蝦肝腸胞蟲實時熒光定量PCR 檢測方法的建立及應用

張先東，付靜靜，劉偉琪，羅穎，鄧樺，楊鴻，侯月娥

（1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528000；2.珠海科藝普檢測科技有限公司，廣東 珠海 519000）

蝦肝腸胞蟲屬于微孢子蟲門（Microsporidia）、腸胞蟲科（Enterocytozoonidae）、腸胞蟲屬（Enterocytozoon），是一種專性胞內寄生蟲，能使對蝦生長緩慢、大小不一，空耗飼料，是對蝦養殖業減產和成本增加的重要病原之一[1]，2004 年由泰國研究者從生長緩慢的斑節蝦（Penaeus monodon）體內首次發現，2009 年被分離及命名[2]。近年來，我國沿海主要養殖區域南美白對蝦蝦苗、成蝦以及塘底泥和水源中均有檢測到EHP 的報道，部分地區檢出率處于較高水平[3]。隨著國內南美白對蝦養殖規模的不斷擴大，EHP 又能通過水平和垂直方式傳播，且暫未發現有效的防控藥物，導致養殖風險日趨嚴峻[4]。感染對蝦30 d 左右才會觀察到生長緩慢的現象，繼續養殖只會造成飼料空耗，只能通過“排塘”方式及時止損，增加了養殖成本[5]。因此，建立一種準確的檢測方法能及時發現并降低病原攜帶風險，及時發現及時止損。

目前主要的檢測方法有染色鏡檢、普通PCR、巢式PCR、實時熒光定量PCR、原位雜交、環介導等溫擴增技術和RPA 技術等[1]。常曉晴等[6]比較了幾種常用的染色方法，發現Masson 染色對組織的染色效果最佳，檢出率高，但是該方法對感染早期或載量低的樣品檢出效果較差。EHP 分子檢測方法的開發主要基于EHP 小亞基核糖體RNA（Small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）、孢壁蛋白（Spore wall protein，SWP）、18S 核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）。比較基于上述三種基因保守序列建立的巢式PCR 后發現，基于SSU rRNA 的巢式PCR 具有較好的靈敏度和特異性[7]。陳進會等[8]基于18S 核糖體保守區域建立了檢測EHP 的LAMP法。該方法能在30 min 內完成，檢測限為0.44 pg·μL-1。馬來等[9]基于SSU rRNA 和TaqMan-MGB 探針建立的方法靈敏度低至10 copies·mg-1。侯月娥等[10]建立了能同時檢測EHP 和蝦血細胞虹彩病毒（Shrimp Hemocyte Iridovirus，SHIV）的qPCR，檢測限為10 copies·μL-1，是普通PCR 的100 倍。Li 等[11]建立的RPA 方法在38.5℃條件下耗時15 min 即可完成對EHP 的檢測，檢測限為10 copies·μL-1，成本比qPCR 更低。由于對檢測時效性和準確性要求較高，而實時熒光定量PCR 技術成熟，準確性高、耗時短、能實現定量檢測病原，目前已被國內外實驗室廣泛使用[3]。

本研究擬建立基于EHP 18S rRNA 基因保守序列的實時熒光定量PCR 法，利用建立的方法，對珠三角部分地區主要養殖區南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）蝦苗及成蝦樣品進行檢測，調查EHP 在珠三角部分地區的流行情況，旨在提高當地養殖者的防控意識，同時為EHP 的防控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

蝦肝腸胞蟲陽性樣品來自珠海科藝普檢測科技有限公司，并已經過PCR 擴增及測序。

檢測樣品主要來自珠海市、中山市、江門市等地密集養殖區養殖戶和蝦苗場，其中南美白對蝦蝦苗樣品699 份、成蝦樣品135 份。蝦苗樣品采用充氧袋裝，成蝦樣品帶水瓶裝或使用95%酒精浸泡，將采集的樣品快速送至實驗室進行處理，保存在-20℃冰箱中待測。

1.1.2 主要試劑

病毒DNA/RNA 小量制備試劑盒購自廣州吉瑞基因科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA 純化回收試劑盒、普通質粒小量提取試劑盒均購自Omega 公司；2×Taq Man qPCR Mix 購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物與探針的設計合成

根據GenBank 中蝦肝腸胞蟲18S 基因序列（登錄號：KX932044），結合Primer Premier 5 和Oligo7軟件，設計特異性的引物和熒光探針（表1），由上海輝睿生物科技有限公司合成。

表1 引物和探針序列Tab.1 Sequences of primers and probe

1.2.2 樣品前處理

將蝦苗裝入內有鋼珠的研磨管中，不超過管內體積的2/3，加入0.5～1 mL PBS，將研磨管置于組織研磨儀中研磨3 min，取出研磨管10 000 r/min 離心1 min，吸取上清液200 μL 到離心管中備用。

剪取成蝦樣品肝胰腺、鰓、肌肉到研磨管中，后續處理同蝦苗。

1.2.3 核酸提取

按照廣州吉瑞基因科技有限公司的病毒DNA/RNA 小量提取試劑盒說明書提取蝦苗及成蝦樣品的基因組DNA。

1.2.4 標準品的制備

將提取的基因組DNA 進行EHP 目的基因的擴增。擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸30 s；共40 個循環；在反應結束后，取5 μL PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化，克隆到PUC57 載體中，轉化到DH5α 感受態細胞，篩選陽性克隆重組質粒，送至上海生工生物工程科技有限公司測序鑒定，同時對陽性質粒進行濃度測定、拷貝數計算，分裝，-80℃保存備用。

1.2.5 方法的建立及反應條件的優化

qPCR 反應體系參照2×Taq Man qPCR Mix 試劑盒說明書進行配制。將引物和探針稀釋為不同終濃度（0.1～0.6 μmol·L-1），反應體系為25 μL，2× Taq Man qPCR Mix 12.5 μL，模板DNA 2 μL，用ddH2O水補足。擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性10 s；退火溫度范圍設計為55℃～65℃，30 s，40 個循環，根據不同條件進行優化，篩選出最佳的引物及探針濃度，確定最佳退火溫度。

1.2.6 標準曲線的建立

將制備好的EHP 標準品進行10 倍梯度稀釋，稀釋后濃度為1.3×107～1.3×101copies·μL-1，共7個梯度。以稀釋好的標準品為模板，使用1.2.5 篩選優化后的體系及條件進行qPCR 擴增。根據標準品拷貝數與Ct 值建立標準曲線。

1.2.7 敏感性試驗

將按照1.2.3 提取的陽性樣品核酸進行10 倍梯度稀釋（100～10-4），以各梯度核酸為模板，用建立的qPCR 和標準《南美白對蝦肝腸胞蟲巢式聚合酶鏈式反應檢測方法（DB32/T 3802—2020）》分別對各梯度核酸進行擴增，比較兩種方法的靈敏度。

1.2.8 特異性試驗

選擇本實驗室保存的十足目虹彩病毒1（Infection with decapod iridescent virus 1,DIV1）、白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、傳染性皮下造血器官壞死病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）的核酸為模板，以EHP 陽性樣品提取的核酸為陽性對照，以健康對蝦核酸為模板作為陰性對照，ddH2O 作為空白對照，使用建立的方法進行擴增。

1.2.9 重復性試驗

用建立的方法對已稀釋的梯度質粒（1.3×106copies·μL-1、1.3×104copies·μL-1和1.3×102copies·μL-1）進行批內重復試驗。將各梯度質粒在-20℃儲存30 d 后進行批間重復試驗，每個濃度重復3 次。對結果進行方差分析，計算批內和批間的變異系數。

1.2.10 樣品檢測

使用qPCR 與巢式PCR 同時檢測部分實際樣品。應用qPCR 檢測珠三角部分地區采集的南美白對蝦蝦苗、成蝦樣品，了解EHP 在該地區的流行情況，為當地水產養殖業提供一定的參考。

2 結果與分析

2.1 標準品的制備

將重組質粒進行PCR 擴增后獲得的目的片段與預期大小一致。測序結果分析發現，EHP 目的基因序列與GenBank 公布的參考序列KX932044 的同源性為100%，表明目的基因成功克隆到PUC57載體中，成功構建了重組質粒，重組質粒的濃度為50 ng·μL-1，通過拷貝數計算公式，換算成拷貝數1.3×1010copies·μL-1，將其作為標準品保存在-80℃備用。

2.2 反應條件的優化

比較和優化了不同濃度下的引物及探針濃度、退火溫度，確定反應體系為25 μL：2×Taq Man qPCR Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，探針0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8 μL。在反應體系中上下游引物最佳濃度為0.4 μmol·L-1，探針0.2 μmol·L-1。PCR 條件：95℃預變性5 min；95℃變性10 s；退火溫度60℃，30 s；40 個循環。

2.3 標準曲線的建立

利用本方法擴增了不同梯度（1.3×107～1.3×101copies·μL-1）稀釋的標準品，結果見圖1。建立擴增產物循環數Ct 值（Y）與標準模板拷貝數對數值Log（Conc）（X）關系的標準曲線（圖2）。標準曲線為Ct=-3.21Log（Conc）+38.26，相關系數R2=0.998，擴增效率為104.9%。

圖1 EHP 標準品模板擴增曲線Fig.1 Amplification Curve of EHP standard templates

圖2 EHP 標準品模板擴增標準曲線Fig.2 The standard curve of EHP standard template

2.4 敏感性試驗

將10 倍梯度稀釋后的EHP 陽性核酸（100、10-1、10-2、10-3、10-4）分別用本試驗建立的方法和巢式PCR 進行擴增（圖3、圖4）。擴增曲線表明，本試驗建立的方法可以在100～10-3范圍內檢測到擴增的熒光信號，而巢式PCR 第一輪能在100～10-1觀察到明亮的電泳條帶，10-2能觀察到微弱的電泳條帶，第二輪在100～10-2觀察到明亮的電泳條帶。本試驗建立方法的靈敏度是巢式PCR 的10 倍。

圖3 qPCR 靈敏度檢測結果Fig.3 Sensitivity test of qPCR method

圖4 巢式PCR 靈敏度檢測結果Fig.4 Sensitivity test of nested PCR method

2.5 特異性試驗

以WSSV、IHHNV、DIV1、EHP 陽性核酸、健康對蝦核酸和去離子水為模板，用EHP 引物進行擴增，只有EHP 陽性核酸模板檢測到了熒光信號，為陽性，其他病毒、陰性對照、空白對照均未檢測到熒光信號，均為陰性（圖5）。

圖5 qPCR 特異性檢測結果Fig.5 Specificity of qPCR method

2.6 重復性試驗

不同濃度標準品按要求進行擴增后，批內、批間的均值、方差及變異系數見表2。結果發現：批內批間的變異系數均小于1.5%，表明該方法的穩定性良好。

表2 重復性試驗結果Tab.2 Repeatability test

2.7 樣品檢測

2.7.1 qPCR 與巢式PCR 同時檢測臨床樣品效果比較

分別使用建立的qPCR 和巢式PCR 對183 份臨床樣品進行檢測，其中有161 份均檢測為陰性，18 份均檢測為陽性。使用qPCR 檢測出陽性22 份，Ct 值在17.56～35.12 之間，換算成拷貝數為0.95×101～2.05×106copies·μL-1。有4 份樣品使用巢式PCR 未檢出，使用qPCR 檢測Ct 值在31.28～35.12之間，換算成拷貝數為0.95×101～1.49×102copies·μL-1。兩種方法符合率為97.81%。

2.7.2 應用qPCR 對珠三角部分地區樣品檢測結果

用建立的qPCR 檢測珠三角部分地區采集的南美白對蝦蝦苗及成蝦樣品，結果表明，調查地區的蝦苗及成蝦樣品均有檢出，其中中山市蝦苗及成蝦檢出率最低，分別為5.38%（7/130）、43.24%（16/37）；江門市蝦苗及成蝦檢出率最高，分別為18.55%（23/124）、66.67%（30/45）；蝦苗總體檢出率為10.75%（75/699），成蝦總體檢出率為54.07%（73/135），成蝦檢出率較高（表3）。

表3 珠三角部分地區樣品中EHP 檢出率/%Tab.3 Detection rate of EHP in samples from parts of Pearl River Delta region

3 討論

對蝦感染EHP 后不會直接死亡，主要引起對蝦生長緩慢。有研究表明，EHP 感染后會改變對蝦腸道優勢菌群的種類，改變菌群結構多樣性，降低了機體的抵抗力，增加機體對其他疾病（如急性肝胰腺壞死、感染性肝胰腺壞死、弧菌等）的易感性[12,13]。通過與未知病原混合感染，可能會導致白便綜合征，糞便將EHP 孢子傳播到水體中進一步擴散[14]。由于沒有有效的治療藥物，而且塘底泥和水體中的EHP 孢子不易被殺滅，因此切斷傳染源和傳播途徑是防控EHP 的重要手段，如加強對蝦苗、蝦料、塘底泥和水源的檢測，選擇優質苗種、蝦料，通過檢測結果指導有效處理水源和塘底泥。

近年來，qPCR 已被國內外實驗室廣泛使用，技術成熟、靈敏度和特異性高、穩定可靠。本研究根據EHP 的18S rRNA 保守區域設計特異性的引物和探針，通過優化反應體系、引物及探針濃度、退火溫度以及循環數，提高方法的靈敏度、特異性和可重復性，開發一種能準確檢測EHP 的qPCR 方法。結果表明，建立的方法檢測限為1.3×101copies·μL-1，是巢式PCR 的10 倍，靈敏度高。與其他常見疾病無交叉反應，特異性良好。批內批間的變異系數均小于1.5%，穩定性良好。與巢式PCR 檢測實際樣品相比符合率為97.81%，qPCR 能檢測到更低載毒量的樣品，且耗時更短，操作更簡單。

本研究建立的方法與前期馬來等[9]建立的qPCR檢測限相近，高于劉珍等[15]基于SSU 基因、汪浩等[16]基于SWP 基因建立的SYBR qPCR 的靈敏度。使用建立的方法對珠三角部分地區收集的南美白對蝦蝦苗及成蝦樣品均有檢出，成蝦檢出率較高。其中江門市蝦苗及成蝦樣品中檢出率均較高，中山市蝦苗及成蝦樣品檢出率最低。苗種質量和養殖水平可能是造成檢出率較高的重要原因。調查地區蝦苗總體檢出率為10.75%，成蝦總體檢出率為54.07%。前期有研究者在粵西地區對蝦樣品EHP檢出率為41.38%，汕尾、茂名等地幼蝦EHP 檢出率為20%～40%[17,18]。結合本次調查結果說明，EHP 在廣東沿海主要養殖區呈現流行趨勢，部分地區檢出率較高，需防范爆發風險。本研究建立的方法靈敏度高、特異性和穩定性良好、耗時短，在臨床樣品檢測中結果可靠，應用前景良好。