紅螯螯蝦低溫脅迫下應(yīng)激行為及抗低溫措施研究

張艷春，葉傳劍，劉炬濤，田璐，梁志強(qiáng)，肖光明

（1.湖南省畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心，湖南 長沙 410006；2.湖南君博科技發(fā)展有限公司，湖南 長沙 410036；3.湖南住友農(nóng)業(yè)科技責(zé)任有限公司，湖南 湘潭 411202；4.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南 長沙 410153）

紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus），又名澳洲淡水龍蝦，外形酷似海中龍蝦，隸屬于十足目（Decapoda）擬螯蝦科（Parastacidae）紅螯螯蝦屬（Cherax），原產(chǎn)于澳大利亞北部熱帶區(qū)域，是世界上經(jīng)濟(jì)價值較高的蝦類之一[1]。全球22 個國家有紅螯螯蝦野生種群[2]。1992 年我國廣東、湖北引進(jìn)該蝦并試養(yǎng)成功[3]。紅螯螯蝦生長快，適應(yīng)性和抗病力較強(qiáng)，耐低氧，成活率較高，一般當(dāng)年放養(yǎng)當(dāng)年捕撈上市，有利于活蝦供應(yīng)市場，適宜推廣養(yǎng)殖。近年來，克氏原螯蝦（Procambarus clarkii，又名小龍蝦）行業(yè)迅猛發(fā)展，而紅螯螯蝦質(zhì)優(yōu)味美，出肉率是克氏原螯蝦的2 倍多[4]，也帶動了紅螯螯蝦行業(yè)的興起。

紅螯螯蝦生長、發(fā)育、繁殖與溫度變化極為敏感，最適溫度24℃～30℃。低溫應(yīng)激使紅螯螯蝦肝胰腺細(xì)胞凋亡顯著增加，抑制新陳代謝受，機(jī)能減弱，氧化損傷和免疫缺陷[5]。溫度驟變往往導(dǎo)致其生長停滯甚至死亡，嚴(yán)重危害紅螯螯蝦養(yǎng)殖業(yè)[6,7]。國內(nèi)外對蝦類抗低溫措施有少量研究：凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）在11℃低溫脅迫下，最長應(yīng)激措施處理時間為6 d，在7℃低溫，須在1 d 內(nèi)完成補救措施[8]。低溫條件下凡納濱對蝦的消化酶活性發(fā)生改變，生產(chǎn)中常根據(jù)不同溫度情況調(diào)整餌料成分的配比和投餌量以應(yīng)對低溫應(yīng)激[9,10]。目前，有關(guān)低溫下紅螯螯蝦研究主要集中在對其存活率的影響。吳志新等[11]研究發(fā)現(xiàn)紅螯螯蝦蝦苗耐受15℃低溫，10℃僅存活8 d。李繼勛等[12]試養(yǎng)紅螯螯蝦中，當(dāng)夜間水溫6℃、白天水溫9℃的短期波動下沒有出現(xiàn)死亡。王福剛等[13]研究發(fā)現(xiàn)，9℃左右幼蝦難以存活，而成蝦存活率可達(dá)67%。張湘昭[14]研究發(fā)現(xiàn)水溫降至8℃時則死亡。紅螯螯蝦能在3℃低溫短時間停留，低于14℃不再生長[2,15]。目前，紅螯螯蝦的低溫應(yīng)激行為研究資料極少，有關(guān)其抗低溫措施的研究尚未見報道。紅螯螯蝦在中國湖南、湖北等亞熱帶地區(qū)養(yǎng)殖時，寒潮、倒春寒等極端天氣可給紅螯螯蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來毀滅性災(zāi)害。因此，本實驗旨在系統(tǒng)地觀察紅螯螯蝦不同低溫條件下的應(yīng)激行為，并通過增強(qiáng)飼料營養(yǎng)，提高蝦機(jī)體自身抵抗低溫脅迫能力，探索抗低溫措施，為亞熱帶地區(qū)紅螯螯蝦養(yǎng)殖中應(yīng)對寒潮、倒春寒等極端天氣提供急需的解決措施，促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用紅螯螯蝦來自湖南長沙君博科技有限公司溫棚養(yǎng)殖群體，體質(zhì)量（70±2.52）g，實驗初期在21℃～23℃水溫中增強(qiáng)體質(zhì)30 d，分池投喂兩種飼料，一池投喂正常南美白對蝦配合飼料，粗蛋白含量41%，粗脂肪含量4%。另一池塘投喂抗低溫飼料，飼料中添加多種營養(yǎng)物質(zhì)，其中牛磺酸占0.3%、葡聚糖0.03%、蝦青素0.03%、EM菌0.3%、粗蛋白32%、粗脂肪11%。實驗開始時共挑選體質(zhì)量大小相當(dāng)、蝦體完好無損，無傷病的紅螯螯蝦240尾作為實驗材料。

本實驗中使用了如下動保產(chǎn)品：楚牛牌飼料添加劑牛磺酸（潛江永安藥業(yè)股份有限公司），WANBANG 食品添加劑β-葡聚糖（河南萬邦實業(yè)有限公司），D-BASF 飼料添加劑10%蝦青素（巴斯夫歐洲公司），魚蝦拌料王EM 菌液（河南南華千牧生物科技有限責(zé)任公司），使用小型面條機(jī)（長沙旭眾機(jī)械設(shè)備有限公司）制成長條形飼料，60℃下烘箱中烘干，粉碎成大小適宜顆粒。

1.2 方法

實驗在12 個HDPE 高密度聚乙烯養(yǎng)殖箱（60 cm×50 cm×40 cm）中進(jìn)行，實驗設(shè)置4 個組：強(qiáng)化急降組（GJ）、強(qiáng)化緩降組（GH）、常規(guī)急降組（CJ）、常規(guī)緩降組（CH），每組3 個平行，每個平行組20 尾紅螯螯蝦。采用蘇州星河電子智能溫控器調(diào)節(jié)水溫，采用30 cm 超長探針筆式電子溫度計（SANYWUN）測定實時溫度，實驗用水為經(jīng)24 h 曝氣的自來水，采用自制吸污管各組同步吸除殘餌與糞便。

本研究通過控制降溫緩急策略與改善飼料成分來設(shè)計實驗方案。根據(jù)實驗要求，緩降組分為常規(guī)緩降組、強(qiáng)化緩降組，急降組分為常規(guī)急降組、強(qiáng)化急降組。實驗初期，各組經(jīng)過體質(zhì)增強(qiáng)期后從室溫勻速升溫至25℃，適應(yīng)期為8 d，然后，進(jìn)入中溫脅迫期，急降組（CJ、GJ），3 d 內(nèi)降溫至18℃，此后20 d 維持18℃不變；緩降組（CH、GH）7 d 內(nèi)降溫至18℃，此后16 d 維持18℃不變，最后為低溫脅迫期，急降組，3 d 內(nèi)由18℃降溫至低溫6℃，此后7 d維持溫度不變；緩降組，7 d 內(nèi)由18℃降溫至室外低溫6℃，此后3 d 維持溫度不變（圖1）。其中，常規(guī)急降組、常規(guī)緩降組在體制增強(qiáng)期（30 d）內(nèi)均投喂常規(guī)飼料；其中，強(qiáng)化急降組、強(qiáng)化緩降組在體制增強(qiáng)期內(nèi)均投喂抗低溫飼料。每日早、晚各觀察記錄低溫脅迫下紅螯螯蝦進(jìn)食、活動、存活情況一次。實驗中，死亡蝦的斷定標(biāo)準(zhǔn)為：鰓絲停止擺動或針尖刺激無反應(yīng)。實驗數(shù)據(jù)通過Excel 統(tǒng)計整理分析，采用SPSS22.0 軟件對組別數(shù)據(jù)進(jìn)行獨立樣本卡方檢驗，以P＜0.05 表示差異顯著。

圖1 實驗溫度設(shè)計示意圖Fig.1 Schematic diagram of test temperature design

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫期對紅螯螯蝦存活的影響

在適應(yīng)期（圖1-B），4 個實驗組紅螯螯蝦都沒有出現(xiàn)死亡。在中溫脅迫期（圖1-C），兩個常規(guī)組死亡率均為1.67%，兩個強(qiáng)化組都未死亡。在低溫脅迫期（圖1-D），各組大規(guī)模死亡均在低溫恒溫階段（6℃），在各時期階段中死亡率最高，常規(guī)急降組全部致死，單天最高死亡率為75%；常規(guī)緩降組該期死亡率為（41.67±7.26）%，大規(guī)模死亡在低溫恒溫階段，單天最高死亡率為50%；強(qiáng)化急降組該期死亡率為（11.67±6.67）%，單天最高死亡率為20%；強(qiáng)化緩降組該期死亡率為（10.00±2.89）%，單天最高死亡率為15%；低溫脅迫期，常規(guī)急降組（CJ）死亡率均顯著高于其他3 組；強(qiáng)化組中，強(qiáng)化急降組與緩降組無顯著差異（P>0.05，圖2）。

2.2 低溫應(yīng)激對紅螯螯蝦攝食的影響

在適應(yīng)期，4 個組紅螯螯蝦都正常攝食；在中溫脅迫期，兩個常規(guī)組和強(qiáng)化緩降組均在18℃恒溫階段少量進(jìn)食；在低溫脅迫期，四個組均不進(jìn)食，常規(guī)急降組、常規(guī)緩降組、強(qiáng)化急降組、強(qiáng)化緩降組開始出現(xiàn)此現(xiàn)象的水溫分別為16℃、15℃、14℃和14℃（圖3）。

在適應(yīng)期和中溫脅迫期，四個組的紅螯螯蝦都活力正常。在低溫脅迫期開始出現(xiàn)活力異常，常規(guī)急降組隨著溫度的下降先后出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)：至16℃時活動減弱，9℃時卷曲、側(cè)翻，6℃時斷螯。常規(guī)緩降組隨著溫度的下降先后出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)：15℃時活力減弱，10℃時身體卷曲、側(cè)翻、斷螯，6℃時側(cè)翻、僵硬。強(qiáng)化急降組也依次出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)：14℃時活力減弱，10℃時身體卷曲、側(cè)翻，6℃時斷螯、僵硬。強(qiáng)化緩降組依次出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)：14℃時出現(xiàn)活力減弱，10℃時斷螯，7℃時側(cè)翻（圖3）。

圖3 水溫從25℃下降至6℃過程中紅螯螯蝦出現(xiàn)的應(yīng)激行為Fig.3 Stress behavior of red claw crayfish Cherax quadricarinatus exposed to the water temperature change from 25℃to 6℃

2.3 低溫應(yīng)激對紅螯螯蝦活力的影響及應(yīng)激反應(yīng)

正常飼料投喂下水溫低于16℃時，開始出現(xiàn)活力減弱、不活動等應(yīng)激反應(yīng)。正常蝦狀態(tài)為池底靜伏或趴行，身體舒展，活動力較強(qiáng)，光敏感性較強(qiáng)，抱卵蝦尾扇卷曲保護(hù)受精卵（圖4-a）。正常蝦受到外界刺激時，螯足呈攻擊狀抵御，或腹部快速且連續(xù)卷曲，向后彈跳躲避，瞳孔有反光（圖4-e、h、i）。水溫低于10℃出現(xiàn)斷螯、卷曲、側(cè)翻現(xiàn)象（圖4-c、d）；水溫低于7℃出現(xiàn)僵硬、昏迷狀態(tài)，直至死亡。當(dāng)發(fā)生側(cè)翻時，腹部收縮、尾扇卷曲，身體的平衡性較差，敏感性較弱。身體和螯足有僵化趨勢，部分個體螯足脫落，步足和游泳足不時擺動以恢復(fù)平衡狀態(tài)，對外界刺激有反應(yīng)，瞳孔有反光（圖4-b、f、g）。隨水溫進(jìn)一步降低，蝦僵硬，即側(cè)翻或趴臥在水底，身體和螯足僵硬，部分個體螯足脫落，步足伸展?fàn)睿瑹o光敏感性，無活動能力，受到外界刺激沒有反應(yīng)，瞳孔有反光（圖4-c、j）。死亡時，身體的頭胸甲和腹部連接處脫離、水腫（圖4-k），躺平狀、側(cè)翻、趴臥水底，身體和螯足呈癱軟狀態(tài)，瞳孔無反光（圖4-l）。

圖4 紅螯螯蝦在低溫脅迫下的應(yīng)激反應(yīng)行為Fig.4 Stress response of red claw crayfish Cherax quadricarinatus under low temperature stress

2.4 不同降溫方式和配合飼料對紅螯螯蝦影響

急降組（CJ+GJ）死亡率為（71.67±13.27）%，緩降組（CH+GH）死亡率為（60.83±14.86）%，急降組死亡率略高于緩降組；常規(guī)組（CJ+CH）死亡率為（95.83±2.71）%，強(qiáng)化組（GJ+GH）死亡率為（36.67±7.15）%，強(qiáng)化組死亡率顯著小于常規(guī)組（P<0.05）（圖5）。強(qiáng)化組出現(xiàn)少量進(jìn)食和不進(jìn)食分別為中溫應(yīng)激恒溫階段和低溫應(yīng)激期調(diào)溫階段，而常規(guī)組出現(xiàn)少量進(jìn)食和不進(jìn)食分別為中溫應(yīng)激調(diào)溫階段和低溫應(yīng)激調(diào)溫階段，強(qiáng)化組在進(jìn)食上的應(yīng)激反應(yīng)延遲于常規(guī)組。

圖5 水溫從25℃下降至6℃全過程中不同實驗組紅螯螯蝦死亡率Fig.5 Mortality rof red claw crayfish Cherax quadricarinatus in different experimental groups during the water temperature change from 25℃to 6℃

3 討論

3.1 低溫應(yīng)激中紅螯螯蝦的行為變化

作為溫?zé)釒Ы?jīng)濟(jì)蝦種，在廣大亞熱帶地區(qū)養(yǎng)殖推廣中遇到的難題主要來自于低溫脅迫。目前，紅螯螯蝦的低溫應(yīng)激行為研究較少，本實驗觀察到水溫6℃時大規(guī)模死亡，推斷：6℃為紅螯螯蝦臨界致死低溫。

本實驗觀察了紅螯螯蝦成蝦低溫應(yīng)激反應(yīng)，低于最適溫度后，該蝦沒有隨即出現(xiàn)低溫應(yīng)激反應(yīng)，18℃時少量進(jìn)食，15℃～16℃時不進(jìn)食；當(dāng)水溫低于16℃時才開始活力減弱。水溫低于9℃出現(xiàn)明顯的低溫應(yīng)激反應(yīng)行為。這說明就該蝦在適應(yīng)小幅度低溫脅迫下，會通過自身調(diào)節(jié)機(jī)能，維持外在行為的相對穩(wěn)定。當(dāng)溫度變化幅度及持續(xù)時間達(dá)到一定值時，才會表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激反應(yīng)。因此，生產(chǎn)中出現(xiàn)低溫天氣，要及時采取相應(yīng)措施，不能等到行為出現(xiàn)異常后再采取挽救措施。

3.2 抗低溫飼料有效性分析

了解低溫脅迫對紅螯螯蝦應(yīng)激行為，找到提高其對低溫耐受力的方法，這是實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展必須解決的實際問題之一。紅螯螯蝦低溫馴化中可能導(dǎo)致其氧化應(yīng)激、免疫受損，最終影響其生長和存活[16]，因此，體質(zhì)增強(qiáng)可一定程度減弱低溫應(yīng)激反應(yīng)。不同研究表明，研制蝦類冬季飼料時，適當(dāng)?shù)奶岣吣芰俊⒉⑻砑釉黾用庖吡Φ奈⒘吭赜幸嬗诘挚沟蜏孛{迫。針對蝦蟹類抗低溫飼料研究，Chien 等[17]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加80 mg/kg 的蝦青素提高了斑節(jié)對蝦（Penaeus monodo）抗冷應(yīng)激能力，使恢復(fù)率從24%提高到73%。用不同能量蛋白比飼料投喂凡納濱對蝦，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度下降時，投喂高蛋白加中能或中蛋白加高能的飼料均能有效保證凡納濱對蝦的生長[18]。本研究通過改善飼料質(zhì)量提高了紅螯螯蝦低溫脅迫的耐受性，強(qiáng)化組死亡率顯著小于常規(guī)組（P<0.05）（圖5）。常規(guī)組（常規(guī)急降組、常規(guī)緩降組）在體制增強(qiáng)期（30 d）內(nèi)均投喂常規(guī)飼料，而強(qiáng)化組（強(qiáng)化急降組、強(qiáng)化緩降組）在體制增強(qiáng)期內(nèi)均投喂抗低溫飼料；常規(guī)急降組與強(qiáng)化急降組之間及常規(guī)緩降組與強(qiáng)化緩降組之間均只有攝食飼料之間有差異，其他條件相同，說明本研究中的抗低溫飼料對紅螯螯蝦抗低溫有一定的效果。

3.3 抗低溫的建議措施

目前亞熱帶地區(qū)寒潮經(jīng)常導(dǎo)致紅螯螯蝦養(yǎng)殖業(yè)損失慘重，本論文提出如下抗低溫的建議措施：（1）關(guān)注天氣變化，入秋后關(guān)注寒潮災(zāi)害性天氣預(yù)報，提前上市，減少損失；（2）加強(qiáng)管理，短期小幅度降溫，即水溫不低于18℃，保障池塘或育苗池內(nèi)溶氧大于5 mg/L，硫化氫、亞硝酸氮、氨氮含量不超標(biāo)，水質(zhì)良好，適當(dāng)減少飼料投喂，避免引發(fā)群體死亡；（3）進(jìn)入秋季，暫時沒有上市計劃的紅螯螯蝦可投喂抗低溫飼料，增強(qiáng)蝦體質(zhì)，寒潮來臨時可延緩蝦體出現(xiàn)的低溫應(yīng)激反應(yīng)，爭取上市時間。