固定化微生物技術修復重金屬污染土壤的研究進展

張浩軒,李 龍,董浩然, *

(1. 湖南大學 環境科學與工程學院, 湖南 長沙 410082; 2. 環境生物與控制教育部重點實驗室(湖南大學), 湖南 長沙 410082)

0 引 言

2020年9月22日,在第七十五界聯合國大會上習近平總書記提出了中國“二氧化碳排放力爭于2030年前達到峰值,2060年前實現碳中和”的目標(以下成為雙碳目標)。為完整、準確、全面貫徹新發展理念,扎實推進雙碳行動,生態系統碳匯能力鞏固提升是重要行動方案之一。生態系統碳匯是指生態系統循環中二氧化碳的吸收量大于其排放量[1],主要有森林碳匯、林業碳匯、土壤碳匯、海洋碳匯等。其中土壤是陸地生態系統中最大的碳庫,對于固碳有巨大的潛力,由此土壤修復產業在完成雙碳目標中有舉足輕重的地位。

目前,全國受污染耕地安全利用率穩定在90%以上[2],但由于重金屬污染具有隱蔽性、持久性和不可逆性[3],且涉及的行業廣、歷史遺留問題多,導致土壤重金屬持續累積,污染擴散趨勢未得到有效的控制[4],土壤重金屬污染修復迫在眉睫。修復方法可以分為物理、化學和生物修復法,固定化微生物技術作為生物修復法的其中一種,是指通過物理或化學的手段將游離微生物固定在有限空間的技術。該技術相較于物理、化學修復法可以恢復土壤碳庫容量、減少在土壤修復過程中溫室氣體的排放和能源消耗、減少二次污染,相較于游離微生物可以提高微生物密度、維持微生物活性、降低微生物敏感性,具有廣闊的應用前景。

本文首先從固定方法、載體種類、微生物種類3個角度介紹了固定化微生物技術的分類,并總結了該技術載體和微生物修復重金屬污染的機理,為全面了解固定化微生物技術提供參考。而后聚焦于近五年內固定化微生物技術對鎘、鉻、汞、鉛和復合重金屬污染的研究進展,大部分研究表明固定化微生物技術在很大程度上緩解了土壤重金屬污染,甚至可以改善土壤環境、提高土壤微生物豐度。但是固定化微生物技術無法將重金屬從土壤中移除,仍需要長期的監測觀察,因此本文還介紹了固定化微生物技術與植物修復技術聯用以達到更加綠色低碳的修復效果。在此基礎上,本文還提出了固定化微生物技術的未來發展方向,旨在為固定化微生物技術修復重金屬污染土壤的發展提供參考。

1 固定化微生物技術的分類

為全面總結修復重金屬污染土壤的固定化微生物技術,將其按照固定方法、載體種類、微生物種類3種方式進行分類。

1.1 固定化方法

1.1.1 吸附、共價化合

吸附法,如圖1(a)所示,是一種簡單、快速、廉價的固定方法,其固定原理是依靠載體表面與微生物之間形成范德華力、氫鍵等相對較弱的物理作用力,這種弱結合力不會對微生物的結構產生影響且具有可逆性[5],但也導致微生物容易從載體表面泄漏。共價化合法如圖1(b)所示,相比于吸附法可以顯著增加微生物固定的穩定性,其原理是微生物與載體中的某些基團(比如酰胺、醚、氨基甲酸酯等)之間形成牢固的共價鍵[6],如果沒有特定活性基團就需要應用載體活化劑。缺點是使用的活化劑多數對微生物有毒性且固定化條件復雜,在提高穩定性的同時會降低微生物的活性,所以該方法主要應用于酶固定化,而不是全細胞固定化[7]。

1.1.2 交聯

交聯法如圖1(c)和(d)所示,一種使微生物表面分子與載體表面之間形成交聯,一種是微生物表面分子之間形成交聯。該方法是通過多功能交聯劑(如戊二醇、六亞甲基二異氰酸酯、雙重氮聯苯胺等)活化載體或微生物表面形成共價鍵。微生物表面分子與載體表面形成交聯與共價化合法的原理相似,但其對微生物的危害比共價化合法小[8]。微生物與微生物之間交聯需要先誘導微生物發生聚集,而后加入多功能交聯劑使其發生交聯,該方法不需要載體成本更低,但過量的交聯劑仍可能有毒性[9]。

1.1.3 包埋和包封

包埋和包封非常相似都是不可逆的固定化技術,前者如圖1(e)所示是將微生物截留在聚合物網絡中,后者如圖1(f)所示在微生物存在的情況下生成聚合物網絡。這兩種方法都可以在不影響物質運輸的情況下限制微生物的移動,為微生物提供了溫和的環境抵抗外部環境變化造成的影響,擴大了微生物的適用范圍[10]。然而載體孔的大小是該方法的一個重要參數,孔徑太小會限制微生物與外界進行營養和代謝產物的交換且易發生堵塞,孔徑太大微生物會泄露到環境中去,因此該方法更適用于小分子物質和產物的反應體系中。

圖1 固定化方法Fig. 1 Immobilization methods

1.2 載體種類

固定化微生物的性質是由載體材料和微生物共同決定的,兩者之間的相互作用提供了特定的化學、生化、機械和動力學性質[11],所以需根據不同微生物和應用場景選擇合適的載體材料。一個良好的載體首先應該滿足無毒無污染、低價格廉、性質穩定、易于處理和可再生等特點,目前常用的載體可以分為無機載體和有機載體兩大類。

1.2.1 無機載體

天然無機載體有沸石、膨潤土等[6],合成無機載體活性炭、陶瓷、多孔玻璃、納米材料等。無機材料因其多孔且較高的化學、物理和生物抗性、優異的耐熱性和機械強度受到了廣泛的關注,但其表面缺乏官能團,需要使用的特定的活化劑如戊二醇、碳二亞胺等進行化學修飾或與其他材料聯合制成混合載體后才能與微生物進行充分的結合[12]。

1.2.2 有機載體

常見的天然有機載體有纖維素、瓊脂、藻酸鹽、植物纖維等,具有易獲得、價格低、無毒可生物降解等優點,但同時因其對生物降解的抵抗性低、對有機溶劑敏感性高以及pH適應范圍窄的缺點在應用時受到限制,例如藻酸鹽不能在連續條件下使用,因為物理強度低會導致固定化微生物泄露[6]。合成有機載體如聚丙烯、聚丙烯銨、聚氨酯、聚乙烯醇等,合成有機載體具有豐富的官能團,可以在大分子水平上調節空間結構,在合成過程中可以控制載體的孔徑、極性和形狀,且合成的有機載體更穩定、機械強度更強但是對微生物有毒性[13]。

目前有越來越多的研究選擇復合載體材料或新型載體材料滿足多種應用需求,例如Wu將高效菌株Bacillussp.CRB-7固定在腐殖酸(HA)、蛭石(VE)和海藻酸鈉(SA)結合的一種新型固定化生物復合物上,并成功去除土壤中96.18%的Cr(Ⅵ)[14]。

1.3 微生物種類

1.3.1 細菌

研究表明,已有多種細菌對重金屬有良好的吸附性,比如芽孢桿菌、微球菌、假單胞菌、黃桿菌、鏈霉菌屬等[15]。細菌的細胞壁有很多潛在活性位點能很好的吸附重金屬離子,部分細菌通過重金屬離子的重新溶解和整合來降低其毒性。除了單獨培養外還可以使用混合細菌,當細菌在土壤中達到一定的數量和規模能夠更穩定降低重金屬的毒性。

1.3.2 真菌

真菌由菌絲和孢子組成,菌絲分支成團形成的菌絲體可以比細菌大幾倍甚至幾十倍,廣泛的分支菌絲可以通過細胞壁上的官能團被動吸收金屬離子,或與特定的酶結合主動轉運到胞內形成胞內沉淀[16]。但是相較于細菌,真菌對土壤環境要求更加嚴格,在重金屬污染土壤往往生長緩慢,數量和種類達不到降解的要求,所以需要選擇合適的固定化材料為真菌提供相對優質和穩定的生長環境,例如利用磁性納米材料和海藻酸鈣共固定化黃孢原毛平革菌發現固定化技術增加了菌絲的機械強度和穩定性,提高了處理效率[17]。

1.3.3 微藻[18]

藻類是自養微生物可以通過較低的營養物質產生巨大的生物量,目前用于生物修復的微藻屬有小球藻屬、藍藻屬、結節藻屬、螺旋藻屬等。藻類進行重金屬修復的機理也相對復雜,主要可以分為3種途徑:首先是重金屬離子與藻類細胞壁或藻類分泌的有機物質結合發生生物吸附;其次是重金屬離子通過細胞壁轉運到細胞內并與細胞內物質結合生成沉淀發生生物吸收;最后是生物降解指微藻將重金屬離子催化代謝生成毒性更小的產物。然而藻類生長過程中需要水,所以更多的是被應用在水污染修復中,對土壤修復治理仍沒有得到普遍應用。

2 固定化微生物技術處理重金屬污染的機理

固定化微生物技術是在微生物和載體的共同作用下去除重金屬污染(如圖2所示)。微生物修復重金屬污染的機理主要有生物吸附、生物積累和生物轉化。生物吸附可以發生在活細胞或死細胞中,主要依靠的是細胞壁上的官能團如羥基、羰基、羧基、磺酸鹽、酰胺等與重金屬離子發生絡合或微生物表面的陰離子與金屬陽離子發生靜電吸附,且該過程是可逆的,在實際應用中可以用于解吸回收重金屬。生物積累是指重金屬離子進入到微生物胞內速率大于排出的速率,但微生物對重金屬離子的吸收有一定的限度,當超過限度會對微生物自身造成危害,因此可以篩選出對重金屬耐受性更高的微生物用于生物修復。對重金屬耐受性更高的微生物可能會表現出更好的生物轉化能力,通過微生物酶系統的工作,將重金屬離子氧化、還原、烷基化或甲基化來改變重金屬的狀態從而降低毒性[19]。

圖2 固定化微生物技術處理重金屬污染示意圖Fig. 2 Schematic diagram of heavy metal pollutiontreatment by immobilized microbial technology

載體首先可以為微生物提供更良好的環境,抵御外界環境帶來的干擾使得微生物能夠更穩定的發揮作用兩者相輔相成。例如Wu等將HA吸附固定的芽孢桿菌(CRB-7)再用SA包埋用以去除Cr(Ⅵ),雖然SA并沒有對Cr(Ⅵ)的去除起到直接貢獻,但是能為CRB-7提供保護并使其分泌物緩慢釋放,提高了細菌的密度和穩定性,使Cr(Ⅵ)更好的在固定化菌株內發生反應[20]。其次部分載體自身可以吸附重金屬離子或與其發生反應,例如生物炭可以通過絡合、陽離子交換、靜電相互作用、還原和沉淀過程吸附重金屬,并為微生物提供營養物質,Tu等利用生物炭負載NT-2處理受到鎘和銅污染的土壤,實驗結果表明該方法能有效的降低鎘和銅的不穩定性和生物利用率,同時顯著提高污染土壤中的酶活性[21]。

3 固定化微生物技術修復重金屬污染土壤的研究進展

近年來,城市工業、農業發展迅速,石油煤炭的開采燃燒、化工醫藥、有色金屬包括使用農藥、污水灌溉等都會造成土壤重金屬污染,常見的重金屬污染有鉻、銅、鎘、鉛、汞等。不同的重金屬在土壤中的生物毒性不僅取決于其總量,還取決于其化學形態,據研究重金屬的遷移、轉化和毒性遵循以下規律:酸溶部分>可還原部分>可氧化部分>殘留部分。不同的重金屬具有不同降低毒性的路徑,這要求固定化微生物技術能夠調整載體材料和微生物種類滿足不同的場景應用。因此在表1中按照重金屬種類、固定化材料、微生物種類、處理效果總結了近五年部分國內外固定化微生物技術修復重金屬污染土壤的研究進展。

續表

3.1 鉻(Cr)

鉻(Cr)能夠穩定存在的價態有Cr(0)、Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ),其中Cr(Ⅵ)具有致突變性和致癌性是劇毒物質,Cr(Ⅲ)的毒性較低且遷移性差。Wu等[20]從四川省制革廠污染土壤中分離出高效Cr(Ⅵ)還原芽孢桿菌CRB-7并與HA、VE、SA結合,設置不同對照組以說明載體材料各自的貢獻。實驗結果表明與對照組和游離CRB-7相比,將CRB-7嵌入生物復合材料對土壤中的Cr(Ⅵ)表現出了更有效的還原作用,HA和VE增加了載體的多孔性和比表面積,提高了載體的吸附能力、滲透性和傳質性能,SA緩釋營養,增加了微生物對Cr(Ⅵ)的耐受性,復合載體材料成功融合了3種材料的優勢。實驗表明,復合材料不僅使Cr(Ⅵ)的去除率達到96.18%,還依靠其協同作用改善了土壤酶活性、微生物數量和多樣性和促進植物生長。Hou等[22]從鉻污染土壤中分離出的新型耐鉻菌QY-1分別與HA和羧甲基纖維素(CMC)修飾的納米零價鐵(CMC-nZVI)結合,實驗結果表明HA+QY-1組合的Cr(Ⅵ)鈍化率為82.83%,CMC-nZVI+QY-1為76.15%。HA+QY-1的土壤相關肥力指標、微生物數量和種子萌芽率明顯提高,CMC-nZVI+QY-1會降低土壤呼吸和微生物豐度但比單獨使用CMC-nZVI有所改善。CMC-nZVI比HA有更好的Cr(Ⅵ)還原性,但與QY-1復合使用后的結果說明HA和QY-1之間的協同效應更強,可能是因為HA自身可以充當電子穿梭機,為土壤提供更多的養分并為QY-1的生存提供更好的屏障。 Zibaei 等[23]采用殼聚糖和赤鐵礦對稻殼生物炭進行改性后與惡臭假單胞菌結合,實驗結果說明對生物炭進行改性可以提高其附著能力和對Cr(Ⅵ)的還原能力。隨后的實驗也證明施用與改良生物炭結合的惡臭假單胞菌可以提高玉米根和莖稈的物質產量,降低Cr(Ⅵ)的生物利用率[24]。

3.2 鎘(Cd)

鎘在土壤主要以酸溶態Cd(Ⅱ)存在,Qi等[25]將枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和檸檬酸桿菌按照3∶3∶2的比例混合得到的混合細菌(MB9),分別采用物理吸附法和海藻酸鈉包埋法固定在玉米秸稈生物炭上合成AIB和EIB復合材料。實驗證明MB9和生物炭之間的協同作用使得AIB和EIB的固定化性能優于單獨添加生物炭,且生物炭能夠為MB9提供安全的棲息地,并為MB9和本地微生物提供營養元素,能夠有效改善土壤性質和微生物活性。Tu[26]將假單胞菌NT-2固定在玉米生物炭上,通過75 d盆栽實驗說明其能有效降低鎘和銅的不穩定性和生物利用率。Mei等[27]采用稻草生物炭和蠟狀芽孢桿菌RC-1為復合材料,與未經處理的對照組相比可提取Cd的比例降低了38.82%,過氧化氫酶、脲酶和轉化酶的活性分別提高了42.39%、30.50%和31.20%。Wang[28]將芽孢桿菌K1分別固定在稻草生物炭(SBB)和磁性稻草生物炭(MBB),在好氧和厭氧條件下培養90 d,結果表明,SBB和MBB均可以有效修復Cd污染,有效Cd的總濃度在好氧條件下分別降低83%和85%,在厭氧條件下降低76.2%和88.1%。Shi[29]采用海藻酸鈉和蓮子莢固定Alishewanellasp.WH16-1在鎘污染的稻田土壤中進行盆栽實驗,120 d后與為固定化WH16-1相比交換性和碳酸鹽結合性鎘分別降低了33.6%和17.36%,水稻中的鎘濃度降低了78.31%。

3.3 汞(Hg)

無機汞主要以Hg(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)的形式存在,Hg(Ⅱ)的分布范圍更廣毒性更大,可與土壤有機質、礦物質、粘土顆粒結合。耐汞微生物將土壤中的Hg(Ⅱ)還原為Hg(0)并揮發至大氣中,或是通過分泌硫配體、還原劑、吸附劑來降低Hg在土壤中的毒性。Chen等[30]從重金屬污染土壤中分離出一種耐多金屬的假單胞菌DC-B1并固定在木屑生物炭上對含汞土壤處理24 d后比單獨用生物炭或假單胞菌DC-B1處理效率提高了10.7%～23.2%,且聯合處理促進了土壤中萵苣根的生長。除細菌外,Yang等[31]發現叢枝菌根真菌(AMF)與腐殖酸聯用可以誘導微生物群落發生變化以及抗汞基因的表達,對控制土壤中Hg污染有重要意義。

3.4 鉛(Pb)

Pb是一種劇毒重金屬,可以選擇與磷化合物反應降低其遷移性和毒性,但是大部分磷化合物在土壤中不易溶解,因此可以選擇采用增磷菌(PSB)溶解不溶性磷化合物從而提高土壤中Pb的固定。Zhang[32]將綠針假單胞菌固定在牛糞生物炭,可以幫助綠針假單胞菌在當地土壤存在的情況下生長繁殖,且當復合材料的添加量大于800 mg/kg時,可以控制Pb濃度在1 mg/kg以下。Zhu[33]將無機溶磷菌(iPSB)固定在麥稈生物碳上也能顯著降低鉛的生物利用率。近期Wang[34]、Teng等[35]在生物炭固定的基礎上加入納米零價鐵、聚乙烯醇(PVA)和海藻酸鈉制成新型多孔溶磷菌珠用于固定化土壤中Pb,不僅能有效增加Pb在土壤中的穩定性還能顯著提高土壤微生物豐度,是一種優良的土壤修復策略。

3.5 復合污染

在實際環境中一般是多種重金屬同時污染,因此研究重金屬復合污染也具有一定的現實意義。Wei等[36]通過實驗構建了一個具有最佳Cd、Pb吸附能力的細菌群落,將阿斯伯里腸桿菌G3、煙草腸桿菌I12、變異克雷伯桿菌J2按照1∶3∶3比例培養,并通過物理吸附和海藻酸鈉包埋固定在生物炭和活性炭上。實驗證明可以使土壤中Cd和Pb含量分別減少55.84%和48.13%,且土壤中脲酶、過氧化氫酶和磷酸酶的活性增強,土質得到了改善。Cheng[37]合成稻殼生物炭和金屬固定化細菌(BacillusmegateriumH3和SerratialiqufaciensCL-1) (BHC)復合材料,實驗結果表明復合材料分別降低了酸溶性鉛、鎘26%和47%的含量,顯著提高脲酶活性、無定形鐵氧化物含量,并且降低蔬菜可食用組織的金屬積累。

4 與植物修復聯用

固定化微生物技術可以有效降低重金屬在土壤中的毒性、遷移率和生物利用率等,但重金屬無法從受污染的土壤中移除,仍需要長期的管理和監測。因此在環保低碳的基礎上可以將固定化微生物技術與植物修復聯用,進一步修復受污染土壤。

固定化微生物技術(圖3)可以提升土壤中微生物豐度、酶活性改善土壤環境促進植物生長[38],提高重金屬在土壤中的可交換性和溶解度,輔助植物吸附重金屬[39]。如Hu[40]將芽孢桿菌AP-3通過物理吸附法和包埋法固定在生物炭和海藻酸鈉中生成的復合材料(SABCS)可以提高土壤酶(S-CAT、S-DHA、S-UE和S-PPO)活性促進植物根系對重金屬的吸收,同時減少可食用組織25%的金屬積累。Ye等[41]利用磁黃鐵礦(Fe1-xS)和木屑生物炭負載硫桿菌施入Pb污染土壤60 d,土壤Pb交換態從22.86%提高到37.19%,種植的黑麥草莖部和根部Pb含量分別提高了55.65%和73.43%,明顯提高了土壤鉛的植物有效性。Song等[42]將芽孢桿菌KSB7固定在花生生物炭上與地膚聯用,實現結果表明其可以顯著提高根際土壤中微生物的豐度,鋅、鉛、鉻和銅的可提取量分別降低58.46%、53.42%、84.94%和83.15%。

圖3 固定化微生物材料與植物聯用的作用機理Fig. 3 Mechanism of action of immobilized microbialmaterials in association with plants

5 總結與展望

土壤重金屬污染修復一直是我國需要重視的挑戰,固定化微生物技術修復污染土壤比物理、化學修復更加安全、友好,比游離微生物活性強、效率高。本文從固定方法、載體種類和微生物種類3個方面了解固定化微生物種類,總結其應用原理,再從近五年內該技術在不同種重金屬污染土壤的研究應用和與植物修復聯用入手,為了解固定化微生物技術在修復重金屬污染土壤的現狀及未來發展提供了參考。

固定化微生物技術修復土壤重金屬污染具有較好應用前景,但在以下方面還需進一步研究:(1)縮短微生物固定技術的修復時間,例如添加與微生物有協同效應的化學試劑;(2)增強微生物解毒能力,從受污染土壤中分離出解毒能力更強的微生物種類,并從分子層面探究其機理;(3)新復合載體的研究,合理利用載體不同性質,并探究微生物與載體之間相互作用的機理;(4)材料的分離回收,例如選擇磁性載體,并探究與微生物之間的相互作用及回收再利用等問題。