蘋果PIN家族基因鑒定及在不定根形成中的表達分析

摘" " 要：【目的】探究蘋果PIN全基因組特征及在不定根形成過程中的表達分析，以便更深入地了解其結構特點與潛在功能，為研究不定根形成的分子機制奠定基礎。【方法】利用蘋果基因組數據庫GDR和HMMER對蘋果PIN基因家族成員進行鑒定并編號，用MEGA、TBtools和MEME等生物信息學軟件對其家族成員的基因定位、系統進化關系、基因結構、保守motif基序和蛋白保守結構域等進行分析，并采用qRT-PCR方法對PIN基因家族成員在不定根形成中的表達模式進行分析?！窘Y果】蘋果PIN基因家族有13個成員，分布于基因組8條染色體上，氨基酸數目在357～660個之間，蛋白質分子質量為38.84～71.61 ku，等電點在6.93～9.35之間。啟動子作用元件分析表明，13個PIN啟動子上含有響應激素、生長發育和逆境相關的順式作用元件，其中有8個PIN基因含有生長素響應作用元件，暗示他們可能參與生長素調控不定根形成。轉錄組分析顯示，13個PIN家族成員中，有6個基因（MdPIN3、MdPIN4、MdPIN6、MdPIN7、MdPIN11和MdPIN12）在吲哚丁酸（IBA）處理下表達上調。進一步通過qRT-PCR分析，發現MdPIN3、MdPIN4、MdPIN6和MdPIN11在IBA處理下都有明顯上升趨勢，其中MdPIN4表達量變化最大。【結論】通過對蘋果全基因組進行分析，共鑒定到13個PIN基因，分布在8條染色體上，通過轉錄組和qRT-PCR分析，推測MdPIN4可能在調控蘋果砧木不定根形成中起著重要作用。

關鍵詞：蘋果；PIN；全基因組鑒定；不定根形成；基因表達分析

中圖分類號：S661.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）09-1789-11

收稿日期：2023-02-20 接受日期：2023-05-22

基金項目：國家重點研發計劃（2019YFD1000100、2018YFD1000300）；國家自然科學基金（31872058）；河南省科技攻關項目（222102110041）；河南省大宗水果產業技術體系（ARRS-22-09-Z2）

作者簡介：方森，男，在讀碩士研究生，研究方向為果樹逆境分子生物學。Tel：18838151770，E-mail：fangsen2020@163.com。#為共同第一作者。

*通信作者 Author for correspondence. Tel：0371-56552762，E-mail：xianboz@163.com；Tel：0371-63579623，E-mail：tuanhuibai88@163.com

Identification and expression analysis of PIN gene family during adventitious root formation in apple

FANG Sen， SONG Xuelian#， HAN Xuanxuan， SONG Chunhui， JIAO Jian， WANG Miaomiao， SONG Shangwei， ZHENG Xianbo*， BAI Tuanhui*

（College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046， Henan， China）

Abstract：【Objective】Apple （Malus×domestica Borkh.） is one of the most economically important tree fruits in China， and the intensive cultivation with dwarfing rootstock is popular in the world. The use of dwarfing rootstocks is the main way to realize the intensive cultivation of apple. The formation of adventitious roots is one of the key steps in the vegetative propagation of dwarfing rootstocks. The auxin transporter PIN-FORMED （PIN） protein is a typical transmembrane transport protein， which plays an important role in adventitious root formation by participating in the polar transport of auxin in plants. In this study， the characteristics of the apple PIN gene family at the whole genome and its expression in the process of adventitious root formation were investigated， so as to better understand its structural characteristics and potential functions， and lay a foundation for studying the molecular mechanism of adventitious root formation. 【Methods】 The apple PIN gene family members were identified using the apple genome database GDR and HMMER. The gene mapping， phylogenetic relationship， gene structure， conserved motif analysis and protein conserved domain of the PIN gene family members were analyzed using bioinformatics software such as MEGA， TBtools and MEME. qRT-PCR was used to analyze the expression pattern of the PIN gene family members in adventitious root formation. 【Results】 There were 13 members of the apple PIN gene family， and they were distributed on 8 chromosomes. The amino acid lengths ranged from 357 to 660 aa， the molecular weights of protein ranged from 38.84 to 71.61 ku， and the isoelectric points ranged from 6.93 to 9.35. The sequence analysis showed the 13 PIN genes were unevenly distributed on 8 chromosomes of apple （Chr 4， Chr 6， Chr 9， Chr 10， Chr 12， Chr 13， Chr 14 and Chr 16）， among which there were two PIN genes on Chr 4， 12， 13， 14 and 16 respectively， there was only one PIN gene on Chr 6， 9 and 10. The collinear analysis showed that there was segment replication between the MdPIN2 and the MdPIN7， the MdPIN3 and the MdPIN11， the MdPIN6 and the MdPIN10， the MdPIN8 and the MdPIN12， and the MdPIN9 and the MdPIN13， and no tandem duplication was found， suggesting that gene segment replication was the main driving force for the amplification of this family. The apple PIN genes contained multiple introns and exons， and the structures were relatively complex. The conserved motifs analysis showed that the MdPIN1， MdPIN2， MdPIN4 and MdPIN7 had 8 conserved motifs， and all the other genes had 10 conserved motifs. In order to study the evolutionary relationships of the members of the PIN gene family， MEGA software was used to conduct phylogenetic analysis of the apple PIN family was mainly distributed in the G1 and G3 subfamilies， with 10 in the G3 subfamily， three in the G1 subfamily. The analysis of promoter-acting elements showed that 13 PIN promoters contained cis-acting elements related to hormone， growth and stress response， and 8 of them contained auxin response elements， suggesting that they might be involved in auxin regulation. The transcriptome analysis showed that the expression levels of the MdPIN3， MdPIN4， MdPIN5， MdPIN6， MdPIN8， MdPIN10， MdPIN11 and MdPIN12 under IBA treatment were higher than those of the control. There was no change in the MdPIN1 and MdPIN13 compared with the control， while the expression of the MdPIN7 was lower than that of the control under IBA treatment. Six genes with significantly different expressions （the MdPIN3， MdPIN4， MdPIN6， MdPIN7， MdPIN11 and MdPIN12） were screened and their dynamic expression patterns in adventitious root formation were further verified by qRT-PCR. The expression of the MdPIN3， MdPIN4， MdPIN6 and MdPIN11 was significantly induced by IBA treatment， which was consistent with the results of the transcriptome. The expression level of the MdPIN3 and MdPIN4 was the highest on the 5th day， the expression level of the MdPIN4 was 2.9 times as high as that of the control on the 5th day， and the expression level of the MdPIN6 was the highest on the 10th day. 【Conclusion】 A total of 13 PIN genes in apple were identified and they were distributed on 8 chromosomes. The transcriptome and qRT-PCR analysis suggested that the MdPIN4 might play an important role in regulating the adventitious root formation of apple rootstocks. These findings might lay a foundation to functionally characterize the MdPIN genes to unravel their exact role in adventitious root formation in apple.

Key words： Apple; PIN; Genome-wide identification; Adventitious root formation; Gene expression analysis

蘋果（Malus×domestica Borkh.）是我國主要栽培果樹樹種之一，其面積和產量均居世界首位。矮砧集約栽培是世界蘋果發展的方向和趨勢，利用矮化砧木是實現蘋果矮砧密植集約栽培的主要途徑之一[1]。不定根形成是蘋果無性系矮化砧木繁育的關鍵環節。生長素在植物不定根形成中發揮重要作用。生長素外向轉運體PIN（PIN-FORMED）蛋白是一種典型的跨膜運輸蛋白，通過參與植物體內生長素的極性運輸進而在植物不定根形成過程中發揮重要作用[2-3]。筆者在本研究中對蘋果PIN進行全基因組鑒定，并對其家族成員的理化性質、基因結構及其在不定根形成過程中的表達模式進行分析，旨在挖掘調控蘋果不定根形成的關鍵基因。

PIN蛋白是作用于植物信號分子的一種生長素轉運蛋白，通過參與植物體內生長素的極性運輸進而在不同程度上行使特殊的功能，在植物生長發育過程中起重要作用，包括胚胎發育、組織分化和器官形成等[4-5]。隨著測序技術的快速發展，越來越多的物種進行了PIN基因家族的鑒定，其中擬南芥8個[6]，水稻12個[7]，煙草29個[8]，玉米14個[9]，棉花17個[10]，辣椒10個[11]，楊樹15個[12]，大豆23個[13]，番茄10個[14]。一些PIN基因已被證實在植物生根過程中發揮重要作用[15]。Lee等[16]研究表明，PIN8主要在擬南芥萌發階段發揮功能，PIN8功能缺失和突變顯著降低了擬南芥側根的數量。Yuan等[17]研究發現HAT2基因通過直接抑制PIN3轉錄，調節擬南芥根系生長。在水稻中，OsPIN1與同源基因共同調控水稻主根、側根和不定根的形成與生長[18]。據報道，PmPIN1在桑樹幼根中表達量高，將該基因轉入煙草發現轉基因植株發根量較對照多，表明PIN1基因有利于根原基的形成和新根的生長[19]。在棉花中發現PIN1-3和PIN2參與棉花根系的發育，在棉花主根和側根形成中發揮重要作用[10]。目前，已有幾個蘋果PIN基因被克隆分離出來，并證實它們在蘋果矮化和腋芽萌發過程中發揮重要作用[20-21]。Zhang等[20]分離出了蘋果PIN9基因，表明其在蘋果砧木矮化中起重要作用。劉小杰等[21]研究表明，MdPIN15對蘋果腋芽萌發起重要作用。許多植物PIN家族基因已經被鑒定，并證實一些PIN家族成員在植物不定根形成過程中發揮重要作用，但目前蘋果PIN家族成員在不定根形成方面的具體功能尚不清楚。筆者在本研究中通過對蘋果全基因組PIN基因家族進行鑒定和生物信息學分析，結合轉錄組和qRT-PCR分析，深入了解其結構特點與潛在功能，為后續進行蘋果PIN基因的功能驗證和不定根形成的分子機制解析奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料培養與處理

試驗材料為蘋果砧木M26組培苗。培養條件：溫度為（25±2）℃，光周期為14 h（L）/10 h（D），光照度為2500～2800 lx，相對濕度為70%～80%。

將繼代培養1個月生長一致的M26組培苗隨機分成2組。第一組（對照，CK），在MS培養基上培養；第二組（IBA），在MS + 0.6 mg·L-1 IBA的培養基上培養。每組設3個重復，每個重復30個組培苗。每組分別在培養后第0、1、3、5、10、15天取莖基部0.5 cm左右的莖段，液氮速凍，-80 ℃保存備用。

1.2 蘋果PIN家族成員鑒定與分析

通過GDR數據（https：//www.rosaceae.org/）獲得蘋果基因組序列，從TAIR（https：//www.arabidopsis.org/browse/genefamily/index.jsp）下載擬南芥PIN成員蛋白序列，以8個擬南芥序列作為查詢序列，用蘋果全部蛋白序列為庫，進行Blastp搜索，使用HMMER和SMART網站進行蛋白質的保守結構域雙重驗證，最終得到13個蘋果PIN家族成員，然后以染色體位置信息進行編號和命名。采用ExPASy（https：//www.expasy.org/）分析蘋果PIN基因家族氨基酸數量（aa）、蛋白質分子質量（ku）和等電點（pI）等理化性狀[22]。通過在線工具（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對蘋果PIN基因家族蛋白二級結構預測進行分析。用TBtools軟件對蘋果基因組信息和基因結構注釋文件進行分析[23]，對提取到的13個蘋果PIN基因進行基因結構的可視化展示，獲得基因的內含子和外顯子的個數以及排布情況。采用MEME4.9軟件（http：//meme-suite.org/tools/meme）進行蛋白motif基序分析。從相應網站下載蘋果、擬南芥、番茄、玉米和桃PIN基因家族的蛋白氨基酸序列，利用MEGA-X 軟件采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹，參數Bootstrap值設為1000。通過EvolView（https：//www.evolgenius.info/evolview/）對進化樹進行美化[24]。提取蘋果PIN家族基因上游2000 bp的序列作為啟動子序列，通過Plantcare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）數據庫對蘋果PIN家族基因進行順式作用元件在線分析[25]。

1.3 轉錄組分析

根據IBA處理M26組培苗的不定根生長情況（圖1）和以前的研究結果[2]，選取對照和IBA處理5 d的M26組培苗莖基部，使用液氮速凍保存。由北京百邁客生物科技有限公司在Illumina HiSeq 4000高通量平臺進行轉錄組測序，過濾低質量reads和不合格序列后，完整Reads使用HISAT2與蘋果基因組（GDDH13 Version 1.1，https：//iris.angers.inra.fr/gddh13/the-apple-genome-downloads.html）進行比對。使用TBtools繪制PIN基因家族表達熱圖。

1.4 qRT-PCR分析

使用植物總RNA抽提純化試劑盒（huayueyang biotech，中國）提取M26蘋果莖基部RNA。使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]對RNA進行反轉錄獲得cDNA。通過蘋果基因組數據庫GDR（https：//www.rosaceae.org/）下載蘋果PIN蛋白基因家族的CDS序列，利用Primer 5.0軟件設計特異性引物，內參基因選用Actin，序列見表1。反應體系為20 μL：10 μL ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），1 μL cDNA模板，上、下游引物（10 μmol?L-1）各1 μL，7 μL無菌蒸餾水。運行程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，40個循環。采用2-??CT計算基因的相對表達量[26]。用SPSS軟件的單因素LSD法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 蘋果PIN家族基因全基因組鑒定

將擬南芥中PIN基因家族的蛋白序列在蘋果基因組中進行比對，確定蘋果PIN有13個成員，根據其在染色體的位置命名為MdPIN1～MdPIN13（圖2）。對鑒定到的13個蘋果PIN基因進行理化性質分析（表2）。氨基酸數目在357～660個之間，蛋白質分子質量為38.84～71.61 ku，其中MdPIN4分子質量最小，MdPIN8分子質量最大，等電點在6.93～9.35之間，該家族的亞細胞定位預測均位于質膜上。通過蘋果PIN蛋白的二級結構預測分析，發現蘋果PIN蛋白以α-螺旋和不規則卷曲為主（表3）。其中α-螺旋含量為28.79%～55.99%，β-轉角含量為4.15%～5.85%，延伸鏈含量為13.69%～16.16%，不規則卷曲含量為24.79%～52.62%。

2.2 蘋果PIN基因家族成員染色體定位和共線性分析

通過序列分析，13個基因不均勻分布在蘋果的8條染色體上（Chr 4、Chr 6、Chr 9、Chr 10、Chr 12、Chr 13、Chr 14和Chr 16），其中4號、12號、13號、14號和16號染色體上分別有2個，6號、9號和10號染色體上只有1個（圖2）。共線性分析發現，MdPIN2和MdPIN7、MdPIN3和MdPIN11、MdPIN6和MdPIN10、MdPIN8和MdPIN12、MdPIN9和MdPIN13之間存在基因片段復制，沒有發現串聯重復，說明基因片段復制是該家族擴增的主要動力。

2.3 蘋果PIN基因家族成員保守序列、基因結構和系統發育分析

蘋果PIN基因都含有多個內含子和外顯子，結構比較復雜。保守基序分析表明，13個蘋果PIN基因的保守基序數量比較一致，除了MdPIN1、MdPIN2、MdPIN4和MdPIN7保守基序有8個，其他基因的保守基序都是10個（圖3）。為了研究PIN基因家族的進化關系，使用MEGA軟件對蘋果、擬南芥、番茄、玉米和桃中鑒定出的家族成員進行系統進化分析。結果顯示，這5個物種的PIN家族成員分成3個亞家族（G1，G2和G3），其中G1亞家族中有10個PIN成員，G2亞家族中有9個PIN成員，G3亞家族中有41個PIN成員。蘋果PIN家族主要分布在G1和G3亞家族，G3亞家族有10個，G1亞家族有3個，G2亞家族沒有蘋果PIN（圖4）。

2.4 蘋果PIN基因家族成員順式作用元件分析

為了研究蘋果PIN基因家族對激素的響應，對蘋果PIN轉錄起始位置上游2000 bp的序列的順式作用元件進行預測和分析。發現響應茉莉酸甲酯和脫落酸的順式作用元件較多，分別有38個和28個（圖5）。在蘋果PIN基因13個家族成員中，MdPIN1響應茉莉酸甲酯的順式作用元件最多，有12個；MdPIN1、MdPIN2和MdPIN8啟動子響應脫落酸的順式作用元件最多，均為5個。響應赤霉素的順式作用元件有15個，主要分布在MdPIN2、MdPIN3、MdPIN4、MdPIN5、MdPIN8、MdPIN9、MdPIN10和MdPIN11基因啟動子上。響應水楊酸的順式作用元件有19個，主要分布在MdPIN3、MdPIN6、MdPIN7、MdPIN8、MdPIN9和MdPIN10基因啟動子上。響應生長素的順式作用元件有8個，分別在MdPIN1、MdPIN2、MdPIN3、MdPIN4、MdPIN9、MdPIN10和MdPIN12基因啟動子上。

2.5 蘋果PIN基因家族成員在IBA處理下的轉錄組分析

多個蘋果PIN基因家族成員在對照組和IBA處理組的表達量差異較大。MdPIN3、MdPIN4、MdPIN5、MdPIN6、MdPIN8、MdPIN10、MdPIN11和MdPIN12在IBA處理下表達量較對照高，MdPIN1和MdPIN13與對照相比沒有變化，而MdPIN7在IBA處理下表達量比對照低（圖6）。筆者推測，高表達的PIN基因家族成員可能響應IBA處理并在蘋果不定根形成過程中發揮作用。

2.6 蘋果PIN基因家族成員在IBA處理下的表達分析

為了進一步篩選調控不定根相關的基因，從轉錄組中篩選表達差異較大的6個基因（MdPIN3、MdPIN4、MdPIN6、MdPIN7、MdPIN11和MdPIN12），采用qRT-PCR分析了這6個基因在IBA處理0、1、3、5、10、15 d的動態表達模式（圖7）。發現IBA處理顯著誘導MdPIN3、MdPIN4、MdPIN6、MdPIN11的表達，與轉錄組的結果一致。其中MdPIN3和MdPIN4在第5天時表達量最高，MdPIN4在第5天的表達量是對照的2.9倍，MdPIN6在10 d時表達量最高，揭示這些基因可能在不定根形成過程中起重要作用。而MdPIN12在IBA處理下表達量變化不大，但對照的表達量呈現先升后降的趨勢，表明MdPIN12可能不響應IBA。

3 討 論

植物不定根的形成和發育主要由基因型決定，同時受多種激素和環境因素的調節，其中生長素在不定根形成中起關鍵作用[2， 27]。PIN作為生長素極性運輸載體在植物生長發育期起重要作用。許多研究表明PIN基因家族成員廣泛地參與調控植物不定根的形成，并在不定根形成過程中起著重要的作用[10， 18]。筆者從蘋果中鑒定出了13個蘋果PIN基因，與劉小杰等[21]鑒定出的數量不一樣，造成數量差異的原因可能是采用的蘋果基因組數據庫的版本和篩選的條件不同。研究發現不同植物中PIN家族包含的基因數量不同，其中煙草中最多，有29個[8]，擬南芥中最少，有8個[6]，不同植物PIN數量的差異可能是在進化過程中引起的[28]。蘋果PIN家族成員的氨基酸序列長度存在較大差異，最小的是357 aa，最大的是660 aa，擬南芥PIN家族成員的氨基酸序列長度也在存在較大差異[29-31]。蘋果PIN家族成員基因結構相似，都具有相同的8個motifs和5個CDS區。其中MdPIN1和MdPIN2基因結構更為相似，理化性狀和跨膜結構也相似，暗示他們可能有相似的功能。

系統進化分析可以了解物種的親緣關系和基因的功能，聚類關系越近，具有類似功能的可能性越大[32]。本研究中，對蘋果、桃[4]、番茄[14]、玉米[9]和擬南芥[6]進行了系統進化分析。結果顯示，PIN蛋白家族分成三類，蘋果、番茄和擬南芥PIN蛋白集中在G1和G3亞家族上，而桃和玉米PIN蛋白在3個亞家族上都有分布。蘋果和桃PIN蛋白序列的相似度更高，可能是兩個物種的親緣關系更近，同屬于薔薇科。G1亞家族中有3個蘋果PIN基因，分別是MdPIN1、MdPIN2和MdPIN7。G2亞家族中沒有蘋果PIN基因，這可能是進化過程中發生了基因突變，產生了新的基因。在G3亞家族中包含了除G1亞家族外所有的蘋果PIN基因。筆者還發現G3亞家族中有多對蘋果PIN基因存在共線性關系，并且存在共線性關系的蘋果PIN基因理化性質相似，在染色體上的位置也較近。在G3亞家族中包含了大部分擬南芥PIN基因，其中不少基因與根的生長有關。該亞家族中的其他物種的PIN基因也有相似的功能[33]。這些結果表明，蘋果PIN基因可能與不定根的形成有關。順式作用元件分析發現該家族啟動子區域含有激素響應順式作用元件，主要包括生長素、赤霉素、脫落酸響應元件。推測PIN家族成員中的生長素響應元件可能參與調控不定根的形成[34]。

基因的表達情況與其功能之間存在密切聯系[35]。PIN基因的表達受多種植物激素的影響，包括生長素自身的誘導[36]。IBA被廣泛應用于植物不定根的誘導。外源IBA顯著提高擬南芥、綠豆、蘋果等植物莖段外植體不定根的數量[36-38]。筆者以前的研究也表明IBA誘導蘋果莖段不定根的形成[2]。本研究通過轉錄組對可能調控不定根形成的家族成員進行了初步篩選，分析發現蘋果13個PIN家族成員中有8個顯著受IBA的誘導，而對照處理下蘋果PIN基因家族成員表達量變化不大。結合IBA處理不定根形成的表型分析，推測IBA可能通過誘導MdPINs基因的表達促進了不定根的形成。前人研究表明，不定根的誘導在不定根形成過程中起關鍵作用[33]，筆者篩選出表達差異較大的6個基因，用qRT-PCR進一步驗證在不定根形成中的動態表達模式，發現4個PIN家族成員（MdPIN3、MdPIN4、MdPIN6和MdPIN11）受IBA誘導后顯著上調表達，其中MdPIN4在第5天表達量是對照的2.9倍，推測MdPIN4在調控蘋果砧木不定根形成中起著重要作用，但該基因的具體生物學功能及調控機制仍需要進一步研究。

4 結 論

從蘋果基因組中鑒定得到13個蘋果PIN家族成員，不均勻地分布于8條染色體上，其氨基酸長度在357～660 aa之間，蛋白質分子質量為38.84～71.61 ku，等電點在6.93～9.35之間。啟動子作用元件分析表明，13個PIN啟動子上含有與激素、生長和逆境響應相關的順式作用元件，其中有8個基因含有生長素響應作用元件，暗示它們可能參與生長素調控不定根形成的過程。在13個PIN家族成員中，有6個基因在IBA處理下上調表達，其中MdPIN4表達量變化最大，推測MdPIN4在調控蘋果砧木不定根形成中起著重要作用。

參考文獻 References：

[1] 韋燕紅，劉楨，李珂，孟媛，汪蕙，毛江萍，馬豆豆，李少歡，馬娟娟，盧顯，張東. 蘋果miR396家族鑒定及在不定根發育過程中的表達分析[J]. 園藝學報，2020，47（7）：1237-1252.

WEI Yanhong，LIU Zhen，LI Ke，MENG Yuan，WANG Hui，MAO Jiangping，MA Doudou，LI Shaohuan，MA Juanjuan，LU Xian，ZHANG Dong. Genome-wide identification and expression analysis of miR396 family during adventitious root development in apple[J]. Acta Horticulturae Sinica，2020，47（7）：1237-1252.

[2] BAI T H，DONG Z D，ZHENG X B，SONG S W，JIAO J，WANG M M，SONG C H. Auxin and its interaction with ethylene control adventitious root formation and development in apple rootstock[J]. Frontiers in Plant Science，2020，11：574881.

[3] CHEN L H，CAI M L，CHEN M H，KE W Q，PAN Y R，HUANG J D，ZHANG J J，PENG C L. Genome-wide characterization of PIN auxin efflux carrier gene family in Mikania micrantha[J]. International Journal of Molecular Sciences，2022，23（17）：10183.

[4] 譚彬，楊麗萍，陳立川，馮玫僑，連曉東，魏鵬程，程鈞，王小貝，馮建燦. 桃PIN蛋白基因家族鑒定及其在不同樹型桃中的表達分析[J]. 農業生物技術學報，2020，28（10）：1747-1760.

TAN Bin，YANG Liping，CHEN Lichuan，FENG Meiqiao，LIAN Xiaodong，WEI Pengcheng，CHENG Jun，WANG Xiaobei，FENG Jiancan. Identification and expression analysis of PIN gene family in different tree architectures of peach （Prunus persica）[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，2020，28（10）：1747-1760.

[5] KUMAR M，KHERAWAT B S，DEY P，SAHA D，SINGH A，BHATIA S K，GHODAKE G S，KADAM A A，KIM H U，MANORAM A，CHUNG S M，KESAWAT M S. Genome-wide identification and characterization of PIN-FORMED （PIN） gene family reveals role in developmental and various stress conditions in Triticum aestivum L.[J]. International Journal of Molecular Sciences，2021，22（14）：7396.

[6] GANGULY A，PARK M，KESAWAT M S，CHO H T. Functional analysis of the hydrophilic loop in intracellular trafficking of Arabidopsis PIN-FORMED proteins[J]. The Plant Cell，2014，26（4）：1570-1585.

[7] WANG J R，HU H，WANG G H，LI J，CHEN J Y，WU P. Expression of PIN genes in rice （Oryza sativa L.）：tissue specificity and regulation by hormones[J]. Molecular Plant，2009，2（4）：823-831.

[8] XIE X D，QIN G Y，SI P，LUO Z P，GAO J P，CHEN X，ZHANG J F，WEI P，XIA Q Y，LIN F C，YANG J. Analysis of Nicotiana tabacum PIN genes identifies NtPIN4 as a key regulator of axillary bud growth[J]. Physiologia Plantarum，2017，160（2）：222-239.

[9] FORESTAN C，VAROTTO S. The role of PIN auxin efflux carriers in polar auxin transport and accumulation and their effect on shaping maize development[J]. Molecular Plant，2012，5（4）：787-798.

[10] HE P，ZHAO P，WANG L M，ZHANG Y Z，WANG X S，XIAO H，YU J N，XIAO G H. The PIN gene family in cotton （Gossypium hirsutum）：Genome-wide identification and gene expression analyses during root development and abiotic stress responses[J]. BMC Genomics，2017，18（1）：507.

[11] ZHANG C H，DONG W Q，HUANG Z A，CHO M，YU Q C，WU C Y，YU C L. Genome-wide identification and expression analysis of the CaLAX and CaPIN gene families in pepper （Capsicum annuum L.） under various abiotic stresses and hormone treatments[J]. Genome，2018，61（2）：121-130.

[12] LIU B B，ZHANG J，WANG L，LI J B，ZHENG H Q，CHEN J，LU M Z. A survey of Populus PIN-FORMED family genes reveals their diversified expression patterns[J]. Journal of Experimental Botany，2014，65（9）：2437-2448.

[13] WANG Y Q，CHAI C L，VALLIYODAN B，MAUPIN C，ANNEN B，NGUYEN H T. Genome-wide analysis and expression profiling of the PIN auxin transporter gene family in soybean （Glycine max）[J]. BMC Genomics，2015，16：951.

[14] PATTISON R J，CATALá C. Evaluating auxin distribution in tomato （Solanum lycopersicum） through an analysis of the PIN and AUX/LAX gene families[J]. The Plant Journal，2012，70（4）：585-598.

[15] 劉士平，王璐，王繼榮，薛艷紅，壽惠霞. 高等植物的PIN基因家族[J]. 植物生理學通訊，2009，45（8）：833-841.

LIU Shiping，WANG Lu，WANG Jirong，XUE Yanhong，SHOU Huixia. PIN gene family in higher plants[J]. Plant Physiology Communications，2009，45（8）：833-841.

[16] LEE H，GANGULY A，LEE R D，PARK M，CHO H T. Intracellularly localized PIN-FORMED8 promotes lateral root emergence in Arabidopsis[J]. Frontiers in Plant Science，2020，10：1808.

[17] YUAN T T，XIANG Z X，LI W，GAO X，LU Y T. Osmotic stress represses root growth by modulating the transcriptional regulation of PIN-FORMED3[J]. The New Phytologist，2021，232（4）：1661-1673.

[18] SUN H W，TAO J Y，BI Y，HOU M M，LOU J J，CHEN X N，ZHANG X H，LUO L，XIE X N，YONEYAMA K，ZHAO Q Z，XU G H，ZHANG Y L. OsPIN1b is involved in rice seminal root elongation by regulating root apical meristem activity in response to low nitrogen and phosphate[J]. Scientific Reports，2018，8：13014.

[19] 武星，胡興峰，陳佩珍，孫曉波，吳帆，季孔庶. 馬尾松PmPIN1基因的克隆及功能分析[J]. 林業科學，2020，56（3）：184-192.

WU Xing，HU Xingfeng，CHEN Peizhen，SUN Xiaobo，WU Fan，JI Kongshu. Cloning and functional analysis of PmPIN1 gene from Pinus massoniana[J]. Scientia Silvae Sinicae，2020，56（3）：184-192.

[20] ZHANG H，AN H S，WANG Y，ZHANG X Z，HAN Z H. Low expression of PIN gene family members is involved in triggering the dwarfing effect in M9 interstem but not in M9 rootstock apple trees[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2015，37（5）：104.

[21] 劉小杰，樊勝，李國防，檀鳴，默寧，馬娟娟，張東，韓明玉. 蘋果全基因組PIN成員鑒定及MdPIN15的克隆和在腋芽萌發中的表達分析[J]. 園藝學報，2017，44（11）：2041-2054.

LIU Xiaojie，FAN Sheng，LI Guofang，TAN Ming，MO Ning，MA Juanjuan，ZHANG Dong，HAN Mingyu. Genome-wide identification of PIN gene family，cloning and expression analysis of MdPIN15 during axillary bud burst in Malus[J]. Acta Horticulturae Sinica，2017，44（11）：2041-2054.

[22] 姚富文，王枚閣，宋春暉，宋尚偉，焦健，王苗苗，王昆，白團輝，鄭先波. 蘋果HSP90家族基因鑒定及高溫脅迫下的表達分析[J]. 園藝學報，2021，48（5）：849-859.

YAO Fuwen，WANG Meige，SONG Chunhui，SONG Shangwei，JIAO Jian，WANG Miaomiao，WANG Kun，BAI Tuanhui，ZHENG Xianbo. Identification and expression analysis of HSP90 gene family under high temperature stress in apple[J]. Acta Horticulturae Sinica，2021，48（5）：849-859.

[23] CHEN C J，CHEN H，ZHANG Y，THOMAS H R，FRANK M H，HE Y H，XIA R. TBtools：An integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data[J]. Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202.

[24] SUBRAMANIAN B，GAO S H，LERCHER M J，HU S N，CHEN W H. Evolview v3：A webserver for visualization，annotation，and management of phylogenetic trees[J]. Nucleic Acids Research，2019，47（W1）：270-275.

[25] LESCOT M，DéHAIS P，THIJS G，MARCHAL K，MOREAU Y，VAN DE PEER Y，ROUZé P，ROMBAUTS S. PlantCARE，a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences[J]. Nucleic Acids Research，2002，30（1）：325-327.

[26] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[27] PACURAR D I，PERRONE I，BELLINI C. Auxin is a central player in the hormone cross-talks that control adventitious rooting[J]. Physiologia Plantarum，2014，151（1）：83-96.

[28] VELASCO R，ZHARKIKH A，AFFOURTIT J，…，VIOLA R. The genome of the domesticated apple （Malus × domestica Borkh.）[J]. Nature Genetics，2010，42（10）：833-839.

[29] MRAVEC J，SK?PA P，BAILLY A，HOYEROVá K，K?E?EK P，BIELACH A，PETRá?EK J，ZHANG J，GAYKOVA V，STIERHOF Y D，DOBREV P I，SCHWARZEROVá K，ROL?íK J，SEIFERTOVá D，LUSCHNIG C，BENKOVá E，ZA?íMALOVá E，GEISLER M，FRIML J. Subcellular homeostasis of phytohormone auxin is mediated by the ER-localized PIN5 transporter[J]. Nature，2009，459（7250）：1136-1140.

[30] DING Z J，WANG B J，MORENO I，DUPLáKOVá N，SIMON S，CARRARO N，REEMMER J，PěN?íK A，CHEN X，TEJOS R，SK?PA P，POLLMANN S，MRAVEC J，PETRá?EK J，ZA?íMALOVá E，HONYS D，ROL?íK J，MURPHY A，ORELLANA A，GEISLER M，FRIML J. ER-localized auxin transporter PIN8 regulates auxin homeostasis and male gametophyte development in Arabidopsis[J]. Nature Communications，2012，3：941.

[31] SIMON S，SK?PA P，VIAENE T，ZWIEWKA M，TEJOS R，KLíMA P，?ARNá M，ROL?íK J，DE RYCKE R，MORENO I，DOBREV P I，ORELLANA A，ZA?íMALOVá E，FRIML J. PIN6 auxin transporter at endoplasmic reticulum and plasma membrane mediates auxin homeostasis and organogenesis in Arabidopsis[J]. New Phytologist，2016，211（1）：65-74.

[32] 周喆，張彩霞，張利義，王強，李武興，田義，叢佩華. 蘋果LysM基因家族的生物信息學及表達分析[J]. 中國農業科學，2014，47（13）：2602-2612.

ZHOU Zhe，ZHANG Caixia，ZHANG Liyi，WANG Qiang，LI Wuxing，TIAN Yi，CONG Peihua. Bioinformatics and expression analysis of the LysM gene family in apple[J]. Scientia Agricultura Sinica，2014，47（13）：2602-2612.

[33] GARAY-ARROYO A，ORTIZ-MORENO E，DE LA PAZ SáNCHEZ M，MURPHY A S，GARCíA-PONCE B，MARSCH-MARTíNEZ N，DE FOLTER S，CORVERA-POIRé A，JAIMES-MIRANDA F，PACHECO-ESCOBEDO M A，DUBROVSKY J G，PELAZ S，áLVAREZ-BUYLLA E R. The MADS transcription factor XAL2/AGL14 modulates auxin transport during Arabidopsis root development by regulating PIN expression[J]. The EMBO Journal，2013，32（21）：2884-2895.

[34] 劉玉飛，龐丹丹，李友勇，蔣會兵，陳林波. 茶樹PIN基因家族的鑒定及表達分析[J]. 分子植物育種，2020，18（23）：7700-7710.

LIU Yufei，PANG Dandan，LI Youyong，JIANG Huibing，CHEN Linbo. Identification and expression analysis of PIN gene family in Camellia sinensis[J]. Molecular Plant Breeding，2020，18（23）：7700-7710.

[35] TIAN R Z，YANG Y，CHEN M H. Genome-wide survey of the amino acid transporter gene family in wheat （Triticum aestivum L.）：identification，expression analysis and response to abiotic stress[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2020，162：1372-1387.

[36] LUDWIG-MüLLER J，VERTOCNIK A，TOWN C D. Analysis of indole-3-butyric acid-induced adventitious root formation on Arabidopsis stem segments[J]. Journal of Experimental Botany，2005，56（418）：2095-2105.

[37] NAG S，PAUL A，CHOUDHURI M. Changes in peroxidase activity during adventitious root formation at the base of mung bean cuttings[J]. International Journal of Scientific amp; Technology Research，2013，2：171-177.

[38] AHKAMI A H，MELZER M，GHAFFARI M R，POLLMANN S，JAVID M G，SHAHINNIA F，HAJIREZAEI M R，DRUEGE U. Distribution of indole-3-acetic acid in Petunia hybrida shoot tip cuttings and relationship between auxin transport，carbohydrate metabolism and adventitious root formation[J]. Planta，2013，238（3）：499-517.