且APS-H組作用優于吡拉西坦片組，提示APS具有降低AD大鼠海馬神經元氧化應激和炎癥反應的作用，其作用機制可能與激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB核轉位有關。

綜上所述，APS對AD大鼠海馬神經元損傷具有保護作用，該作用具有一定的劑量依賴性，其機制可能與激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB核轉位，進而抑制氧化應激和炎癥反應有關。

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（收稿日期：2021-11-29）

（本文編輯鄒麗）