抗水產病原非O1/O139 霍亂弧菌的中草藥篩選及抑菌效果分析

陳圳，錢且奇，李志鵬，徐靜雯，張紫瑞，姜群，張曉君，高曉建

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009）

非O1/O139霍亂弧菌（non-O1/O139Vibrio cholerae）屬于弧菌科（Vibrionaceae）弧菌屬（Vibrio），廣泛分布于江河、湖泊、海洋等水環境中，是引發羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）[1]、日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）[2]、斑節對蝦（Penaeus monodon）[3]、凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）[4]、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）[5]、鯉（Cyprinus carpio）[6]、湘華鯪（Sinilabeo decorus tungting）[7]、異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）[8]等水產動物疾病的重要病原，對水產養殖危害較大。該菌還能引起人類急性腹瀉等疾病[9]。目前，養殖生產中仍主要通過抗菌藥物及消毒劑等化學藥物防治細菌性疾病，造成水環境污染、水產品藥物殘留等問題，嚴重威脅了環境安全和人類健康，并且產生的耐藥菌給水生動物細菌性病害防治帶來了諸多困難[10]。水產養殖中亟需尋找安全、有效的抗生素替代品用以防控細菌性疾病。

天然中草藥具有毒性較弱、藥物殘留量低、不易產生抗藥性等優點，能克服抗生素等化學藥物的多種弊端[11]。中草藥兼具藥用與營養價值，不僅能直接抑殺病原菌微生物[12,13]，還能提高機體的抗應激能力和免疫功能[14,15]，達到防治水產動物細菌性疾病的目的。目前已有較多關于中草藥防治水產動物細菌性疾病的報道，但是關于中草藥對水產病原非O1/O139 霍亂弧菌的抑菌殺菌作用的研究較少[16]。本實驗通過研究23 種具有廣譜抗菌活性的中草藥提取物對非O1/O139 霍亂弧菌的抑菌作用，以篩選出抑菌作用較好的中草藥，并為科學用藥防治該菌引起的水產動物疾病提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株非O1/O139 霍亂弧菌GXFL1-4 分離自患病羅氏沼蝦，由本實驗室保存[2]。

供試中草藥有黃芪（Astragalus membranaceus）、石榴皮（Punica granatum）、仙茅（Rhizoma curculiginis）、紫蘇（Perilla frutescens Britt）、番瀉葉（Folium sennae）、黃柏（Phellodendron chinense）、五倍子（Galla chinensis）、苦地丁（Bunge corydalis Herb）、仙鶴草（Agrimonia pilosa）、地榆（Sanguisorba officinalis）、鹿含草（Herb pyrolae）、大黃（Rheum officinale）、老鶴草（Geraniumwilfordii Maxim）、佩蘭（Herba eupatorii）、萹蓄（Polygonum aviculare）、紅藤（Sargent gloryvine）、白芍（Paeoniae Radix Alba）、艾葉（Folium artemisiae）、山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）、玫瑰花（Flos rosae rugosae）、訶子（Chebula Retz）、板藍根（Radix isatidis）、木瓜（Chaenomeles sinensis）共23種中草藥，購于揚州市同仁堂藥房。

1.2 藥液的制備

將供試中草藥于60℃恒溫干燥箱中烘至恒重后各取50 g，放到洗凈的砂鍋中，各加500 mL 蒸餾水浸泡30 min 后煎煮，煮沸后文火60 min，使用四層紗布過濾藥液，收集過濾后藥液，剩余藥渣加入500 mL 蒸餾水，再次文火煎煮30 min，過濾后收集藥液，重復三次，合并濾液后濃縮至生藥含量1 g/mL，通過121℃高溫濕熱滅菌后，置于4℃冰箱保存待用[17]。

1.3 菌懸液的制備

供試菌株接種于3 mL LB 液體培養基，置于28℃恒溫搖床中培養16 h，用無菌生理鹽水將菌液進行10 倍梯度稀釋，通過平板法計數菌落，最終將其稀釋至1×107CFU/mL。

1.4 藥物體外抑菌試驗

采用瓊脂打孔法測定中草藥水煎劑體外抑菌活性，通過抑菌圈初步篩選出抑菌效果好的中草藥。取100 μL 稀釋后的菌液（1×107CFU/mL）均勻涂布于直徑9 cm 普通瓊脂平皿上，待菌液干后，用直徑6 mm 的滅菌打孔器在平板上打3 個孔，每孔加入30 μL 中藥濃縮液，每種中藥設3 個重復。將平板放入4℃冰箱中讓藥液擴散30 min，再置于28℃恒溫生化培養箱中培養24 h，觀察并測量抑菌圈直徑。

判定標準：用游標卡尺測量孔洞周圍抑菌圈直徑（包括孔洞直徑），每孔取相互垂直方向測量兩次，最終求取三孔（6 次）測量結果的平均值，以mm為單位，結果以X±SD 表示。直徑≥20 mm 為高度敏感，用“+++”表示；直徑15～20 mm 為中度敏感，用“++”表示；直徑10～15 mm 為低度敏感，用“+”表示；直徑≤10 mm 為不敏感，用“-”表示[18]。

1.5 最小抑菌濃度（MIC）的測定

根據體外抑菌試驗結果，選取8 種抑菌作用較好的中草藥，采用二倍稀釋法測定各藥物對非O1/O139 霍亂弧菌的最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）。無菌條件下將中草藥提取液加入無菌普通肉湯液體培養基中，使中草藥提取液終濃度分別為：500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.63 mg/mL、7.81 mg/mL 和3.91 mg/mL，然后將100 μL 菌液（1×107CFU/mL）接種到不同藥液濃度試管中，同時設置不加藥液只加菌液的為陽性對照組，以及只加藥液不加菌液的為陰性對照組（中草藥提取液終濃度為500 mg/mL），28℃恒溫培養24 h，重復測3 次。觀察結果，無菌生長試管清澈透明，其最低藥物濃度為最小抑菌濃度。

1.6 最小殺菌濃度（MBC）的測定

在MIC 試驗基礎上，從觀察結果為清澈透明無渾濁現象的試管中吸取100 μL 菌液，均勻涂布在固體平板上，于28℃的恒溫培養箱培養24 h，以瓊脂平板上菌落數不超過5 個的最低藥物濃度為該藥物對該菌株的最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）。

2 結果與分析

2.1 23 種中草藥提取液的體外抑菌效果

23 種中草藥提取液對非O1/O139 霍亂弧菌的體外抑菌效果見表1。石榴皮、地榆、木瓜三種中草藥抑菌圈直徑為10～15 mm，為低度敏感；訶子、山楂兩種中草藥的抑菌圈直徑為15～20 mm，為中度敏感；五倍子、白芍、黃柏抑菌圈直徑≥20 mm，分別為（19.92±2.12）mm、（19.50±0.74）mm 和（18.92±2.12）mm（圖1），為高度敏感；另外15 種中草藥抑菌圈直徑小于10 mm，為不敏感。本研究的體外抑菌結果表明，選用五倍子、白芍、黃柏為防治非O1/O139 霍亂弧菌的首選抗菌中草藥。

表1 23 種中草藥的抑菌情況Tab.1 Antibacterial effects of 23 types of Chinese herbal medicines

圖1 部分中草藥對非O1/O139 霍亂弧菌的體外抑菌效果Fig.1 In vitro antibacterial effects of some Chinese herbal medicines on non-O1/O139 V.cholerae

2.2 最小抑菌濃度

8 種中草藥對非O1/O139 霍亂弧菌的最小抑菌濃度（MIC）見表2。五倍子的抑菌作用最好，MIC 為7.8125 mg/mL；白芍的MIC 為15.63 mg/mL，黃柏的MIC 為31.25 mg/mL；石榴皮、地榆、訶子、山楂、木瓜的MIC 最高，均為62.5 mg/mL。

表2 8 種中草藥對非O1 霍亂弧菌的最小抑菌濃度（MIC）Tab.2 The minimum inhibitory concentration（MIC）of 8 types of Chinese herbal medicines against non-O1 Vibrio cholerae

2.3 最小殺菌濃度

8 種中草藥對非O1/O139 霍亂弧菌的最小殺菌濃度（MBC）見表3，其中五倍子的殺菌作用最強，MBC 僅為7.81 mg/mL；其次為白芍，MBC 為31.25 mg/mL；石榴皮、黃柏、地榆、訶子、山楂、木瓜的MBC 最高，均為125 mg/mL。

表3 8 種中草藥對非O1 霍亂弧菌的最小殺菌濃度（MBC）Tab.3 The minimum bactericidal concentration（MBC）of 8 types of Chinese herbal medicines against non-O1 Vibrio cholerae

3 討論

目前仍主要依靠各種抗生素和各種化學藥物防治水產細菌性疾病。這些藥物的不科學使用造成了養殖水體污染，水產品種藥物殘留，威脅人類健康。中草藥在水產動物疾病預防和治療中殘留低，不易使病原菌產生耐藥性，近年來被廣泛用于水產動物細菌性疾病的防治中。張永剛等[19]采用瓊脂擴散法和二倍稀釋法測定了大菱鲆（Scophthalmus maximus）源哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）對18 種中草藥的敏感性，發現五倍子、石榴皮、大黃、烏梅和蘇木的抑菌作用最強。任海等[20]在中草藥對哈維氏弧菌體外抑菌試驗的研究中發現，五倍子、訶子和黃柏等中草藥抑菌效果較好。王玉娥等[21]在中草藥對致病性弧菌體外抑菌試驗的研究中發現五倍子、白芍對哈氏弧菌及河流弧菌等弧菌抑制效果較好，其中五倍子抑菌效果最強，可作為防治水產動物弧菌病的首選藥物。梁利國等[16]測定了五倍子等18種中草藥對霍亂弧菌等4 種病原弧菌的抑制作用，結果發現五倍子等中草藥對病原弧菌具有較好的抑菌效果。本研究采用瓊脂打孔擴散法和二倍稀釋法初步研究了23 種中草藥對非O1/O139 霍亂弧菌的體外抑菌和殺菌效果,發現五倍子、白芍、黃柏對非O1/O139 霍亂弧菌的體外抑菌效果較好，其中五倍子抑菌效果最強。

中草藥的抑菌作用與其有效成分有關。每種中草藥的有效活性成分種類、含量及抑菌活性不同，抑菌效果也不相同。五倍子中含大量的鞣酸，使蛋白質凝固變性，殺菌能力較強，對革蘭氏陽性和陰性細菌抑制作用良好[22]。白芍含有多種生物活性，包括解痙作用、抗炎抗潰瘍作用、調節免疫功能、擴血管耐缺氧作用、抗菌作用和解毒作用、抗誘變與抗腫瘤作用等，且白芍中含有易揮發性物質，如白芍醇、沒食子酸甲酯、苯甲酸和四沒食子酰基葡萄糖等均具有很強的抗菌作用[23]。徐曉津等[24]在研究中提到，白芍對溶血弧菌的抑菌效果高度敏感，與本實驗結果一致。通過適當調整中草藥濃度使其在實際應用中發揮成效，可以更好地實現中藥的抑菌作用。黃柏抗菌有效成分為小檗堿，故其藥理作用與黃連大部分相似，但含量較黃連低，體外試驗對霍亂弧菌有效或有較強的抑制作用[25]。

本研究測定了23 種常用中草藥對非O1/O139霍亂弧菌的體外抑菌及殺菌試驗，篩選出8 種有抑菌殺菌作用的中草藥，其中具有明顯抑制成效的中草藥有五倍子、白芍，在日常的養殖生產中，應根據其MIC 與MBC 值合理考慮用藥量，使得水生動物體內抑菌以及殺菌濃度達到最佳。這為中草藥防治由非O1/O139 霍亂弧菌引起的水產動物疾病提供了用藥建議和數據參考。