青蒿和檳榔制劑浸泡對錦鯉非特異性免疫因子活性、鰓及鰓絲組織病變的影響

馬嬌嬌，許斌，韋永春，曹鑫盛，張震，張其杰，陳成勛

（1.天津農學院天津水產生態及養殖重點實驗室，天津 300380；2.天津隆錦水產養殖有限公司，天津 300382；3.天津贊蘭科技有限公司，天津 300380）

錦鯉（Cyprinus carpio）體格健美、色彩艷麗，具極高的觀賞和飼養價值，有“水中活寶石”、“會游泳的藝術品”的美稱[1]。但養殖過程中，經常受到體表寄生蟲及細菌性疾病的困擾,且病癥出現晚，難以治療，因此，疾病的防治極為重要。錦鯉疾病通常有真菌性疾病、細菌性疾病、寄生蟲性疾病等[2]。如水霉病、細菌性疾病等。細菌性疾病的產生主要是水環境極容易產生細菌，如白皮病、爛鰓病等，都屬于細菌性疾病。水產養殖中，不可避免會產生寄生蟲的疾病，如小瓜蟲、苯尼登蟲等。這四種水產養殖病害，藥物控制方法相對較為有效，而藥物控制方法分別為治療性藥物以及預防性藥物兩種類型[3,4]。現階段，我國針對水產病害研發的水產疫苗僅有幾種確定可行，因此尋找可利用的水產疾病預防方法十分重要[4]。

中草藥是我國純天然的醫藥瑰寶，具有安全性高、毒副作用小、抗藥性弱、價格低等優點。此外，中草藥還具有驅蟲，防病治病，抗菌及增強免疫力等作用[5]。既往研究表明，青蒿（Areca catechu）和檳榔（Artemisia carvifolia）對滅殺大菱鲆（Scophthalmus maximus）體外纖毛蟲有良好效果；對錦鯉鰓部指環蟲有一定滅殺效果。在防治錦鯉疾中，中草藥的應用方式主要有飼料添加以及藥物浸泡等。本試驗使用藥物浸泡方法研究青蒿和檳榔制劑對錦鯉血清免疫指標及鰓部組織的影響，可為水產養殖疾病的中藥防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

錦鯉購自天津隆錦水產養殖有限公司，消毒處理后放入養殖箱中暫養3 d，以適應環境。

本試驗所用中藥為天津隆錦水產養殖有限公司提供，青蒿與檳榔1∶1 混合，粉碎后過40 目篩，后分別稱重裝入無紡布袋，形成緩解溶液的形式，放干燥陰涼處備用。

1.2 方法

選取健康、標準和規格基本一致的平均體質量（45.00±3.00）g，平均體長（17.00±2.00）cm 的錦鯉375 尾，分為5 組，每組3 個平行。掛袋藥浴濃度分別為0 mg·L-1（對照組）、6.25 mg·L-1（A 組）、12.5 mg·L-1（B 組）、125 mg·L-1（C 組）和250 mg·L-1（D組）。試驗用養殖箱規格為780 mm×575 mm×467 mm（實際加水110 L）。

每天早9 時和晚16 時投喂基礎飼料，飼料購自天津隆錦水產養殖有限公司，粗蛋白含量為30%，粗脂肪含量為6%，投飼率為1%～2%，水溫控制在（28.5±1.0）℃，pH7.0～7.5，溶解氧5～6 mg·L-1，清理袋子保證藥物釋放。試驗開始的第0 d、3 d、6 d、9 d、12 d 以及15 d 從每個養殖箱中隨機取3 尾魚進行腹部抽血，采用加入edta 的抗凝試管保存。通過離心機將血液總量的三分之一取上清液，4℃、2 500 r/min 離心20 min 后置于-20℃中保存，用于溶菌酶（LZM）活性的測定。剩余血液置于室溫中凝集20 min 后，以2 500 r·min-1速度離心20 min，仔細收集上清液保存于-20 ℃以備測定C3a、C5aR、IL-6、LZM、PGE2 及PGF-2a。試驗開始第0 d，隨機取3 尾抽血后的魚，置于冰上取鰓部組織，用生理鹽水清洗后，放入福爾馬林固定液中，用于制作組織切片。試驗開始第9 d，將所有抽血后的魚置于冰上取鰓部組織，用生理鹽水清洗后，放入福爾馬林固定液中，用于制作組織切片。

魚鰓切片制作參照周凱（2019）切片制作方法，用HE 染色[6]；C3a、C5aR、PGE2、PGF-2a、LZM 和IL-6 采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。

1.3 數據統計

所有數據以平均值±標準誤表示，用SPSS 22.0進行單因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD 法多重進行比較分析，P<0.05 為差異顯著性標準。標準曲線采用WPS 2019 繪制。

2 結果與分析

2.1 青蒿和檳榔制劑浸泡對錦鯉血清中C3a 含量的影響

同一天內，實驗組與對照組錦鯉血清中C3a 含量在第3 d、6 d、9 d、12 d、15 d 與第0 d 相比變化顯著，且與浸泡濃度成正比（P<0.05）；同一組中，C3a含量隨著浸泡天數增加先升高后降低，在第9 d 達最高值，除對照組外，其他組第3 d、6 d、9 d、12 d、15 d 與第0 d 相比變化顯著（P<0.05）。D 組C3a 含量第9 d 達最高值（表1）。

表1 藥物浸泡對錦鯉血清C3a 含量的影響Tab.1 Effect of drug soaking on serum C3a content of koi carp（Cyprinus carpio）

2.2 青蒿和檳榔制劑浸泡對錦鯉血清中C5aR 含量的影響

同一天內，各實驗組與對照組錦鯉血清中C5aR 含量無顯著變化（P>0.05）；同一組中，C5aR 含量隨著天數增加先增高后降低，D 組第3 d、6 d、9 d、12 d 與第0 d C5aR 含量變化顯著（P<0.05）；其余各組C5aR 含量無顯著變化（P>0.05）。B 組C5aR 含量第12 d 達最高值（表2）。

表2 不同浸泡濃度對錦鯉血清中C5aR 含量的影響Tab.2 Effect of different soaking concentration on C5aR content in serum of koi carp Cyprinus carpio

2.3 青蒿和檳榔制劑浸泡對錦鯉血清中PGE2 含量的影響

同一天內，實驗組與對照組錦鯉血清中PGE2含量在第3 d、6 d、9 d、12 d、15 d 與第0 d 相比變化顯著，與浸泡濃度成正比（P<0.05）；同一組中，PGE2含量隨著天數增加先升高后降低，在第9 d 達最高值，且第3 d、6 d、9 d、12 d、15 d 與第0 d 相比變化顯著（P<0.05）。PGE2 含量在浸泡濃度D 組第9 d 達最高值（表3）。

表3 藥物浸泡對錦鯉血清PGE2 含量的影響Tab.3 Effect of drug soaking on serum PGE2 content of koi carp Cyprinus carpio

2.4 青蒿和檳榔制劑浸泡對錦鯉血清中PGF-2a含量的影響

同一天內，各實驗組與對照組錦鯉血清中PGF-2α 含量無顯著變化（P>0.05）；同一組中，PGF-2α 含量與0 d 相比顯著升高（P<0.05），B、C、D 組第3 d、6 d、9 d、12 d、15 d 與第0 d C5aR 含量變化顯著（P<0.05）；其余組PGF-2α 含量無顯著變化（P>0.05）。PGF-2a 含量在B 組第12 d 達到最高值（表4）。

表4 不同浸泡濃度對錦鯉PGF-2α 含量的影響Tab.4 Effects of different soaking concentrations on PGF-2 α content of koi carp Cyprinus carpio

2.5 青蒿和檳榔制劑浸泡對錦鯉血清中LZM 含量的影響

同一天內，實驗組與對照組錦鯉血清中LZM含量變化顯著，且與浸泡濃度成正比（P<0.05）；同一組中，LZM含量隨著天數增加先升高后降低，在第9 d 達最高值，且第3 d、6 d、9 d、12 d、15 d 與第0 d 相比變化顯著（P<0.05）。LZM含量在D 組第9 d 達最高值（表5）。

表5 藥物浸泡對錦鯉血清LZM 含量的影響Tab.5 Effect of drug soaking on LZM activity in serum of koi carp Cyprinus carpio

2.6 青蒿和檳榔制劑浸泡對錦鯉血清中IL-6 含量的影響

同一天內，D 組錦鯉血清中IL-6 含量在第12 d、15 d 與其他組相比顯著增高（P<0.05），其余各組均無顯著變化（P>0.05）；同一組中，對照組及A、B、C 組IL-6 含量先增加后降低，C 組在第3 d 達到最高，其他組第6 d 達最高值，變化不顯著（P>0.05）；而D 組呈現先降低后升高的趨勢，且第12 d、15 d變化顯著（P<0.05）。IL-6 含量在浸泡濃度D 組第9 d 達到最高值（表6）。

表6 不同浸泡濃度對錦鯉血清中IL-6 含量的影響Tab.6 Effects of different soaking concentrations on the content of IL-6 in serum of koi carp Cyprinus carpio

2.7 青蒿和檳榔制劑浸泡對錦鯉鰓部表觀變化的影響

對照組第9 d 鰓絲出現病變，各實驗組錦鯉鰓部未出現明顯形態學異常變化，鰓絲末端并沒有因藥物濃度變大而充血、紅腫，炎癥細胞也沒有增多（圖1）。

圖1 不同浸泡濃度對錦鯉鰓部表觀變化的影響Fig.1 The effect of different immersion concentration on the apparent changes of the gill of koi carp Cyprinus carpio

3 討論

3.1 青蒿和檳榔制劑浸泡對錦鯉血清中C3a 和C5aR 含量的影響

補體系統是一個具有精密調控機制的復雜生物反應系統[7]。補體C3a、C5a 主要是通過特異性激活其相應的補體片段3a 受體（C3aR receptor,C3aR）、補體片段5a 受體（C5aR receptor，C5aR）來發揮生物學效應。呂麗剛[8]證實了草魚（Ctenopharyngodon idella）C5、C5a 和C5aR 在抗草魚呼腸孤病毒（GCRV）感染過程中具有免疫效應。其中補體活化的產物C3a 可與其受體結合引發下游信號通路發揮出誘導炎癥等生物學效應[9]。補體C3 功能軸的下游通路與C3 激活后的產物包含核轉錄因子（NF-κB）、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K/Akt）等炎癥通路及IL-6、腫瘤壞死因子（TNF-α）等炎癥因子[10]。C3a 在機體防御過程中可通過調理吞噬細胞、免疫作用等機制清除病原體[11]。而孟兆娜[12]等發現，復方中草藥能顯著提升鏡鯉（Cyprinus carpio var.specularis）幼魚的補體C3a。

C5aR 廣泛分布于免疫細胞和機體組織中[13]，與機體局部的C5a 結合后活性表達。C5aR 是補體裂解片段中表達過敏毒素作用最強的介質[14]。高濃度的C5aR 可以增強機體的免疫力[15]，高濃度的C5aR可導致炎癥反應使機體嚴重受損[16,17]。研究發現，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）C5aR 存在于B 淋巴細胞和粒細胞表面[18]，C5aR 只與虹鱒外周血細胞中的粒細胞結合[18]，C5aR 抗體能抑制補體活化后虹鱒外周血細胞向過敏毒素片段蛋白的趨化現象[19]。

本實驗中，數據分析得知青蒿與檳榔浸泡錦鯉初期C3a 和C5aR 含量升高，表明補體系統激活后，C3a、C5aR 含量降低，炎性減弱，可能與藥物沉積及魚體適應有關，且含量與藥物濃度成正比。表明該復方藥物能調節錦鯉血清C3a、C5aR 含量起到了消炎作用，與張雪飛等[20]的研究結果一致。

3.2 青蒿和檳榔制劑浸泡對錦鯉血清中PGE2 和PGF-2a 含量的影響

前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是在致炎因子作用下，局部組織產生和釋放的、具有致炎致痛作用的炎癥介質（Inflammatory mediator），主要有松弛子宮平滑肌，抑制子宮平滑肌自發性收縮等生理功能[21]。趙衛紅[22]研究表明，大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）產卵過程通過17α-羥基孕酮和前列腺素F2a（prostaglandin F2a，PGF-2a）調控，可以強烈地收縮子宮平滑肌，降低子宮內流血量[23]。正常情況下，兩者動態平衡，共同調節著子宮平滑肌的收縮和松弛。病理情況下，一旦產生過多PGF-2a，使得PGF-2a/PGE2 比值增大，就會導致子宮平滑肌收縮，引起痙攣和疼痛。張爽[24]等在研究中藥散劑益母散對孕鼠子宮平滑肌張力影響的試驗中檢測發現，孕鼠血清中PGE2 含量顯著提高，且能提升孕鼠子宮平滑肌的張力來促進孕鼠分娩。而柳建昌等[25]研究發現，PGE2 對家魚具有催產作用；對大鼠的8-細胞胚胎產生抑制囊胚作用[26]；鄧潔等[27]用一定濃度的檳榔堿對小鼠進行灌胃后發現，胎鼠外周血DNA 有一定程度的損傷，畸形率增高，且對胎鼠各項生長發育指標有較大影響，說明檳榔堿除了抑制胚胎生長發育，還對胚胎發育產生毒性作用。作為冷血動物的錦鯉，性腺發育由溫度、營養、水流等環境因素和自身激素影響，性腺發育良好的錦鯉才能夠進行產卵[28]。PGF-2a 對水產動物性腺的影響未見報道。

本試驗測得除對照組外，錦鯉血清PGE2 和PGF-2a 含量相比第0 d 升高，但PGF-2a/PGE2 比值降低。各個實驗組PGE2 都顯著升高，B、C、D 組PGF-2a 顯著升高，對照組和A 組升高不顯著，表明高濃度該復方藥物可能會抑制錦鯉胚胎發育。第0 d 時初始各組數據差異均不明顯（P>0.05），說明各組魚初始健康狀況與體質均相同。

3.3 青蒿和檳榔制劑浸泡對錦鯉血清中LZM 含量的影響

溶菌酶（LZM）廣泛存在于人與多種動物體內，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶和機體非特異性免疫的第一道屏障，主要是對革蘭氏陽性菌發揮溶菌作用[29]。中草藥對魚類LZM含量調節的報道很多。譚娟等[30]研究發現，在草魚幼魚的飼料中添加一定量的魚腥草復方制劑，能顯著提升幼魚體內LZM的含量。蔡中華等[31]用復方中草藥投喂鯉使魚免疫器官質量增加，溶菌酶活性及吞噬能力增強，特異性免疫能力顯著提高。

李華等[32]在投喂了復方中草藥后大菱鲆體內LZM的含量先升高后降低，與本試驗結果相似，均呈現出先顯著增長再顯著降低的趨勢，表明浸泡初期，炎性增加，LZM含量上升消除致病菌，后炎性減弱，LZM含量下降。表明試驗所用藥物可通過提高錦鯉體內LZM的含量，達到提高魚體的抗菌能力的效果。

3.4 青蒿和檳榔制劑浸泡對錦鯉血清中IL-6 含量的影響

IL-6 作為具有生物學效應的細胞因子，具有促炎[32,33]、優先驅動巨噬細胞分化的作用，魚類IL-6的功能已引起重視。機體受到病原刺激、發生炎癥反應時，能誘導IL-6 表達，因而常作為系統促炎癥因子激活的標志物。在用嗜水氣單胞桿菌（Aeromonas hydrophila）感染武昌魚（Megalobrama amblycephala）實驗中發現，IL-6 體內的含量有明顯提升，說明了IL-6 在機體免疫過程有重要作用。其他的實驗還表明，在病原體入侵時，IL-6 促使機體產生抗菌肽抵抗病原體[34]。楊雨生[35]在飼料中添加姜黃素投喂黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）8 周后，其體內IL-6 含量明顯增加，免疫力提高。

本試驗中，IL-6 含量初期升高，魚體浸泡初期機體發生炎癥反應，表明該復方藥物對錦鯉產生一定毒性；當藥物濃度低于250 mg·L-1時，隨著時間增加，魚體本身適應性，IL-6 含量調控到正常，炎癥緩解；當藥物濃度達到250 mg·L-1時，毒性增強，隨時間增加，重炎癥反應加重,表明毒性與劑量成正比，與鄒霞輝等[35,36]研究結果一致。

3.5 青蒿和檳榔制劑浸泡對錦鯉鰓部表觀的影響

過量使用化學藥物時，經常引起魚類鰓絲紅腫，如較高銅離子濃度下，鯉的部分鰓小片末端受刺激充滿紅細胞，導致毛細血管明顯擴張，膨大腫脹[37]。本實驗結果表明，對照組鰓絲第9 d 出現病變，而各浸泡組錦鯉鰓部鰓絲末端未見膨大，炎癥細胞未見增多，表明此中藥配方對錦鯉鰓組織無負面影響。

3.6 結論

青蒿檳榔1∶1 制劑在適量范圍內可以調節錦鯉體內的炎性因子，增強非特異性免疫；能調節錦鯉血清C3a、C5aR 含量，起到消炎作用。該制劑可能會對錦鯉胚胎發育產生抑制作用，但綜合來看，對錦鯉鰓組織無負面影響。浸泡濃度250 mg·L-1的組對以上錦鯉病理及生理過程的調控效果較好。