基于PI3K/AKT/GSK3β通路探討黨參多糖對Ⅰ型單純皰疹病毒性腦炎小鼠神經(jīng)功能的影響及腦保護作用

摘要目的：觀察黨參多糖對Ⅰ型單純皰疹病毒性腦炎（HSE）小鼠神經(jīng)功能的影響及腦保護作用，并探究可能機制。方法：取全部50只巴比賽（BALB/c）小鼠，其中40只小鼠建立Ⅰ型HSE模型，除去試驗過程中死亡小鼠，剩余30只隨機分為HSV-Ⅰ組、黨參多糖組、聯(lián)合組，每組10只；另剩10只小鼠設(shè)為健康組。建模結(jié)束次日，聯(lián)合組小鼠灌胃黨參多糖（100 mg/kg），腹腔注射LY294002［磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/糖原合成酶激酶3β（GSK3β）抑制劑］30 mg/kg；黨參多糖組小鼠灌胃黨參多糖（100 mg/kg），腹腔注射等體積二甲基亞砜（DMSO）；健康組、HSV-Ⅰ組小鼠灌胃等量生理鹽水，腹腔注射等體積DMSO。每日1次，持續(xù)7 d。檢測血清炎性因子、氧化應激因子水平及神經(jīng)功能指標；檢測腦、肝、肺組織病毒滴度；免疫印跡法檢測腦組織AKT、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、GSK3β、磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK3β）蛋白表達。結(jié)果：與HSV-Ⅰ組比較，黨參多糖組血清白介素-1β（IL-1β）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、活性氧簇（ROS）、干擾素γ（IFN-γ）、鈣結(jié)合蛋白（S-100B）水平降低，超氧化物歧化酶（SOD）活性水平、腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β升高，腦、肝、肺組織病毒滴度均降低（P＜0.05）；與黨參多糖組比較，聯(lián)合組血清IL-1β、NO、MDA、ROS、IFN-γ、S-100B水平升高，SOD活性水平、腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β降低，腦、肝、肺組織病毒滴度均升高（P＜0.05）。結(jié)論：黨參多糖可抑制炎癥及氧化應激反應、減輕神經(jīng)組織及腦組織損傷、抑制HSV-Ⅰ病毒復制，推測其作用機制與激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞Ⅰ型單純皰疹病毒性腦炎；黨參多糖；蛋白激酶B；糖原合成酶激酶3β

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.23.013

Effect of Codonopsis Pilosula Polysaccharide on Neurological Function and Cerebral Protection in Mice with Type Ⅰ Herpes Simplex Virus Encephalitis Based on PI3K/AKT/GSK3β Pathway

HUANG Hong， AN Juyan， FAN Xinli

General Hospital of Jizhong Energy Fengfeng Group Co.， Ltd. ， Handan 056000， Hebei， China， E-mail： i1n6wk@163.com

AbstractObjective：To observe the effect of codonopsis pilosula polysaccharide on the neurological function and cerebral protection of type I herpes simplex encephalitis（HSE） mice，and to explore the possible mechanism.Methods：All 50 BALB/c mice and 40 mice were selected to establish the type Ⅰ HSE model.Excluding the mice that died during the experiment，the remaining 30 mice were randomly divided into HSV-Ⅰ group，codonopsis pilosula polysaccharide group and combined group，with 10 mice in each group.The other 10 mice were set as the healthy group.At the day after modeling，mice in the combined group were gavaged with codonopsis pilosula polysaccharide（100 mg/kg） and intraperitoneally injected with LY294002 ［phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/protein kinase B（AKT）/glycogen synthase kinase 3β（GSK-3β） inhibitor］30 mg/kg.The mice in the codonopsis pilosula polysaccharide group were intragastrically administered with codonopsis pilosula polysaccharide（100 mg/kg），and an equal volume of dimethyl sulfoxide（DMSO） was injected intraperitoneally.The mice in the healthy group and HSV-Ⅰ group were intragastrically injected with the same volume of normal saline and intraperitoneally injected with the same volume of DMSO.Once a day for 7 days.Serum levels of inflammatory factors，oxidative stress factors and neurological function indexes were tested.Virus titers in brain，liver and lung tissues were tested.Western Blot was used to detect the expression of AKT，p-AKT，GSK3β，and p-GSK3β proteins in cerebral tissue.Results：Compared with the HSV-Ⅰ group，the serum interleukin-1β（IL-1β），nitric oxide（NO），malondialdehyde（MDA），reactive oxygen species（ROS），interferon γ（IFN-γ），and calcium binding protein（S-100B） level" decreased，superoxide dismutase（SOD） activity level，cerebral tissue p-AKT/AKT，p-GSK3β/GSK3β" increased，brain，liver，and lung tissue virus titers decreased in the codonopsis pilosula polysaccharide group（P＜0.05）.Compared with the codonopsis pilosula polysaccharide group，serum IL-1β，NO，MDA，ROS，IFN-γ，and S-100B levels increased，SOD activity level，brain tissue p-AKT/AKT，p-GSK3β/GSK3β" decreased，brain，liver and lung tissue virus titers increased in the combined group（P＜0.05）.Conclusion：Codonopsis pilosula polysaccharide can inhibit inflammation and oxidative stress，reduce nerve and cerebral tissue damage，and inhibit HSV-Ⅰ virus replication.It is speculated that its mechanism of action is related to the activation of PI3K/AKT/GSK3β signaling pathway.

Keywordstype Ⅰ herpes simplex virus encephalitis; codonopsis pilosula polysaccharide; protein kinase B; glycogen synthase kinase 3β

單純皰疹病毒性腦炎（herpes simplex virus encephalitis，HSE）是臨床常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染性疾病，由單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）引發(fā)，絕大多數(shù)為Ⅰ型病毒感染，各年齡段人群均有發(fā)生，以發(fā)病急、進展迅速、病死率高、預后差為主 要特征［1］。目前，臨床多采用抗病毒藥物治療HSE，如阿昔洛韋、阿糖腺苷，從而抑制病毒復制，效果顯著，但其腎毒性及易產(chǎn)生HSV耐藥的缺點限制了其應用范圍［2］。黨參多糖是傳統(tǒng)中藥黨參的主要有效成分之一，其可調(diào)節(jié)機體免疫，清除氧自由基，提升骨髓造血功能［3］。研究表明，黨參多糖可減輕氧化應激反應、改善神經(jīng)功能，從而對缺血性腦損傷小鼠產(chǎn)生腦保護作用［4］。本研究通過建立Ⅰ型HSE小鼠模型，觀察黨參多糖對HSE小鼠的治療作用，并探討相關(guān)機制。

1材料與方法

1.1實驗動物

無特定病原體（SPF）級6周齡巴比賽（BALB/c）雄性小鼠50只，體質(zhì)量（19±1）g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（滬）2018-0004。

1.2藥物、主要試劑、儀器

黨參多糖（純度為98%）購于上海烜雅生物科技有限公司，HSV-Ⅰ病毒懸液購于深圳海思安生物技術(shù)有限公司，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatei-dylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）抑制劑LY294002、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、干擾素γ（interferon-gamma，IFN-γ）試劑盒、鈣結(jié)合蛋白B（S100 calciumbinding protein B，S-100B）試劑盒均購于上海滬震實業(yè)有限公司，聚合酶鏈式反應（PCR）擴增試劑盒購于上海谷研實業(yè)有限公司，兔抗小鼠AKT、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-AKT）、GSK3β、磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK3β）一抗購于英國Abcam公司。

Labserv K3酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)），Bioscience紫外透射儀（上海信裕生物科技有限公司生產(chǎn)），DM750顯微鏡（德國Leica公司生產(chǎn)），Gel Doc凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司生產(chǎn)）。

1.3Ⅰ型HSE模型建立［5］

小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉深度麻醉，采用顱內(nèi)注射法于小鼠右側(cè)眼角與耳根連線中心處進針2 mm，推入HSV-Ⅰ病毒懸液20 μL（10－4半數(shù)感染量劑量的病毒），拔出針頭，棉球輕壓防止泄露。實驗結(jié)束后以小鼠腦組織病理變化判定是否建模成功（鏡下可見神經(jīng)元腫脹壞死、間質(zhì)水腫、炎性浸潤則建模成功）。

1.4分組及干預［6-7］

40只小鼠建立Ⅰ型HSE模型，除去試驗過程中死亡小鼠，剩余30只隨機分為HSV-Ⅰ組、黨參多糖組、聯(lián)合組，每組10只；另剩10只小鼠同位置注射20 μL生理鹽水，設(shè)為健康組。建模結(jié)束后次日，聯(lián)合組小鼠給予黨參多糖（溶于生理鹽水中）100 mg/kg灌胃，2 h后腹腔注射LY294002［溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中］30 mg/kg，每日1次；黨參多糖組小鼠給予黨參多糖（溶于生理鹽水中）100 mg/kg灌胃，2 h后腹腔注射等體積DMSO，每日1次；健康組、HSV-Ⅰ組小鼠給予等量生理鹽水灌胃，2 h后腹腔注射等體積DMSO，每日1次。各組均連續(xù)干預7 d。

1.5組織取材

末次干預結(jié)束后，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，低溫離心機3 000 r/min離心8 min（離心半徑10 cm），取上清，分成3份，置于－80 ℃冰箱中冷凍保存，分別用于炎性因子、氧化應激因子及神經(jīng)功能指標檢測。取血后頸椎脫臼處死小鼠，冰上開腹，取出完整大腦及肝臟、肺部，取部分腦、肝、肺組織，冷凍保存用于病毒滴度測試。另取部分腦組織分成，一部分投入4%多聚甲醛固定24 h，脫水、浸蠟、包埋，切為4 μm病理切片用于組織病理觀察；一部分置于－80 ℃冰箱中冷凍保存，用于免疫印跡實驗。

1.6血清炎性因子水平檢測

取冷凍保存的腹主動脈血清，室溫解凍，采用酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測血清中神經(jīng)功能指標IL-1β、NO水平，根據(jù)試劑盒說明書設(shè)計操作步驟，經(jīng)酶標儀測定570 nm波長除吸光度（OD值），繪制曲線計算IL-1β、NO濃度。

1.7血清氧化應激因子水平檢測

按照各個試劑盒說明書要求設(shè)計操作實驗步驟，使用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法檢測血清MDA水平，化學熒光法檢測血清ROS水平，羥胺法檢測血清SOD活性水平。

1.8血清神經(jīng)功能指標檢測

ELISA法檢測血清中炎性因子IFN-γ、S-100B水平，根據(jù)試劑盒說明書設(shè)計操作步驟，經(jīng)酶標儀測定570 nm波長處OD值，繪制曲線計算IFN-γ、S-100B濃度。

1.9腦、肝、肺組織中病毒滴度檢測

取冷凍保存的腦、肝、肺組織，分別用眼科剪剪碎，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）勻漿，注入離心管內(nèi)，低溫離心機8 000 r/min離心10 min（離心半徑12 cm），取上清，經(jīng)酚氯仿法提取DNA，PCR擴增后行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶（ethidium bromide，EB）染色后，經(jīng)紫外透射儀對比標準分子量，計算出小鼠腦、肝、肺組織中病毒滴度。

1.10蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腦組織病理學改變

取腦組織切片，二甲苯脫蠟，水化，蘇木素浸泡8 min，蒸餾水沖洗，1%鹽酸乙醇分化，蒸餾水沖洗，經(jīng)1%NaHCO3漂洗至藍紫色，放入伊紅染色液中浸染1 min，常規(guī)脫水、透明后，加入封片劑封固，置于光鏡下觀察腦組織病理學變化，并拍照記錄。

1.11免疫印跡法檢測腦組織AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白表達量

取冷凍保存的腦組織，研磨器充分研磨，勻漿器勻漿，加入放射免疫沉淀分析法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解細胞，注入離心管內(nèi)，4 ℃下10 000 r/min離心10 min（離心半徑12 cm），經(jīng)二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定總蛋白并定量。取50 μg樣本蛋白，混合4倍體積上樣緩沖液，恒壓下行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉2 h，含有吐溫-20的Tris緩沖鹽水（Tris-buffered saline containing Tween-20Tris-buffered saline，TBST）洗膜，加入兔抗小鼠AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β一抗（1∶500），4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，加入電化學發(fā)光（electochemiluminescence，ECL）液，置于暗盒中顯影，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值，以AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值之比表示AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β相對蛋白表達量。

1.12統(tǒng)計學處理

采用SPSS 24.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組資料比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠血清IL-1β、NO水平比較

與健康組比較，HSV-Ⅰ組血清IL-1β、NO水平升高（P＜0.05）；與HSV-Ⅰ組比較，黨參多糖組血清IL-1β、NO水平降低（P＜0.05）；與黨參多糖組比較，聯(lián)合組血清IL-1β、NO水平升高（P＜0.05）。詳見表1。

2.2各組小鼠血清MDA、ROS、SOD水平比較

與健康組比較，HSV-Ⅰ組血清MDA、ROS水平升高，SOD活性水平降低（P＜0.05）；與HSV-Ⅰ組比較，黨參多糖組血清MDA、ROS水平降低，SOD活性水平升高（P＜0.05）；與黨參多糖組比較，聯(lián)合組血清MDA、ROS水平升高，SOD活性水平降低（P＜0.05）。詳見表2。

2.3各組小鼠血清IFN-γ、S-100B水平比較

與健康組比較，HSV-Ⅰ組血清IFN-γ、S-100B水平升高（P＜0.05）；與HSV-Ⅰ組比較，黨參多糖組血清IFN-γ、S-100B水平降低（P＜0.05）；與黨參多糖組比較，聯(lián)合組血清IFN-γ、S-100B水平升高（P＜0.05）。詳見表3。

2.4各組小鼠腦、肝、肺組織中病毒滴度比較

與HSV-Ⅰ組比較，黨參多糖組腦、肝、肺組織病毒滴度均降低（P＜0.05）；與黨參多糖組比較，聯(lián)合組腦、肝、肺組織病毒滴度均升高（P＜0.05）。詳見表4。

2.5各組小鼠腦組織病理學改變

HE染色結(jié)果顯示，健康組小鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常，胞核染色清晰；HSV-Ⅰ組小鼠腦組織腫脹明顯，可見大量神經(jīng)元腫脹壞死，胞核染色加深，炎性細胞浸潤明顯；黨參多糖組、聯(lián)合組小鼠腦組織腫脹程度減輕，部分神經(jīng)元變性壞死，炎性細胞浸潤減少，黨參多糖組病理改善更加明顯。詳見圖1。

2.6各組小鼠腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β比較

與健康組比較，HSV-Ⅰ組腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β降低（P＜0.05）；與HSV-Ⅰ組比較，黨參多糖組腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β升高（P＜0.05）；與黨參多糖組比較，聯(lián)合組腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β降低（P＜0.05）。詳見表5、圖2。

3討論

Ⅰ型HSE是成年人中較常見的非流行性腦炎，潛伏期較長，以HSV-Ⅰ病毒入侵大腦額葉、顳葉及其邊緣組織，誘發(fā)腦組織出血性壞死為主要病理特征，是一種嚴重的腦實質(zhì)炎癥性病變［8］。Ⅰ型HSE臨床表現(xiàn)為高熱、頭痛、意識障礙、幻覺、癲癇、人格改變，多為相應神經(jīng)系統(tǒng)功能不同程度損傷表現(xiàn)，即使抗病毒治療后，仍常遺留嚴重后遺癥［9］。目前，關(guān)于HSE的發(fā)病機制尚未完全闡明，多認為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫損傷、HSV免疫逃逸，過度氧化應激及炎癥反應、宿主細胞凋亡等有關(guān)，其中免疫增強誘發(fā)過度氧化應激及炎癥反應被廣泛認可［10］。HSV-Ⅰ入侵細胞后迅速蔓延，刺激機體過度免疫應答，淋巴細胞活化產(chǎn)生炎性因子，參與腦組織破壞，引發(fā)氧化應激并刺激炎癥反應發(fā)生，大量氧自由基使腦細胞膜脂質(zhì)過氧化，進一步加重組織損傷［11］。因此，尋找高效、不易產(chǎn)生耐藥性的抑制氧化應激反應及炎癥的新藥物或手段是治療Ⅰ型HSE的關(guān)鍵。IFN-γ是免疫細胞分泌的調(diào)控蛋白，可增強機體抗病毒能力，其水平可反映神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度，S-100B是大腦組織廣泛存在的鈣結(jié)合蛋白，腦損傷后釋放入血，是一種特異性較高的腦損傷標志物［12］。中醫(yī)根據(jù)HSE的發(fā)病特征，將其歸屬于“溫病”范疇，其病位在腦、肺、腎、脾、肝，主要病機為正氣虛弱、邪毒入侵、郁而化熱、內(nèi)津損耗、熱盛生痰、痰熱毒邪、肝風內(nèi)動，繼而內(nèi)損臟器、上攻清竅、腦神痹阻、發(fā)為此病，虛證為其主要病理因素，故應以補氣生津、豁痰開竅為主［13］。黨參是中醫(yī)臨床常用補益中藥，取自桔梗科植物黨參、川黨參及素花黨參干燥根，性平，味甘，歸脾經(jīng)、肺經(jīng)，可益氣，補中，生津，張德裕在《本草正義》中指出，黨參可補脾養(yǎng)胃，潤肺生津，腱運中氣，健脾運而不燥，滋胃陰而不濕，潤肺而不犯寒涼，鼓舞清陽，振動中氣，無剛燥之弊［14］。植物多糖是近年來較受關(guān)注的一種天然活性大分子，具有抗癌、抗病毒、降血糖、降血脂等多種生物保健功能，現(xiàn)已成為多種新型藥物的研究方向，黨參多糖是黨參中含量最高的一種植物多糖［15］。Wan等［16］研究顯示，黨參多糖可減弱β淀粉樣蛋白神經(jīng)毒性造成的大腦海馬區(qū)病理損傷，改善老年癡呆淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）/早老素1（presenilins-1，PS1）雙轉(zhuǎn)基因小鼠認知功能，提示黨參多糖對大腦組織及神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用。本研究結(jié)果顯示，與HSV-Ⅰ組比較，黨參多糖組血清IL-1β、NO、MDA、ROS、IFN-γ、S-100B水平降低，SOD活性水平升高，腦、肝、肺組織病毒滴度均降低，提示黨參多糖可抑制炎癥及氧化應激反應、減輕神經(jīng)組織及腦組織損傷、抑制HSV-Ⅰ病毒復制。

PI3K/AKT通路是調(diào)控細胞生長、增殖、凋亡等過程的重要信號通路，PI3K被細胞外信號刺激后活化，激活其下游蛋白激酶AKT，AKT是一種保守性調(diào)控因子，活化后轉(zhuǎn)移至細胞膜從而磷酸化，p-AKT通過磷酸化下游靶蛋白發(fā)揮其作用［17］。GSK3β一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT通路下游靶蛋白，主要分布于線粒體、細胞基質(zhì)及胞核內(nèi)，可被p-AKT磷酸化而失活，使線粒體膜通透性降低，氧化酶活性減弱，從而抑制細胞凋亡，保護大腦及神經(jīng)組織［18］。Chen等［19］研究顯示，激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路可緩解腦出血大鼠繼發(fā)性腦損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究結(jié)果顯示，與健康組比較，HSV-Ⅰ組腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β降低，經(jīng)黨參多糖干預后均升高，且在黨參多糖基礎(chǔ)上增用PI3K/AKT/GSK3β通路抑制劑LY294002可減弱黨參多糖對Ⅰ型HSE的治療作用。提示PI3K/AKT/GSK3β通路在Ⅰ型HSE中活性降低，黨參多糖可能通過激活該通路對Ⅰ型HSE產(chǎn)生治療作用。

綜上所述，黨參多糖可抑制炎癥及氧化應激反應，減輕神經(jīng)組織及腦組織損傷，抑制HSV-Ⅰ病毒復制，推測其作用機制與激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路有關(guān)。

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（收稿日期：2021-10-17）

（本文編輯鄒麗）