TBX5-AS1調控miR-363-3p促進膠質瘤細胞增殖、侵襲的機制研究

摘要目的：探討長鏈非編碼RNA（lncRNA）T-box轉錄因子5反義RNA1（TBX5-AS1）調控微小RNA-363-3p（miR-363-3p）對膠質瘤細胞增殖和侵襲的影響。方法：體外培養A172細胞，并分為Control組、si-NC組、si-TBX5-AS1組、si-TBX5-AS1＋miR-NC inhibitor組和si-TBX5-AS1＋miR-363-3p inhibitor組。定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測不同細胞［人腦膠質瘤細胞A172、U251、T98G、U87-MG及正常星形膠質細胞（NHA）］及各組A172細胞中TBX5-AS1和miR-363-3p的相對表達水平；雙熒光素酶報告基因實驗檢測TBX5-AS1和miR-363-3p的靶向調控關系；細胞計數試劑盒8（CCK-8）和集落形成實驗檢測各組A172細胞的增殖情況，Transwell實驗檢測各組A172細胞的侵襲情況；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測各組A172細胞中增殖相關蛋白和抗原（PCNA）、Ki67和侵襲相關蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達水平。結果：TBX5-AS1在膠質瘤細胞系中表達上調（P＜0.05），且在A172細胞中表達水平最高；miR-363-3p在膠質瘤細胞系中表達下調（P＜0.05），且在A172細胞中表達水平最低。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，TBX5-AS1和miR-363-3p存在靶向調控關系。與si-NC組比較，si-TBX5-AS1組A172細胞中TBX5-AS1表達水平和PCNA、Ki67、N-cadherin、Vimentin蛋白水平下調，miR-363-3p表達水平和E-cadherin蛋白水平上調（P＜0.05）；細胞增殖和侵襲能力降低（P＜0.05）。與si-TBX5-AS1＋miR-NC inhibitor組比較，si-TBX5-AS1＋miR-363-3p inhibitor組A172細胞中TBX5-AS1表達水平無明顯變化（P＞0.05）；細胞中PCNA、Ki67、N-cadherin、Vimentin蛋白水平上調，miR-363-3p表達水平和E-cadherin蛋白水平下調（P＜0.05）；細胞增殖和侵襲能力增加（P＜0.05）。結論：下調TBX5-AS1靶向負調控miR-363-3p可抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲。

關鍵詞膠質瘤；長鏈非編碼RNA T-box轉錄因子5反義RNA1；微小RNA-363-3p；細胞增殖；細胞侵襲

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.23.014

膠質瘤是常見的侵襲性較強的惡性腦瘤，因其呈浸潤性增長，手術難以完全切除，因此，膠質瘤病人的預后較差［1-2］。長鏈非編碼RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一類具有多樣性和保守性較差的非編碼RNA，可促進細胞增殖、分化等［3-4］。研究顯示，T-box轉錄因子5反義RNA1（T-box transcription factor 5 antisense RNA 1，TBX5-AS1）是一種在非小細胞肺癌中顯著低表達的lncRNA，且與淋巴結轉移和組織學分級有關，過表達的TBX5-AS1可抑制細胞增殖、侵襲，促進細胞凋亡，而TBX5-AS1沉默則表現出相反的效果［5］。微小RNAs（micrornas，miRNAs）是一類長度為22～24個核苷酸的非編碼RNA，研究顯示，miRNAs可通過抑制翻譯或降解mRNA來參與多種腫瘤的細胞增殖、侵襲等生物學過程［6-7］。此外，lncRNAs與miRNAs之間存在交叉調節［8］。已有研究發現，微小RNA-363-3p（microrna-363-3p，miR-363-3p）在膠質瘤細胞中顯著低表達可參與調控膠質瘤細胞增殖和凋亡過程［9］。本研究探討TBX5-AS1調控miR-363-3p促進膠質瘤細胞增殖、侵襲的機制。

1材料與方法

1.1材料

人腦膠質瘤細胞（A172、U251、T98G和U87-MG）和正常星形膠質細胞（normal human astrocytes，NHA）購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司，貨號分別為HT-X1719、HT-X1725、HT-X1975、HT-X1726、HT-X2408；DEME培養基購自上海LMAI公司，貨號：LM-P0523；TBX5-AS1沉默質粒（si-TBX5-AS1）及其陰性對照（si-NC）、miR-363-3抑制劑（miR-363-3p inhibitor）及其陰性對照（miR-NC inhibitor）、miR-363-3p模擬物（miR-363-3p mimics）及其陰性對照（miR-NC mimics）、TBX5-AS1野生型（TBX5-AS1-WT）及突變型（TBX5-AS1-MUT）質粒均由廣州RUIBIO公司設計并合成；脂質體2000、高效蛋白裂解液（RIPA裂解液）購自上海Solarbio公司，貨號：L7800、R0020；TRIzol試劑購自美國Invitrogen，貨號：15596-026；反轉錄試劑盒購自北京YITA公司，貨號：YT9036；SYBR Green PCR Master Mix購自美國ABI公司，貨號：4367659；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、細胞計數試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）細胞增殖檢測試劑盒、增強化學發光劑（enhanced chemilum inescence，ECL）檢測試劑盒購自南京Vazume公司，貨號：DD1204-01、A311-01、E412-01；Transwell小室購自美國BD公司，貨號：354480；一抗增殖細胞和抗原（PCNA，29 kDa）、Ki67（395 kDa）、E-cadherin（97 kDa）、N-cadherin（125 kDa）、Vimentin（53 kDa）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（37 kDa）均購自英國Abcam公司，貨號：ab92552、ab92742、ab40772、ab76011、ab92547、ab9485。7500 Real Time PCR儀購自美國Thermofisher公司；Accuris MR9600-E 96微孔板吸光度讀取器購自深圳Accuris公司；Axio Vert.A1顯微鏡購自德國ZEISS；ChemiDoc MP凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組

人腦膠質瘤細胞（A172、U251、T98G和U87-MG）和NHA在DEME培養基中培養，添加有抗生素和10%胎牛血清，常規培養，至細胞融合度＞70%時，進行傳代培養，選取傳代3次后對數期細胞進行后續研究。A172細胞分為Control組、si-NC組、si-TBX5-AS1組、si-TBX5-AS1＋miR-NC inhibitor組和si-TBX5-AS1＋miR-363-3p inhibitor組。Control組細胞不做任何處理，其余各組參照脂質體2000轉染試劑盒方法分別轉染si-NC、si-TBX5-AS1、si-TBX5-AS1和miR-NC inhibitor、si-TBX5-AS1和miR-363-3p inhibitor，繼續培養48 h后進行后續研究。

1.2.2定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測細胞中TBX5-AS1和miR-363-3p的相對表達水平

使用TRIzol試劑提取1.2.1中培養的不同細胞及各組A172細胞總RNA，經反轉錄試劑盒轉化為cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix和Real Time PCR儀進行qRT-PCR檢測，所有操作均嚴格按照說明書方法進行。經2－△△Ct測定TBX5-AS1和miR-363-3p的相對表達水平。GAPDH對TBX5-AS1水平進行歸一化，U6對miR-363-3p水平進行歸一化。引物序列：TBX5-AS1正向為5′-GCAAAACGTACCGCGTAGAC-3′，反向為5′-GATGCCGGAGAAAGGAACCA-3′；GAPDH正向為5′-GAGAAGTATGACAACAGCCTC-3′，反向為5′-ATGGACTGTGGTCATGAGTC-3′；miR-363-3p正向為5′-GCGGCCAATTGCACGGTAT-3′，反向為5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6正向為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3生物信息學預測和雙熒光素酶報告基因分析TBX5-AS1和miR-363-3p的靶向關系

Starbase網站（https：//starbase.sysu.edu.cn/）預測TBX5-AS1與miR-363-3p之間的結合位點。雙熒光素酶報告基因檢測進一步驗證：聚合酶鏈式反應（PCR）擴增片段TBX5-AS1-WT或TBX5-AS1-MUT基因片段，并將其克隆到熒光素酶報告基因載體pGL3中；當A172細胞生長融合度＞70%時，使用脂質體2000將重組質粒分別與miR-NC mimics（miR-NC mimics組）或miR-363-3p mimics（miR-363-3p mimics組）共同轉染細胞，48 h后使用雙熒光素酶報告基因系統檢測相對熒光素酶活性。

1.2.4CCK-8檢測各組A172細胞的增殖活力

將按照1.2.1轉染的各組A172細胞，按照每孔5×103個的密度接種到96孔細胞培養板中，培養48 h后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液后，孵育4 h，使用96微孔板吸光度讀取器在480 nm處檢測各孔細胞的吸光度值（OD值），OD值即表示細胞增殖活力。

1.2.5集落形成實驗檢測各組A172細胞的集落形成數量

將按照1.2.1轉染培養的各組A172細胞按照每個培養皿1×102個接種于細胞培養皿中，輕輕晃動培養皿，使細胞均勻分散，正常培養2～3周，其間根據培養液pH值的變化更換培養基，直至出現肉眼可見的克隆時，終止培養。固定細胞后使用Giemsa染色10 min，在顯微鏡下拍照并統計各皿A172細胞集落形成數量。

1.2.6Transwell實驗檢測各組A172細胞的侵襲情況

將按照1.2.1轉染的各組A172細胞使用無血清的培養基稀釋后，按照每孔1×105個的密度接種到Matrigel包被的Transwell小室，下室中添加正常培養基作為誘導劑，24 h后固定細胞，使用0.5%結晶紫染色后在顯微鏡下拍照并統計侵襲細胞數量。

1.2.7蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測各組A172細胞中PCNA、Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白水平

收集按照1.2.1轉染培養的各組細胞，使用吐溫-20-三羥甲基氨基甲烷鹽緩沖液（tris-buffered saline withTween-20，TBST）洗滌后在添加蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解，離心后收集上清液，使用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經煮沸變性后，在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中電泳分離后轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，使用5%牛血清清蛋白溶液（BSA）室溫封閉1 h后，添加一抗PCNA、Ki67、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及GAPDH（稀釋比例1∶1 000）在4 ℃過夜孵育，使用TBST沖洗后，分別與辣根過氧化物酶標記的二抗（稀釋比例1∶5 000）在室溫下孵育2 h，通過ECL發光液顯影后拍照，使用Image J軟件檢測各組蛋白條帶的灰度值。目的蛋白的相對表達量＝目的蛋白的灰度值/內參蛋白的灰度值。

1.3統計學處理

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1TBX5-AS1和miR-363-3p在不同細胞系中的相對表達水平

與NHA細胞比較，TBX5-AS1在膠質瘤細胞系（A172、U251、T98G和U87-MG）中表達上調（P＜0.05），且在A172細胞中表達水平最高；miR-363-3p在膠質瘤細胞系（A172、U251、T98G和U87-MG）中表達下調（P＜0.05），且在A172細胞中表達水平最低。故而后續選擇A172細胞作為研究對象。詳見表1。

2.2TBX5-AS1與miR-363-3p靶向關系驗證

Starbase網站預測發現，TBX5-AS1與miR-363-3p存在靶向互補結合位點（見圖1）。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與miR-NC mimics組比較，轉染TBX5-AS1-WT可明顯降低miR-363-3p mimics組細胞中相對熒光素酶活性（P＜0.05），而TBX5-AS1-MUT則對miR-363-3p mimics組細胞中相對熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05）。詳見表2。

2.3各組A172細胞中TBX5-AS1和miR-363-3p表達水平及增殖能力變化情況

與si-NC組比較，si-TBX5-AS1組A172細胞中TBX5-AS1表達水平下調，miR-363-3p表達水平上調（P＜0.05）；細胞增殖活力和集落形成能力降低（P＜0.05）。與si-TBX5-AS1＋miR-NC inhibitor組比較，si-TBX5-AS1＋miR-363-3p inhibitor組A172細胞中TBX5-AS1表達水平變化差異無統計學意義（P＞0.05），miR-363-3p表達水平下調（P＜0.05）；細胞增殖活力和集落形成能力增加（P＜0.05）。而si-NC組和Control組、si-TBX5-AS1＋miR-NC inhibitor組和si-TBX5-AS1組細胞中TBX5-AS1和miR-363-3p表達水平及增殖能力的變化比較差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖2、表3。

2.4各組A172細胞侵襲能力變化情況

與si-NC組比較，si-TBX5-AS1組A172細胞侵襲數量減少（P＜0.05）。與si-TBX5-AS1＋miR-NC inhibitor組比較，si-TBX5-AS1＋miR-363-3p inhibitor組A172細胞侵襲數量增加（P＜0.05）。而si-NC組和Control組、si-TBX5-AS1＋miR-NC inhibitor組和si-TBX5-AS1組細胞侵襲數量變化比較差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖3、表4。

2.5各組A172細胞中PCNA、Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白水平變化情況

與si-NC組比較，si-TBX5-AS1組A172細胞中PCNA、Ki67、N-cadherin及Vimentin蛋白水平下調，E-cadherin蛋白水平上調（P＜0.05）。與si-TBX5-AS1＋miR-NC inhibitor組比較，si-TBX5-AS1＋miR-363-3p inhibitor組A172細胞中PCNA、Ki67、N-cadherin及Vimentin蛋白水平上調，E-cadherin蛋白水平下調（P＜0.05）。而si-NC組和Control組、si-TBX5-AS1＋miR-NC inhibitor組和si-TBX5-AS1組細胞中PCNA、Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白水平變化差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖4、表5。

3討論

近年來，lncRNAs因其在癌癥進展中的調節作用而受到越來越多的關注。一些lncRNAs在膠質瘤組織和細胞中異常表達，并參與膠質瘤的發展［10］，lncRNA CASC2在神經膠質瘤細胞中低表達，且與神經膠質瘤的病理分級和淋巴結轉移相關，參與調控腫瘤細胞的生物學行為［11］；lncRNA-LINC01116在膠質瘤組織和細胞中上調，并在細胞增殖、細胞周期、遷移、侵襲和血管生成中發揮重要作用［12］。本研究對TBX5-AS1的功能進行研究，發現TBX5-AS1在膠質瘤細胞系中表達上調，這與之前研究證實的TBX5-AS1在非小細胞肺癌中下調的趨勢不同，表明TBX5-AS1在不同的腫瘤中可能發揮不同的作用。為了進一步探討TBX5-AS1在膠質瘤細胞中的作用［5］，本研究選擇在膠質瘤細胞系中表達水平最高的A172細胞作為研究對象，結果表明，TBX5-AS1的沉默可抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲，同時，上調E-cadherin蛋白水平，下調細胞中PCNA、Ki67、N-cadherin及Vimentin蛋白水平。研究顯示，PCNA、Ki67是細胞增殖標志物，PCNA是DNA復制和DNA修復必需的物質，Ki67僅在細胞增殖期的細胞核中表達，二者的表達水平與細胞增殖能力密切相關［13］。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin是經典的上皮間質轉化標志物，E-cadherin上調，N-cadherin和Vimentin下調是抑制腫瘤侵襲轉移的重要機制之一［14］。結合本研究結果，推測沉默TBX5-AS1可通過影響增殖、侵襲相關蛋白的表達，抑制膠質瘤細胞增殖和侵襲。

越來越多的研究證實，lncRNAs可作為內源性RNA與miRNA競爭性結合，從而調控mRNAs的水平［15］。lncRNA BCYRN1可通過與miR-619-5p競爭性結合，從而調控CUEDC2表達和PTEN/蛋白激酶B（AKT）/p21通路來抑制膠質瘤細胞惡性生物學行為［16］。在本研究中，通過生物信息學分析發現，TBX5-AS1和miR-363-3p可能存在相互作用；經雙熒光素酶報告基因實驗驗證了二者存在負靶向關系；進一步證實，沉默TBX5-AS1可上調miR-363-3p的表達水平，而miR-363-3p表達則對TBX5-AS1的表達水平無明顯影響，表明在A172細胞中，TBX5-AS1直接負靶向調控miR-363-3p表達。因此，TBX5-AS1可能作為miR-363-3p的海綿在膠質瘤細胞增殖和侵襲中發揮作用。此外，本研究還顯示，抑制miR-363-3p表達可部分逆轉沉默TBX5-AS1對膠質瘤細胞的生物學效應。研究顯示，在肺腺癌細胞中，miR-363-3p可直接靶向調控PCNA抑制腫瘤生長［17］。此外，在結直腸癌中，miR-363-3p可直接靶向SRY相關高遷移率族蛋白框4（SOX4）抑制癌細胞的上皮間質轉化和轉移［18］。結合本研究結果，推測miR-363-3p可逆轉沉默TBX5-AS1對膠質瘤細胞增殖和侵襲的抑制作用，可能是通過直接靶向PCNA、SOX4發揮作用的。

綜上所述，TBX5-AS1可能作為miR-363-3p的海綿促進細胞增殖和侵襲。但本研究尚存在一定的不足，本研究并未在動物模型體內驗證此結論，且并未探究miR-363-3p是通過調控哪些靶基因逆轉沉默TBX5-AS1對膠質瘤細胞生物學效應影響的，因此，后續將重點探討這兩個研究方向。

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（收稿日期：2021-11-04）

（本文編輯鄒麗）