小果甜柿組織培養快繁技術

摘" " 要：【目的】建立小果甜柿組培快繁技術體系，實現小果甜柿組培苗的工廠化生產?！痉椒ā恳孕」鹗翈а磕壑ηo段為外植體，研究了外植體取材時間、滅菌方法、植物生長調節劑配比對其組織培養過程中外植體消毒、啟動培養、繼代培養、生根培養的影響?！窘Y果】適宜小果甜柿外植體取材的時間為4月、6月；選擇75%酒精10 s + 0.1%氯化汞8 min的組合進行消毒，外植體成活率達76.67%；以（1/2N）MS + 2.5 mg·L-1 ZT + 0.1 mg·L-1 NAA為啟動培養基，外植體萌芽率達78.33%；以（1/2N）MS + 2.0 mg·L-1 ZT + 0.1 mg·L-1 NAA為繼代培養基，平均增殖系數在1.77以上；以1/2 MS + 1.0 mg·L-1 IBA為生根培養基，生根率達74.73%，平均根數3.33條，平均根長2.60 cm。【結論】構建了小果甜柿組培快繁技術體系，為小果甜柿組培苗的工廠化生產提供參考依據。

關鍵詞：小果甜柿；組織培養；快繁；莖段；培養基

中圖分類號：S665.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）09-1992-09

收稿日期：2022-12-26 接受日期：2023-06-01

作者簡介：覃換玲，女，本科，主要從事農業生物技術方面的研究。Tel：0771-3243086，E-mail：312940679@qq.com

*通信作者Author for correspondence. Tel：0771-3243086，E-mail：595249583@qq.com

Study on tissue culture and rapid propagation of Xiaoguo Tianshi as a sweet persimmon rootstock

QIN Huanling1， GAO Yingying1*， HUANG Lihui1， CHEN Shuyuan1， HUANG Tiankun1， LI Xiangao1， ZHOU Xiaoxuan1， GUAN Changfei2， YANG Yong2

（1Guangxi Plant Tissue Culture Seedling Co. LTD， Nanning 530007， Guangxi， China; 2College of Horticulture， Northwest A amp; F University， Yangling 712100， Shaanxi， China）

Abstract： 【Objective】 Persimmon （Diospyros kaki Thunb.） belongs to the genus （Diospyros Linn.） of the family Ebenaceae. China is rich in persimmon germplasm resources and one of the persimmon-producing countries with the longest cultivation history， the largest cultivated area and the largest yield in the world. Persimmon fruit tastes delicious， with unique flavor and high nutritional， and medicinal value， and is favored by consumers. At present， persimmon is often divided into sweet and astringent persimmon types according to whether the fruit can be deastringent naturally on the tree after maturity. Sweet persimmon can be crisp after ripening without any artificial treatment， sweet and refreshing， and the fresh experience of goods is excellent. The convenient transportation results in a higher economic value and persimmon industry at home and abroad focus on the development of varieties. At present， the lack of suitable rootstock in the sweet persimmon growing is the main reason that restricts its large scale development. Many domestic scholars have concluded that Xiaoguo Tianshi is a widely compatible and preferred rootstock for sweet persimmon. If the conventional seed and seedling breeding method is applied， the offspring traits will separate， and in this way， seedling breeding cycle is limited， and the yield is insufficient， so that it is difficult to meet the continuous growing market demand. Therefore， it is very important to use plant tissue culture technology for rapid propagation of Xiaoguo Tianshi as high-quality rootstock seedlings. Therefore， tissue culture has made great progress in persimmon crops and has been widely used in persimmon varieties and rootstock seedling breeding. However， there are few reports on tissue culture of Xiaoguo Tianshi， and because of the differences in physiological characteristics， explants， culture methods and other aspects among different persimmon crop varieties， the tissue culture and rapid propagation technology system of other persimmon varieties cannot be effectively applied. Therefore， the establishment of Xiaoguo Tianshi tissue culture and rapid propagation technology system is of great significance to realize the factory production of Xiaoguo Tianshi tissue culture seedlings.【Methods】 First of all， the materials were collected in different months and different disinfection methods were used to disinfect the surface of the stem segments of the current year’s young shoots， which were inoculated on the different start-up medium， and the contamination rate， browning rate and survival rate of explants were calculated. Secondly， the sterile bud obtained from the start-up medium was inoculated on different subculture media， and the subculture multiplication coefficient and the growth of the plantlets were counted. Finally， the sterile single bud with strong growth vigor， stem and leaf spreading and height of 3-4 cm was selected to inoculate on different rooting media， and the rooting rate， root number and root length were calculated. Through these methods， the best explants were selected， such as the time of material collection， sterilization method， start-up medium， subculture medium and rooting medium. The effects of time， sterilization method and proportion of plant growth regulators on explants disinfection， start-up culture， subculture and rooting culture were studied. 【Results】In different months of the year， the suitable time for Xiaoguo Tianshi explant sampling was in April and June. The explants were sterilized in 75% alcohol and 0.1% HgCl2 for 10 s and 8 min， the explants of Xiaoguo Tianshi had the lowest contamination rate and browning rate， and the survival rate reached to 76.67%. The medium for the initial culture was （1/2N） MS+2.5 mg·L-1 ZT +0.1 mg·L-1 NAA+30 g·L-1 sucrose and 4.5 g·L-1 agar， the new buds grew well， the buds were robust and vigorous， and the percentage of axillary buds was up to 78.33%. The medium for the subculture was （1/2N） MS+2.0 mg·L-1 ZT +0.1 mg·L-1 NAA+30 g·L-1 sucrose and 4.5 g·L-1 agar， the subgeneration seedlings grew well， the leaves stretched fully， the plants were strong and vigorous， and the multiplication coefficient reached to 1.77. The rooting medium was 1/2MS+1.0 mg·L-1 IBA+30 g·L-1 sucrose and 4.5 g·L-1 agar， with a rooting rate of 74.73%， the average root number was 3.33， and the average root length was 2.60 cm. 【Conclusion】 The production efficiency of Xiaoguo Tianshi seedlings could be effectively improved by plant tissue culture. Therefore， in this study， the key technological processes were confirmed， including explant disinfection， start-up culture， subculture and rooting culture in tissue culture by using the stem segment of Xiaoguo Tianshi with buds as explants， and the results can provide a reference for the industrial production of tissue culture plantlets of Xiaoguo Tianshi.

Key words： Xiaoguo Tianshi; Tissues culture; Rapid propagation; Stem segment; Culture medium

柿（Diospyros kaki Thunb.）屬于柿科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros Linn.）植物，起源于我國，是柿屬植物果樹栽培的重要作物，我國柿資源豐富，至今已有2000多年的栽培歷史[1]。柿果味道鮮美、風味獨特、顏色艷麗，含有豐富的果糖、葡萄糖、維生素C等營養物質，有潤肺、生津等功效，具有很高的營養價值和藥用價值，近年來深受消費者喜愛[2]。

目前常根據柿果實成熟后能否在樹上自然脫澀，將其分為甜柿和澀柿，澀柿需進行脫澀處理后才能食用，而甜柿則不需要任何人工脫澀處理即可脆食，因此甜柿有著更高的經濟價值[3]。我國的柿資源大部分是澀柿，自20世紀20年代就開始從日本引進甜柿品種，由于缺乏嫁接親和性強的砧木，制約了我國甜柿產業的規?；l展，是我國現代甜柿產業可持續發展的“瓶頸”問題之一[4-6]。因此，解決甜柿嫁接不親和問題，著力選育、發展優良砧木種苗，已成為了行業研究的首要問題。

近年來，以小果甜柿作為甜柿品種砧木的應用潛力研究已取得一定進展。李曼[4]對甜柿不同砧穗組合嫁接親和性的研究，初步得出甘秋與小果甜柿親和性較好，早秋與山東君遷子和小果甜柿親和性相當；胡夢玨等[5]以小果甜柿作為富有、次郎甜柿砧木的研究得出，兩個組合嫁接親和性均表現良好，嫁接后田間表現正常，表明小果甜柿有望成為完全甜柿的優選砧木；陳莉[7]對柿廣親和砧木的篩選研究得出：日本甜柿太秋、富有、松本早生均與小果甜柿表現為嫁接親和的結果。盡管多位學者均研究得出小果甜柿是甜柿的廣親和優選砧木，但當前仍主要通過傳統的種子播種繁殖方式獲得砧木實生苗，又因其不具有無融合生殖能力，且不同授粉源對其遺傳穩定性影響較明顯，因此，獲得大批量性狀表現一致的砧木苗較為困難[7-8]。

隨著柿樹栽培和甜柿引種工作的深入開展，優良砧木的需求量急劇增加。由于常規育苗方法周期長，成活率低，種苗性狀不均一，故組織培養研究在柿科作物上已取得了較大進展，開始廣泛應用于柿品種和砧木的種苗繁育。馬俊蓮等[9]以葉片為外植體進行愈傷組織誘導和不定芽再生的研究，建立了富有和次郎兩個甜柿品種組織培養再生體系；李晶等[10]以君遷子休眠芽和葉片為外植體，研究基本培養基種類和外植體基因型對初代培養的影響，建立了君遷子組織培養再生體系；蔣振瑩等[11]以當年生枝條上休眠芽為外植體材料，通過不同處理間對比研究，建立了山紅柿再生技術體系；劉一鳳[8]通過組織培養、直立壓條、硬枝扦插等技術途徑，獲得了小果甜柿自根苗生產技術。多位學者已對柿屬作物進行了一系列的組培研究，總結出不同柿屬作物的再生技術體系，取得了一定成果。但目前小果甜柿組培方面的研究報道較少，又因不同柿屬作物品種間生理特性、外植體取材部位、培養方式等方面存在差異，無法有效套用其他柿屬品種的組培快繁技術體系。鑒于此，筆者在本研究中通過組織培養技術，旨在建立一個快速高效的小果甜柿組培快繁技術體系，為小果甜柿組培苗的工廠化生產提供一定的技術支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料取自國家柿種質資源圃甜柿品種及優良砧木試種示范選育推廣基地—廣西植物組培苗有限公司科研育苗棚柿圃（22°51′ N，108°14′ E）。選取生長旺盛、無病蟲害、長勢健壯的小果甜柿實生苗母株，于2021年4—10月，取該植株上當年生帶芽嫩枝莖段為外植體。

1.2 方法

1.2.1" " 不同取材時間對當年生嫩枝莖段滅菌效果的影響" " 為確定外植體適宜的采集時間，分別于不同時期（4月10日、6月12日、8月10日、10月9日）選取當年生帶芽嫩枝莖段作為供試材料外植體，共4個處理（表1）。在超凈工作臺上，采用75%乙醇10 s和0.1%氯化汞8 min組合的方式進行表面消毒，期間不斷晃動，最后用無菌水沖洗3～4次。將消毒后的外植體用無菌濾紙吸去表面水分后，切割成單芽莖段接種于不含激素的（1/2N）MS初代培養基中。每個處理接種60個外植體、設置3次重復。培養14 d后統計外植體污染率及成活率。

1.2.2" " 不同滅菌方法對當年生嫩枝莖段滅菌效果的影響" " 于連續晴朗的午后，選取當年生帶芽嫩枝莖段作為供試材料外植體。采用75%乙醇（10、30 s）和0.1%氯化汞（6、8、10 min）組合的方式進行消毒，共6種消毒處理組合（表2，消毒流程同1.2.1）。每個處理接種60個外植體、設置3個重復。組織培養條件：溫度（25±2） ℃，暗培養5 d后轉入光照培養，光照度2500～3000 lx，光照時長12 h·d-1（下同）。培養14 d后統計外植體污染率及成活率。

1.2.3" " 啟動培養" " 為確定不同細胞分裂素種類及濃度對外植體萌芽的影響。以（1/2N）MS為供試基本培養基，分別添加1.5、2.0、2.5、3.0 mg·L-1 6-BA或ZT，共8種培養基組合（表3）。每種培養基均添加0.1 mg·L-1 NAA、30 g·L-1蔗糖和4.5 g·L-1瓊脂，pH 5.8。

將經最佳消毒方式處理后獲得的外植體分別接種于8種培養基中，每瓶1個，每配方接種外植體60個、設置3個重復。培養25 d后觀察外植體腋芽萌動情況，并計算誘導率。

1.2.4" " 繼代培養" " 為確定不同激素組合和轉接代數對組培苗繼代增殖的影響。選擇（1/2N）MS為供試基本培養基，分別添加1.5、2.0、2.5、3.0 mg·L-1 6-BA或ZT，共8種培養基組合（表4）。每種培養基均添加0.1 mg·L-1 NAA、30 g·L-1 蔗糖和 4.5 g·L-1瓊脂，pH 5.8。

將啟動培養基中獲得的長勢較好、生長健壯的無菌單芽分別接種于8種培養基中，每配方接種無菌單芽10個，每隔30 d轉接1次，共轉接15次。從培養的第1代起至第15代，統計每一代的增殖系數及叢芽生長情況。

1.2.5" " 生根培養" " 為確定不同激素種類及濃度對組培苗生根的影響。選擇1/2 MS為供試基本培養基，分別添加不同濃度的IAA、IBA、NAA，共9種培養基組合（表5）。每種培養基均添加30 g·L-1蔗糖、4.5 g·L-1瓊脂，pH 5.8。

選取最佳繼代配方中培養的長勢健壯、莖葉舒展、高度3～4 cm的無菌單芽，分別接種于9種培養基中，每瓶接種4株，每生根配方接種60株、設置3個重復。暗培養7 d后轉入光照培養，培養35 d后觀察并統計各單株的生根條數、根長、根粗及生長情況。

將組培室內培養30 d左右的組培生根苗移入溫室進行煉苗14 d，煉苗完成后取出生根苗，洗凈根部培養基，用200 mg·L-1高錳酸鉀水溶液對植株進行短時消毒，然后移栽至含進口泥炭土70%+珍珠巖30%的育苗杯中，淋定根水，同時噴施1000倍多菌靈溶液進行消毒，蓋小拱棚保濕，遮陽網遮陰。

1.2.6" " 數據分析" " 采用Excel 2013進行數據處理及制圖，用SPSS 19.0軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同取材時間對當年生嫩枝莖段滅菌效果的影響

不同取材時間對外植體滅菌的效果影響不同。由表1可以看出，不同取材時間的小果甜柿嫩枝莖段在滅菌接種后，污染率、褐化率和存活率均存在顯著差異。從污染率、褐化率來看，8月、10月顯著高于4月、6月，當取材時間為4月、6月時，外植體污染率分別為11.67%、13.33%，褐化率分別為15.00%、8.33%；就存活率而言，4月、6月成活率顯著高于8月、10月，分別為73.33%、78.34%。因此，小果甜柿當年生嫩枝莖段外植體最佳的取材時間是4月、6月。

2.2 不同滅菌方法對當年生嫩枝莖段滅菌效果的影響

將經不同滅菌方法消毒后的外植體接種至相同的初代培養基中，14 d后觀察發現，不同滅菌方法對小果甜柿外植體滅菌效果的影響顯著（表2）。當使用0.1%氯化汞消毒時間相同時，隨著75%乙醇的處理時間增加，外植體污染率和褐化率均隨之升高，成活率隨之降低，但各組合整體差異不顯著，其中以使用75%乙醇消毒10 s較好。當使用75%乙醇消毒時間相同時，隨著0.1%氯化汞消毒時間的延長，外植體污染率差異不顯著，但褐化率顯著升高，導致成活率有所降低。因此，適合小果甜柿嫩枝莖段外植體消毒的最佳方式為：75%乙醇10 s + 0.1%氯化汞8 min，外植體成活率76.67%。

2.3 不同培養基對小果甜柿外植體萌芽率的影響

將經同種滅菌方法消毒后的外植體接種至不同的初代培養基中，14 d左右外植體腋芽開始萌發，芽體逐漸生長，葉片變大，30 d后新芽高度最高可達3 cm，葉片舒展。當NAA濃度一定時，啟動培養基中添加不同濃度的6-BA或ZT，對小果甜柿外植體萌芽率的影響顯著（表3）。隨著6-BA、ZT的濃度增加，外植體萌芽率先升高后降低，均以2.5 mg·L-1質量濃度時萌芽率最高，分別為65.00%、78.33%；當6-BA和ZT質量濃度相同時，ZT對小果甜柿萌芽的效果顯著優于6-BA。因此，適宜小果甜柿外植體腋芽萌發的啟動培養基為：（1/2N）MS + 2.5 mg·L-1 ZT+0.1 mg·L-1 NAA（圖1-A、B）。

2.4 不同培養基對小果甜柿組培苗繼代增殖的影響

將誘導出的新芽進行繼代增殖培養，經15次繼代增殖，發現不同濃度植物生長調節劑配比對小果甜柿繼代增殖影響顯著（表4）。當NAA濃度一定時，隨著6-BA或ZT濃度增加，增殖系數增大；當6-BA和ZT濃度相同時，ZT對小果甜柿繼代增殖的效果顯著優于6-BA。試驗表明：6-BA對小果甜柿組培苗繼代增殖效果較差，芽體長勢差，增殖系數小，隨著繼代次數增加，后期芽體逐漸褐化死亡；ZT對其繼代增殖效果較好，芽體長勢好，增殖系數隨濃度升高而增大，但隨著繼代次數增加到8代以上，當ZT質量濃度為2.5或3.0 mg·L-1時，芽體會出現明顯的玻璃化現象而導致增殖系數變小，而ZT質量濃度為2.0或1.5 mg·L-1時玻璃化程度較輕，對其增殖影響較小。因此，適宜小果甜柿組培苗繼代增殖的培養基為：（1/2N）MS + 2.0 mg·L-1 ZT + 0.1 mg·L-1 NAA（圖1-C）。

2.5 不同培養基對小果甜柿組培苗生根的影響

由表5可見，不同生長素種類及濃度對小果甜柿組培苗生根影響顯著。單獨使用3種生長素，對組培苗生根率的影響由大到小依次為：IBA＞IAA＞NAA；對組培苗根長的影響由大到小依次為：IAA＞IBA＞NAA；對組培苗根數的影響總體上看IBA、IAA優于NAA。3種生長素均以添加質量濃度為1.0 mg·L-1時較好，其中當IBA質量濃度為1.0 mg·L-1時組培苗長勢最好，生根率高達74.73%，根數3.33條，根長2.60 cm。另外，將組培室內培養30 d左右小果甜柿組培生根苗進行移栽，60 d待其生長穩定后統計其移栽成活率約為80%。因此，適宜小果甜柿組培苗生根的培養基為：1/2 MS + 1.0 mg·L-1 IBA（圖1-D、E）。

3 討 論

筆者在本研究中以小果甜柿帶芽嫩枝莖段為外植體，通過外植體取材時間、滅菌時間、植物生長調節劑配比對其組織培養過程中外植體消毒、啟動培養、繼代培養、生根培養的影響進行了研究。初步建立了小果甜柿組織培養快繁技術體系。

外植體的消毒處理是組培過程中的關鍵環節，在對外植體進行徹底滅菌的同時還要盡可能地減少對外植體組織的傷害，保證植物細胞仍具有旺盛的生長分化能力[12]。小果甜柿的腋芽長期暴露在空氣中，容易積累多種微生物造成消毒困難，因此，在每年的4月、6月選取含菌較少且生長分化能力較強的植物組織作為外植體較適宜，同時要嚴格控制滅菌時間，以求達到最佳的滅菌效果。

在植物組織培養過程中，植物生長調節劑對外植體的誘導分化起重要作用，可以調節并決定著外植體的生長發育進程、分化方向和器官發生[13]。李暢等[14]采用陽豐甜柿帶芽莖段為外植體接種在1/2 MS + 1.0 mg·L-1 ZT + 0.1 mg·L-1 IAA培養基中，腋芽誘導率為77.8%；蔣振瑩等[11]采用山紅柿休眠芽為外植體接種在（1/2N）MS + 1.0 mg·L-1 ZT + 0.1 mg·L-1 NAA培養基中，誘導新芽長勢較好。筆者在本試驗中以（1/2N）MS + 2.5 mg·L-1 ZT + 0.1 mg·L-1 NAA為小果甜柿嫩枝莖段外植體最佳啟動培養基，ZT使用濃度與前人所使用的濃度不同，這可能與品種間生理特性不同有關。

褐變現象普遍存在于多種植物體的組織培養過程中，木本植物表現尤為嚴重，導致木本作物較難建立組培快繁體系，其中選擇適宜的植物生長調節劑種類對試驗的成功至關重要[15]。前人研究發現，部分柿品種在含有6-BA的培養基中長勢較差甚至無法生長，而ZT在柿組織培養中則普遍使用。例如，劉愷等[16]研究得出，在柿的組培快繁過程中，富有甜柿的組培苗只能在含有ZT的培養基中生長；朱陳宇[17]研究6-BA和ZT兩種細胞分裂素對柿繼代增殖的影響發現，與6-BA相比，ZT更適宜君遷子優系L938的繼代培養；孔祥生等[18]的研究表明，富有和次郎的繼代培養基中單獨使用ZT或6-BA，在增殖倍數和新梢生長方面，ZT都顯著優于6-BA。本試驗研究得出，ZT比6-BA更適宜用于小果甜柿組培苗繼代培養，與多位學者研究結果一致。另外，本試驗結果還表明，小果甜柿繼代培養基中不適宜長期添加較高濃度的ZT，否則8代以后芽體會出現玻璃化現象而導致組培苗繼代增殖系數降低，這可能與外源激素的累積效應相關。而就筆者在本試驗中目前進展而言，雖經15次繼代后的組培生根苗已進行試種，現移栽存活率穩定，植株長勢正常，未發現明顯變異情況，但對其大田種植多年后的遺傳穩定性等方面的研究仍在繼續重點進行中。

很多學者的研究均表明，柿存在生根難的問題。目前，解決生根困難的問題多采用生根前期暗培養、增加繼代培養代數、調節基本培養基成分及植物生長調節劑種類等方法。李暢等[1]、劉一鳳[8]、朱陳宇[17]、劉聰娟等[19]通過減少生根培養基中的營養成分、生根前期暗培養等方式，對多個柿品種組培苗生根的作用效果進行研究，試驗結果均表現較好。筆者在本試驗中借鑒前人的研究成果，采用1/2 MS為基本培養基，在生根前期暗培養7 d后轉入光照培養，研究了IAA、IBA、NAA 3種生長素單獨使用對小果甜柿組培苗生根的影響。試驗結果表明IBA優于IAA和NAA，但它們三者對小果甜柿組培苗生根的相互作用效果還需進一步深入研究。

目前，香蕉[20]、桃樹[21]、蘋果[22]、葡萄[23]、柿[1-2]等許多木本植物都已成功建立了植物組織培養快繁技術體系，但不同植物的體系快速繁殖效果不同。本試驗雖比部分柿科植物的組培擴繁效率和生根率較高，繼代增殖系數約1.77以上，生根率達74.73%，但與香蕉、桃樹、蘋果、葡萄等成熟的快繁技術體系相比，該些品種繼代增殖系數高達2.0以上，生根率達95%以上，本文中研究的體系快速繁殖效率還略低。筆者在試驗過程中已采用多種方法來防止褐變的發生，在一定程度上可降低褐變程度，但在培養過程中仍不能完全抑制褐變，這可能也是影響小果甜柿體系快速繁殖效果的原因之一。但是，本試驗與該品種的常規育苗方法相比，可有效縮短育苗周期，提高種苗成活率，種苗性狀也較均一，為小果甜柿組培苗的工廠化生產提供了一定的技術支撐。

4 結 論

本試驗結果表明，以小果甜柿帶芽嫩枝莖段為外植體，適宜小果甜柿外植體取材的最佳時間為4月、6月；選擇75%乙醇10 s+0.1%氯化汞8 min的組合進行消毒，外植體成活率達76.67%；以（1/2N）MS + 2.5 mg·L-1 ZT+0.1 mg·L-1 NAA為啟動培養基，萌發的新芽有活力，外植體萌芽率達78.33%；以（1/2N）MS + 2.0 mg·L-1 ZT + 0.1 mg·L-1 NAA為繼代培養基，小果甜柿組培繼代苗長勢好，增殖系數在1.77以上；以1/2 MS + 1.0 mg·L-1 IBA為生根培養基，小果甜柿組培苗生根率達74.73%，平均根數3.33條，平均根長2.60 cm。

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