木質化秋葵均一多糖的理化特性及結構表征研究

葉云芳, 丁 曼, 劉 詠, 王軍輝

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

秋葵(Abelmoschusesculentus(L.)Moench)又名黃秋葵、羊角豆,是錦葵科秋葵屬一年生草本開花植物,原產于非洲,現廣泛種植于亞洲、中東和歐洲的東南部等地區[1]。秋葵入藥歷史悠久,早在我國明代時期,李時珍在《本草綱目》中記載了秋葵的形態特征和藥用價值,言明秋葵的葉、花、根莖和種子都具有一定的藥用價值,可用來治療惡瘡、癰癤、脾虛乏力和腸燥便秘等病癥[2]。近些年對秋葵的研究發現秋葵嫩果莢富含多種營養物質,包括氨基酸、蛋白質、脂肪、碳水化合物、微量元素以及黃酮類化合物等,其中多糖的含量尤為豐富,是秋葵中主要的活性成分[3-4]。據報道,秋葵多糖具有降血糖、抗疲勞、調節機體免疫機能及抑制腫瘤細胞生長等多種生物活性[5]。其優良的生物活性吸引了國內外研究學者的廣泛關注。20世紀60年代已經發現從秋葵嫩莢中獲得的水提多糖是由鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸組成的酸性多糖[6];秋葵水提多糖的結構被證明主要由(1→2)連接的α-Rhap和(1→4)連接的α-GalpA組成,其中(1→4)連接的β-Galp側鏈部分連接到L-Rhap的O-4上[7]。目前,對秋葵嫩莢多糖的研究已逐漸趨于成熟,多集中在多糖的表征和功能特性等方面。

秋葵成熟后的果實逐漸木質化,無法食用。木質化秋葵是秋葵收獲種子后留下的副產物,但其卻占秋葵總質量的50%以上,還富含大量的細胞壁多糖。但由于國內外目前尚缺乏對木質化秋葵的系統研究,造成木質化秋葵的利用率較低,經常被當作廢棄物扔掉。因此,為了尋找合適的處理方法,更好地利用木質化秋葵這一豐富的農作物資源,提取多糖是最佳的開發方法之一。本研究通過對木質化秋葵進行多糖的提取純化,并對純化后的均一多糖進行理化性質測定和結構表征,研究結果為木質化秋葵的開發利用提供可靠的數據及理論依據,以促進木質化秋葵的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

收獲了種子的木質化秋葵果莢于2017年9月收集于安徽省鳳陽縣,自然曬干后經高速中藥粉碎機粉碎,于烘箱中進一步干燥至恒重。利用95%乙醇浸泡干燥的木質化秋葵果莢粗粉3 d以脫色脫脂,風干后保存備用。

DEAE-Cellulose陰離子交換樹脂購于北京索來寶公司;單糖標準品和葡聚糖標準品購于美國Sigma公司;三氯乙酸(光譜級)購于Aladdin;其余試劑(分析純)均購于中國國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器

高速中藥粉碎機(達微機械,濟南);高速冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific,美國);紫外可見分光光度計(菁華科技儀器,上海);傅里葉變換紅外(Fourier transform infrared,FTIR)光譜儀(Thermo公司,美國);高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC)(Waters公司,美國);氣相色譜儀(gas chromatograph,GC)(Agilent 公司,美國);核磁共振儀(Agilent公司,美國)。

1.3 木質化秋葵多糖的分離純化

稱取脫色脫脂后的木質化秋葵粗粉100 g,以1∶30的料液比在100 ℃下提取2 h,提取2次。合并2次提取液,在60 ℃下減壓蒸發,將提取液濃縮至原來體積的1/10,以8 000 r/min的轉速離心10 min去除不溶物。利用Sevag試劑[8](V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=1∶4)對糖液進行脫蛋白處理,分液漏斗上層溶液減壓濃縮去除未反應的三氯甲烷或正丁醇后,用自來水和蒸餾水分別透析72、48 h。透析液濃縮離心凍干即得木質化秋葵粗多糖。

稱取木質化秋葵粗多糖500 mg溶解于500 mL蒸餾水中,在電動攪拌器快速攪拌的條件下緩慢加入95%乙醇,使得糖液的最終乙醇體積分數為40%。將其在4 ℃冰箱中冷藏過夜后,以8 000 r/min離心10 min,合并沉淀溶解于蒸餾水中,透析冷凍干燥后得到的組分即為40%醇沉組分AP1。

稱取40%醇沉組分AP1(120 mg)溶解于10 mL超純水中,以8 000 r/min離心后,吸取上清液緩慢加入到DEAE-Cellulose陰離子交換層析柱中(3.0 cm×40.0 cm),以0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液依次對AP1進行洗脫,得到4個純化組分,分別命名為AP1-a、AP1-b、AP1-c、AP1-d。

1.4 木質化秋葵均一多糖的理化性質測定

1.4.1 總糖、蛋白質和糖醛酸質量分數的測定

以D-Glc為標準品,用苯酚-硫酸法[9]測定總糖質量分數;以牛血清白蛋白為標準品,采用考馬斯亮藍法[10]測定蛋白質質量分數;用硫酸-咔唑法[11]測定糖醛酸質量分數,用半乳糖醛酸作標準曲線。

1.4.2 分子量和均一性的測定

用雙蒸水配制質量濃度為1 mg/mL的多糖溶液,通過0.22 μm過濾器過濾后備用。使用高效液相色譜系統、2424蒸發光散射檢測器以及TSK凝膠柱G4000PWXL(7.8 mm×300.0 mm)與G5000PWXL(7.8 mm×300.0 mm)的串聯線性柱對多糖的均一性和分子量進行檢測。將一系列標準葡聚糖(T-10、T-40、T-70、T-500)按峰時間和相對分子質量的對數繪制標準曲線。參照上述制備的標準曲線計算多糖分子量[12]。

1.4.3 紫外吸收光譜表征

將木質化秋葵均一多糖配制成1 mg/mL的溶液,于紫外可見光譜儀上在190～400 nm波長范圍內進行掃描[13]。

1.5 木質化秋葵均一多糖的結構表征

1.5.1 單糖組成

采用GC對多糖的單糖組成進行分析[12]。純化后的多糖組分(10 mg)在110 ℃下用2 mL三氟乙酸溶液(TFA)水聚4 h,水解產物在室溫下用NaBH4還原3 h后,加入25%乙酸溶液終止反應。利用吡啶和乙酸酐對樣品進行乙酰化處理,將樣品轉化為醛醇乙酸酯。采用HP-5毛細管柱(0.25 μm×320 μm×30 μm)和氣相色譜系統(Agilent Technologies)對獲得的醛醇乙酸酯進行分析。柱烘箱初始溫度為150 ℃,升溫過程設定為10 ℃/min升溫至200 ℃,4 ℃/min升溫至270 ℃。N2流速為20 mL/min,以鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)為單糖標準品分析樣品的單糖組成。

1.5.2 FTIR表征

使用Perkin-Elmer分光光度計(Spectrum 100,Perkin-Elmer,Waltham,MA,USA)在4 000～500 cm-1的掃描范圍內記錄樣品的FTIR光譜[14]。

1.5.3 部分酸水解分析

將50 mg多糖溶解于0.5 mol/L三氟乙酸溶液(8 mL),并在100 ℃下水解1 h。將水解產物在超純水中透析48 h后濃縮冷凍干燥,即得到多糖的部分酸水解組分[14],利用GC對其進行進一步分析。

1.5.4 甲基化分析

將30 mg真空干燥的木質化秋葵多糖溶解于5 mL無水二甲基亞砜中,在N2保護下快速加入2 mL制備好的甲基亞磺酰甲基鈉試劑并攪拌0.5 h,使其充分溶解。在避光和冰浴條件下,緩慢加入2 mL CH3I試劑,在50 ℃的油浴鍋中攪拌1 h后室溫下攪拌過夜。將反應物透析冷凍干燥即可得到甲基化的多糖。取少量多糖樣品進行紅外光譜檢測,若3 500 cm-1處的羥基峰完全消失可證明多糖甲基化完全[15];反之,應對多糖進行重復甲基化處理,直至甲基化完全。根據文獻[16]方法,利用88%甲酸在100 ℃對甲基化樣品進行解聚處理,并參照上述單糖組成分析方法對解聚產物進行衍生化。采用配備有DB-5毛細管柱的氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)進行分析。

1.5.5 核磁共振光譜表征

稱取50 mg多糖,溶于99.9%的重水(D2O)中,于核磁共振儀中在60 ℃下進行核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance,1H-NMR)、核磁共振碳譜(13C nuclear magnetic resonance,13C-NMR)、異核單量子相干譜(heteronculear single quantum coherence,HSQC)和1H的異核多碳相關譜 (1H detected heteronuclear multiple bond correlation,HMBC)波譜分析[14]。

2 實驗結果

2.1 木質化秋葵多糖的均一性分析

木質化秋葵粗多糖經40%乙醇醇沉后獲得醇沉組分AP1,AP1經DEAE-Cellulose陰離子交換樹脂分離純化得到4個純化組分,分別命名為AP1-a、AP1-b、AP1-c、AP1-d,如圖1所示。

圖1 多糖AP1-c的DEAE-Cellulose洗脫曲線

多糖AP1-c的HPLC分析結果如圖2所示,從圖2可以看出,均一性測定AP1-c為均一多糖組分,因此以下研究均集中研究多糖AP1-c,根據葡聚糖標準曲線計算出AP1-c的分子量為658 kDa。

圖2 多糖AP1-c的HPLC譜圖

2.2 木質化秋葵均一多糖的理化指標分析

通過苯酚硫酸法、咔唑硫酸法和考馬斯亮藍法測得AP1-c的總糖質量分數為95.36%,糖醛酸質量分數為24.83%,蛋白質質量分數為0.72%。

2.3 單糖組成分析

利用GC測定單糖、AP1-c及其部分水解產物的組成,結果如圖3所示。

圖3 單糖、AP1-c及其部分酸水解組分的GC譜圖

通過與圖3a的單糖標準品(Rha、Xyl、Ara、Man、Glc、Gal)進行對比,可以確定AP1-c組分主要由半乳糖(Gal)、鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)和葡萄糖(Glc)組成,其摩爾比為1.85∶1.00∶0.24∶0.67。

為了進一步了解多糖AP1-c的主鏈和支鏈組成,對其進行部分酸水解處理。AP1-c的部分酸水解產物的GC譜圖如圖3c所示,由圖3c可知,其單糖組成為Gal、Rha、Glc、Ara,摩爾比為0.55∶1.00∶0.11∶0.04。與AP1-c相比,部分酸水解產物的Gal相對含量急速下降,Glc和Ara的相對含量下降至痕量,而Rha的相對含量基本保持不變。由于多糖經三氟乙酸水解時,位于支鏈的多糖殘基更易被水解[14],因此部分酸水解后的AP1-c的支鏈被全部或部分去除。由此推測Rha和部分Gal殘基可能位于主鏈上,而支鏈可能含有Glc、Ara和Gal。

2.4 紫外光譜表征結果分析

經TU-1901型紫外可見分光光度計測得AP1-c的紫外光譜,如圖4所示。

圖4 多糖AP1-c的紫外光譜圖

從圖4可以看出,在紫外光譜的260 nm或者280 nm處均沒有吸收峰,說明AP1-c多糖中基本不含有核酸或者蛋白質[17]。與考馬斯亮藍法測得的結果一致。

2.5 FTIR表征結果分析

多糖AP1-c的FTIR譜圖如圖5所示。由圖5可知,在3 418 cm-1處的強而寬的吸收峰主要是由于多糖分子間或分子內氫鍵中的O—H的拉伸振動引起的[18];2 937 cm-1的弱吸收峰歸因于甲基或亞甲基的C—H的伸縮振動[17];大約在1 609 cm-1處的信號是由脫質子羧基(COO—)的拉伸振動引起的[19];1 426 cm-1附近出現的吸收峰是由C—H鍵的彎曲振動引起的[14];1 042 cm-1處的吸收峰表明多糖中存在吡喃糖環[20];而896 cm-1附近出現的吸收峰表明AP1-c中存在β型糖苷鍵[20]。

圖5 多糖AP1-c的FTIR譜圖

2.6 甲基化分析結果

多糖AP1-c經完全甲基化、水解、還原和乙酰化處理后經GC-MS分析,所得結果與GC-MS數據庫中標準物質質譜圖進行比對,結果見表1所列。GC-MS分析結果表明,組成AP1-c糖鏈的糖殘基連接方式共有5種,分別為1,3,4-linked-Rhap、1-linked-Araf、1,4-linked-Galp、1-linked-Galp、1,6-linked-Glcp,對應的摩爾比為2.9∶1.6∶2.7∶2.3∶0.7。

表1 AP1-c的甲基化分析

2.7 核磁共振光譜分析

核磁共振光譜是定性分析各種有機物、無機物的化學成分和結構的不可或缺的工具之一,其在多糖的結構解析中起著舉足輕重的作用。多糖AP1-c的核磁共振光譜如圖6所示。

從圖6可以看出,多糖的1H-NMR主要用來鑒別多糖結構中的α或β構型。在1H-NMR中,異頭氫的信號為4.8×10-6～5.5×10-6,其他C-2～C-6的質子信號[21]均集中在4.0×10-6～4.8×10-6。

圖6 多糖AP1-c的核磁共振光譜

從圖6a可以看出,AP1-c的異頭氫范圍內信號峰的化學位移δ位于5.13×10-6、 5.19×10-6、4.89×10-6、4.49×10-6、4.98×10-6,分別歸屬于→3,4)-α-D-Rhap-(1→(A)、α-L-Araf-(1→(B)、→4)-β-D-Galp-(1→(C)、β-D-Galp-(1→(D)、→6)-β-D-Glcp-(1→(E)糖殘基的異頭氫。13C-NMR的化學位移除了可以確定各類碳的位置,還能區別分子的構型和構象[22]。從圖6b可以看出,δ位于98.32×10-6、98.31×10-6、97.41×10-6、103.36×10-6、97.69×10-6處的信號分別歸屬于→3,4)-α-D-Rhap-(1→、α-L-Araf-(1→、→4)-β-D-Galp-(1→、β-D-Galp-(1→、→6)-β-D-Glcp-(1→的異頭碳。各糖殘基的其他位的化學位移見表2所列。

表2 AP1-c糖殘基的化學位移 10-6

二維核磁共振圖譜的分辨率高,包含大量信息,一般與一維圖譜以及甲基化和部分酸水解等結合起來分析多糖中糖殘基的連接方式。AP1-c的HSQC和HMBC圖譜如圖6c、圖6d所示。從圖6c可以看出,多糖AP1-c各糖殘基的異頭碳和異頭氫之間的交叉峰的化學位移A1 (5.13/98.32)、B1(5.19/98.31)、C1(4.89/97.41)、D1(4.49/103.36)、E1(4.98/97.69)。從圖6d可看出,糖殘基連接順序中碳氫遠程耦合的相關峰[23]。結合AP1-c的甲基化和部分酸水解的分析結果以及參考文獻推斷,AP1-c的主鏈是由→3,4)-α-D-Rhap-(1→、→4)-β-D-Galp-(1→組成,而支鏈則是α-L-Araf-(1→、β-D-Glcp-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→通過→4)-α-D-Rhap-(1→的O-3位連接在主鏈上。相應地,HMBC的交叉峰EH1/A C3 (4.98/76.80)表明E糖殘基的1位連接在A糖殘基的3位上,交叉峰AH1/CC4(5.13/76.84)表明殘基A的H-1位連接在殘基C的C-4位上,以及交叉峰BH1/AC3 (5.19/76.80)則表明B糖殘基的H-1與A糖殘基的C-3相連。

3 結 論

本文以木質化秋葵脫色、脫脂和脫蛋白純化后獲得的水提醇沉均一多糖AP1-c為對象,對其理化性質和結構特征進行研究。理化性質結果表明AP1-c的總糖、糖醛酸、蛋白質質量分數分別為95.36%、24.83%、0.72%。紫外光譜在260、280 nm處均沒有吸收峰,表明AP1-c基本不含有核酸與蛋白質,與理化性質測定結果一致。運用甲基化、HPLC、GC、GC-MS及核磁共振光譜儀等化學和儀器方法共同表征AP1-c的結構,結果表明AP1-c的主鏈是由→3,4)-α-D-Rhap-(1→、→4)-β-D-Galp-(1→組成,而支鏈則是α-L-Araf-(1→、β-D-Glcp-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→通過→4)-α-D-Rhap-(1→的O-3位連接在主鏈上。本文定性分析了木質化秋葵多糖的理化性質和結構特征,研究結果為開發木質化秋葵資源提供了數據基礎和理論支持。