中華草龜、中華花龜及其雜種F1 代形態差異分析

賀剛，徐金根，何力，吳斌，方春林，喻亞麗，費春平

（1.江西省水產科學研究所，江西 南昌 330039；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，湖北 武漢 430223；3.九江市水產科學研究所，江西 九江 332099；4.江西金龜王實業有限責任公司，江西 上饒 334400）

中華草龜（Chinemys reevesii）隸屬龜鱉目（Testudinate）龜科（Emydidae）烏龜屬（Chinemys），俗稱烏龜、墨龜，泥龜，是常見的養殖龜種之一，在中國分布廣泛[1]。中華花龜（Ocadia sinensis）隸屬龜科花龜屬，俗稱花龜、珍珠龜，分布在中國南方地區[2]。兩者都具很高藥用、食用和觀賞價值。隨著龜類野生資源持續減少，而繁養殖規模逐年擴大，導致養殖過程中種質退化、畸形率高、性成熟延遲、餌料系數高等現象頻繁發生。因此，開展新養殖品種的繁養殖是解決龜類種質的有效途徑。近年來，已發現20多種雜交龜，新品種數量不斷增加，但報道甚少，僅見金石雜交龜[黃喉擬水龜（Mauremys mutica♀）與三線閉殼龜（Cuora trifasciata）][3]和烏花雜交龜[中華草龜（♀）與中華花龜（）][4]。迄今，已對龜鱉類形態習性[5]、生長繁育[6,7]和種群分化[8]等進行了諸多研究。

為獲得適于養殖推廣的新品系，由中華草龜（♀）×中華花龜（）雜交后培育的品種稱為烏花雜龜，具有品相好、生長快、價值高等優點[9]。近年生產實踐證明，雜種龜的生長和抗逆性明顯提高，現

已經進行了大規模養殖，具有良好的經濟價值。雜種及其親本的形態、體色、花紋等具有一定相似性，從系統形態學鑒定雜種龜更為直觀。聚類分析、判別分析及主成分分析是水生動物形態差異分析的

常用方法[10-12]。本實驗采用聚類分析、判別分析和主成分分析對中華草龜、中華花龜及其雜種的形態進行綜合分析，探究雜交種與親本間的親緣關系，建立相應的形態鑒別方法，為龜類雜交育種和生產實踐提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用龜來自江西省烏龜良種場，隨機選擇6月齡的中華草龜、中華花龜及雜種F1代各60 只，共180 只，其背面和腹面見圖1，樣本體質量、背甲長等信息詳見表1。

圖1 3 種龜的形態性狀Fig.1 Morphological demonstration of three species of tortoises

表1 3 種龜的樣本信息Tab.1 Samples date of three species of tortoises

1.2 測定方法

用精確度0.01 g 電子天平稱量體質量（Y），用精確度0.01 cm 游標卡尺測量背甲長（X1）、背甲寬（X2）、殼高（X3）、腹甲長（X4）、腹甲后半部長（X5）、腹甲前半部寬（X6）、腹甲后半部前寬（X7）、腹甲后半部后寬（X8）、甲橋長（X9）、喉盾寬（X10）、喉盾縫長（X11）、肱盾縫長（X12）、胸盾縫長（X13）、腹盾縫長（X14）、股盾縫長（X15）和肛盾縫長（X16）等17 項形態性狀。

1.3 數據處理

所測可量性狀數據都除以背甲長進行校正，以消除形態大小對測量結果的影響，所得參數經對數轉換以除去異速生長產生的差異。采用Excel 和SPSS16.0 軟件處理數據，采用聚類分析、主成分分析、判別分析3 種多元分析方法對不同種龜及其雜交種進行形態差異分析。

采用歐氏距離法進行聚類分析。判別分析采用逐步判別法分析，選取對判別過程貢獻大的參數建立3 種龜的群體性狀判別函數。主成分分析是將多個形態指標綜合成少數或幾個因子，用以說明不同種簡單差異大小。

2 結果與分析

2.1 可數性狀比較

校正后的中華草龜、中華花龜和雜種龜群體各形態性狀比例參數見表2，從形態上看，背甲寬/背甲長、殼高/背甲長、腹甲長/背甲長、腹甲后半部長/背甲長、腹甲前半部寬/背甲長、喉盾寬/背甲長、喉盾縫長/背甲長表現出中華草龜>雜種龜>中華花龜，在體型特征上存在差異。

表2 3 種龜可量比例性狀均值及標準差Tab.2 Overall mean and standard deviation of relative values of meristic characters of two species of tortoises and their hybrid

2.2 聚類分析

3 種龜群體可量比例性狀經對數轉化形態數據見表3，基于歐氏距離進行聚類分析，建立親緣關系樹如圖2。中華草龜和雜種龜在形態上最為接近，聚為一組，而中華花龜與草龜、雜種龜形態差異較大。

表3 3 種龜群體的形態距離（歐氏距離）Tab.3 Morphological distances calculated by cluster analysis among three species of tortoises

圖2 3 種龜群體的形態聚類分析Fig.2 Morphological cluster plot of three species of tortoises

2.3 判別分析

采用逐步判別分析，從草龜、花龜及雜種龜的15 個比例參數篩選出有顯著性貢獻的10 個變量：背甲寬/背甲長（X1）、殼高/背甲長（X2）、腹甲前半部寬/背甲長（X3）、腹甲后半部前寬/背甲長（X4）、腹甲后半部后寬/背甲長（X5）、甲橋長/背甲長（X6）、喉盾寬/背甲長（X7）、喉盾縫長/背甲長（X8）、腹盾縫長/背甲長（X9）和肛盾縫長/背甲長（X10）。當判別函數含有以上10 個變量時，建立的判別函數效果良好，所得判別公式如下：

中華草龜=783.936X1＋666.790X2＋117.351X3－108.260X4－185.567X5＋714.807X6＋593.752X7＋508.921X8＋71.984X9－14.342X10－665.829

中華花龜=857.281X1＋471.441X2＋59.295X3－132.825X4－64.874X5＋684.733X6＋440.335X7＋306.659X8＋172.282X9－19.938X10－575.971

雜種龜=825.599X1＋536.489X2＋119.892X3－170.109X4－113.135X5＋775.956X6＋480.404X7＋456.357X8＋149.029X9－60.558X10－635.052

將3 種龜的10 個比例性狀數值帶入各判別函數中，以所得最大函數值來判別該龜所屬類別。根據判別函數對所有觀測樣本進行預測分類，綜合判別準確率達到93.3%（表4）。60 只中華草龜代入判別函數回代分類，與實際相符的58 只，2 只錯判為雜種龜，判別準確率為96.7%；60 只中華花龜回代分類，與實際相符的57 只，3 只錯判為雜種龜，判別準確率為95.0%；60 只雜種龜回代分類，與實際相符的53 只，1 只錯判為中華草龜，6 只錯判為中華花龜，判別準確率為88.3%。

表4 3 種龜判別分析后的結果Tab.4 The results of discrimination analysis of three species of tortoises

2.4 主成分分析

對草龜、花龜及雜種龜群體的可量比例參數數據進行主成分分析，共提取8 個主成分，累計貢獻率達85.05%。其中前4 個主成分的貢獻率分別為33.81%、11.01%、10.25%和8.13%，累計貢獻率達63.20%，這4 個主成分覆蓋群體總變異的絕大部分，說明幾個相互獨立因子可以分析3 種龜的形態差異所隱含的信息。

3 種龜形態性狀的特征值、貢獻率和累計貢獻率見表5。對第一成分起主要作用的是：喉盾縫長/背甲長、喉盾寬/背甲長、殼高/背甲長、腹甲后半部前寬/背甲長、股盾縫長/背甲長、腹甲前半部寬/背甲長和腹甲長/背甲長，其中喉盾縫長、喉盾寬、殼高對主成分1 有主要貢獻（>0.700）；對第二成分起主要作用的是：腹甲后半部后寬/背甲長、肛盾縫長/背甲長、背甲寬/背甲長和腹甲后半部長/背甲長，其中腹甲后半部后寬對主成分2 有主要貢獻（>0.700）；對第三成分起主要作用的是：甲橋長/背甲長、腹盾縫長/背甲長和腹甲長/背甲長，其中甲橋長、腹甲縫長對主成分3 有主要貢獻。

從3 種龜的散點圖分布情況（圖3）可以看出種間形態差異較大。雜種龜與中華草龜、中華花龜均有較大的重疊，在性狀特征上與親本均接近。中華草龜與中華花龜間沒有重疊。

圖3 3 種龜的主成分分析圖Fig.3 Scatter plots of principle components of two species of tortoises and their hybrid

3 討論

3.1 形態差異分析

雜交優勢表現為雜種生存及繁殖能力的提高，這類在生物進化學才有適應意義。國內外有很多龜鱉類雜交優勢育種和利用的報道，并取得一定的成果。以洞庭湖鱉（♀）和黃河鱉（）雜交并經過5 代群體選育的綠卡鱉，生長速度大于黃河鱉，而在稚幼階段明顯優于其兩親本[13]。英明中華鱉是采用連續雜交技術對不同品系中華鱉進行遺傳選育而得到的新品種，雜交后代優勢明顯[14]。潘志等[15]對外來引進的刺鱉（Apalone spinifera）和珍珠鱉（Apalone ferox）雜交子代的形態與生長進行比較，結果表明，與親本相比，雜交子代攝食能力強，養殖成活率較高，具有較明顯的雜種優勢。至今，發現龜類雜交已有30 多種[16]，但有關報道甚少。黃喉擬水龜（♀）與三線閉殼龜（）的雜種后代形態保留了雙親本獨有特征，但在形態特征上接近母本黃喉擬水龜，在背甲紋路、腹甲黑斑、四肢和尾腹面的皮膚顏色及起點位置等比例性狀存在差異[3]。

本研究表明，雜種龜在個體形狀、體色條紋、生長速度等方面遺傳了中華草龜和中華花龜雙親的特征，也有顯著的差異。主要表現在背甲顏色、棱突，皮膚條紋與親本對比差異強烈，在可數性狀方面，雜交龜與親本無顯著差異。在可量比例性狀上，部分指標反映中華草龜>雜種龜>中華花龜，在體型特征上存在差異。聚類分析顯示，在整體形態上，雜交龜介于親本之間，但更接近母本中華草龜。判別分析可見，所得最大函數值來判別龜屬，綜合判別準確率達到93.3%，可以較為準確判別中華草龜、中華花龜及其雜種。由圖3 可知，3 種龜形態差異程度，雜種龜與親本重疊部分多，在形態特征上與親本均接近，而中華草龜與中華花龜間沒有重疊部分。本研究中，三種分析方法均得出了相同的結論。生物形態是物種對環境適應的表現，也是物種多個性狀的集合，一般受遺傳因子和環境因素的共同作用[10,17]。

3.2 聚類分析、判別分析和主成分分析在龜類保護中的應用

形態特征是物種間差異的直接體現，也是相似物種初步鑒別依據。不同物種的雜交后代通常表現兩個親本的中間態[18-20]，可數和可量性狀在形態學標記中尤為重要。本實驗測量了雜交龜及其親本的形態特征，通過聚類分析、判別分析和主成分分析等統計學方法處理分析，結果顯示雜交龜保留親本雙方的性狀特征，對現有龜類雜交種資資源進行評估，為龜類種質資源保護和雜交選育提供理論依據。

在可量性狀比值方面，背甲寬/背甲長、殼高/背甲長、腹甲長/背甲長、腹甲后半部長/背甲長和腹甲前半部寬/背甲長等體型特征上存在差異，且雜種龜介于親本之間，在親本性狀表現具有偏向性。推測來自親本的遺傳因子在雜交子代性狀表達上具有喜好選擇性。

聚類分析從染色體、蛋白質和DNA 分子等不同水平進行龜鱉類的系統進化關系分析，得出不同的聚類分析結果。黃雪貞等[21]采用RAPD 技術分析了中華鱉日本群體（♀）×黃河群體（）的雜交子代的遺傳多樣性，顯示雜交子代遺傳多樣性優于親代。賀剛等[22]利用線粒體DNA 的細胞色素b 基因分析表明，雜交龜與草龜遺傳距離最小，與花龜次之，與條頸龜（Cyclemys tcheponensis）和果龜（Notochelys platynota）最大。本實驗從形態學角度探究了雜交龜與親本間的遺傳變異關系，發現雜種龜與母本中華草龜形態距離更近，推測來自母本的遺傳因子在性狀表達調控方面更具優勢。

判別分析是水生動物常用的鑒別方法。通過建立判別函數和相應的測量指標，使函數的形式較為簡便，且獲得更好的判別效果[23-25]。梁宏偉等[26]通過逐步判別法建立了淮河、黃河和日本3 個品系中華鱉的判別函數。結果顯示淮河品系中華鱉雌雄判別準確率較高，綜合判別率為88.3%，判別效果最好；而日本品系中華鱉雌雄性別判別準確率相對較低。楊貴強等[27]對安徽黃緣閉殼龜、臺灣黃緣閉殼龜和黃喉擬水龜3 種稚龜進行了判別分析，得出貢獻較大的主要變量有腹甲寬／背甲長、甲橋長／背甲長、肱盾寬／背甲長、肱盾縫長／背甲長和胸盾縫長／背甲長5 個參數可作為鑒別上述3 種觀賞稚龜的主要客觀依據。本實驗采用了逐步判別分析的方法，按照入選性狀的差異大小逐步進行判別，最后選取了10 個變量，綜合判別準確率達到93.3%，貢獻較大的變量主要集中在龜的腹部和體寬，判別效果良好。構建的判別公式提供了一種簡單易行的判別草龜、花龜及其雜種種質的方法。

主成分分析是將多個觀察指標簡化為少數方差貢獻率較大綜合因子（主成分）的方法，通過主成分分析圖概括不同群體間的形態差異[28]。本研究對3 種龜的15 個比例性狀進行主成分分析，對第一成分起主要作用的是喉盾縫長、喉盾寬、殼高，對第二成分起主要作用的是腹甲后半部后寬，對第三成分起主要作用的是甲橋長、腹甲縫長。3 種龜的形態差異主要體現在腹甲體型因子上。

綜上所述，龜類的外部形態測量為雜種鑒定提供了一個簡潔高效的途徑。但是，要全面評價雜交種及親本遺傳關系，還應在生理生化、分子標記等水平上深入研究。