基于細菌篩選及其特性研究的微生物綜合實驗教學

林伯坤 劉欣 郭蓮仙 李林秋 邵軍麗

摘?要：本文介紹了基于細菌篩選及其特性研究的微生物綜合實驗教學設計，具體內容包括：設計思路、實驗教學內容（細菌培養基配制和滅菌；細菌分離；細菌純化和保存；革蘭氏染色和形態特征；生化試驗；藥敏試驗）、實驗論文匯報（實驗報告寫成論文形式；實驗論文點評）。筆者已經按照上述設計實施多年的實驗教學（自2017年至今），本文所總結的多年教學實踐經驗，可供開設微生物實驗教學課程的高校同行參考。

關鍵詞：綜合實驗；微生物；蛋白酶；細菌篩選；實驗論文

綜合性實驗是實驗課程教學中的重要內容，可以訓練學生綜合運用多方面的知識、實驗技能和思維方法去分析和解決問題的能力，利于提高學生的主動性和綜合能力，鍛煉學生的探索精神［1］。正因為如此重要，普通高等學校本科教學工作水平評估方案里對開展綜合實驗的課程比例有要求。通常可以有不同的形式開展綜合性實驗，其中一種方式是通過設計將原本看起來是相互獨立的不同實驗串聯起來，形成一個較為完整、具有連續性的實驗體系［12］，使孤立的實驗整體化、零散的知識系統化，使理論知識和操作技能形成一個有機的整體［3］。這種綜合性實驗前后實驗聯系緊密，要求學生認真思考和操作、步步為營，方能理解整體實驗和做出較好的結果，從而可以培養學生的整體思維和全局意識［4］。考慮到大學有不少專業的課程表安排得非常緊湊，很難有集中的空余時間進行實驗，另外考慮到實驗條件和實驗準備工作量，這種實驗串聯方式不失為一種較易開展的綜合實驗教學方式。本文正是采用了這種實驗串聯方式，將原先獨立的“細菌培養基配制和滅菌”“細菌接種技術”和“細菌革蘭氏染色”等實驗重新設計了基于細菌篩選及其特性研究的微生物綜合實驗體系。

一、設計思路

原先本微生物課程的實驗一、二和三分別是“細菌培養基配制和滅菌”“細菌接種技術”和“細菌革蘭氏染色”。這三個實驗，除了實驗二使用了實驗一配制的培養基外，沒有緊密的聯系，是相互獨立的。為了將這幾個實驗整合為一個相互緊密聯系的綜合實驗體系，需要進行重新規劃，最終把它們設計成“某一類細菌篩選及其特性研究”這一主題的綜合實驗，主要內容不僅涵括了原先的“細菌培養基配制和滅菌”“細菌接種技術”和“細菌革蘭氏染色”等三個實驗，還增設了“細菌分離純化和保存”“細菌生化試驗”和“細菌藥敏試驗”等實驗。這樣就形成了從細菌分離篩選到細菌特性研究的一系列連貫實驗，也可以看作是構成了一個微小型的研究課題，也確保具有一定量的實驗結果，從而可以將這一系列實驗的實驗報告改為寫成一篇小型學術論文，不僅可以鍛煉學生撰寫論文的能力［5］，還可以讓學生有自主開展科學研究的感受，更能引起學生的學習興趣和積極性［6］。

至于具體選擇哪一類細菌開展實驗，有條件的學校可以讓學生自主決定，或者由教師指定幾類容易篩選的細菌供學生選擇，比如從環境中篩選產蛋白酶細菌、產淀粉酶細菌或者從食物中分離大腸桿菌或某一類耐藥菌等。如果從方便實驗準備角度考慮，可以指定做某一類細菌。筆者正是選擇了產蛋白酶細菌，因為產蛋白酶細菌在環境中分布廣泛［7］，學生可以自主選擇環境樣品，比如土壤和湖水；篩選方法也簡單，容易篩選到，通常都能確保每一組學生都可以分離得到；鑒別產蛋白酶細菌的方法也很簡單和直觀有趣（在牛奶培養基上形成透明圈菌落［89］），學生學習興趣也高。因此，本文以產蛋白酶細菌篩選及其特性研究為例闡述相關實驗教學設計。

二、實驗教學安排

（一）實驗一——培養基配制以及產蛋白酶細菌的分離

實驗一可以安排4～6個學時，大約一個上午或一個下午。主要內容包括配制分離純化產蛋白酶細菌的各種培養基以及滅菌、環境采樣及樣品處理、固體培養基平板的傾注、平板涂布法分離產蛋白酶細菌。由于培養基滅菌過程需要較長的等待時間，為了充分利用時間，在實驗課開始時先快速講解培養基配制這部分內容，然后讓學生開始配制培養基及滅菌；因為分離細菌環節需要先用固體培養基，也可以讓學生先配制固體培養基并開始滅菌，然后再配制其他培養基。另外需要盡量配備多一些電子天平和微波爐等設備，否則消耗在排隊等待稱量和加熱的時間也比較多。在配制完所有培養基，在等待滅菌的過程中，再具體給學生講解其他實驗內容以及觀看一些相關實驗操作教學視頻（如倒平板、平板涂布等），隨后安排學生到校園采集土壤樣品，還有樣品稀釋，因此需要將采樣器具和樣品稀釋所需要的材料在課前進行滅菌和烘干，等到稀釋好樣品后（稀釋到106），基本上培養基滅菌也即將結束了。從滅菌鍋中拿出培養基，先擺斜面和高層培養基，然后開始傾注固體培養基，之后用平板涂布法分離產蛋白酶細菌（10-3-10-6每個稀釋度涂布一個平板）。第二天，讓學生在一個課后時間過來觀看細菌分離結果和拍照，以及挑取透明水解圈最大的單菌落到液體培養基中進行培養，以備實驗二使用。本次實驗主要讓學生掌握各類細菌培養基的制備方法、滅菌材料的包扎方法和樣品梯度稀釋、倒平板、平板涂布等實驗技能以及學習從環境樣品中分離細菌的方法。

分離產蛋白酶細菌用的是普通營養瓊脂培養基和營養肉湯培養基，需要配制固體、半固體和液體培養基。其中固體培養基在實驗一用于產蛋白酶細菌的分離和純化，在傾注平板前需要另外加入課前已滅菌的10%脫脂奶粉10mL，兩者混勻后再立刻傾注平板。10%脫脂奶粉的滅菌條件為110℃/10min，滅菌溫度過高、滅菌時間過長都容易造成沉淀。固體培養基還用于制備斜面（用于斜面接種），半固體培養基則用于高層培養基（用于細菌動力試驗的穿刺接種）。液體培養基用于單菌落的培養和菌株保存。

總結需要課前滅菌的材料有：采樣材料（金屬藥勺、裝有90mL生理鹽水的250mL錐形瓶）；10%脫脂奶粉10mL（用試管裝）；稀釋樣品用的生理鹽水（用試管裝，每管9mL，共5管）；移液管或者移液器吸頭（200μL和1mL）；玻璃培養皿或者一次性滅菌塑料培養皿。

（二）實驗二——產蛋白酶細菌的純化與保存

實驗二可以安排2～3個學時。本次實驗主要內容是對實驗一分離獲得的產蛋白酶細菌進行平板劃線純化、斜面和穿刺接種，主要是訓練學生學會各種細菌接種方法，每個學生至少練習每一種接種方法兩次。接種菌液用的是實驗一挑取單菌落到液體培養基長出來的菌液，從而才能保證每個學生都能練習三種接種方法。培養基則是使用實驗一配制的各類培養基。培養一天后，讓學生拍照接種效果，并把相關培養物放置于冰箱保存。時間安排允許的情況下，可以先進行平板劃線純化，等平板劃線培養出來確認是純的菌株后，再進行斜面和穿刺接種。這樣的流程在學術上是嚴謹的，但耗時過長，不太適合本科教學安排。實際情況下，往往還是選擇同時進行三種接種，不需要等劃線純化結果出來再進行其他接種，但需要與學生解釋清楚，讓學生明白在做科研情況下應該如何做。

穿刺接種可以觀察細菌的動力，為了讓結果更好辨認，可以同時接種已知的有鞭毛和無鞭毛的細菌作為參照菌。同時注意半固體培養基的瓊脂含量不能過高，通常是0.3%～0.5%。

（三）實驗三——產蛋白酶細菌的革蘭氏染色和形態觀察

本次實驗可以安排3～4學時。本次實驗主要是訓練學生掌握使用普通光學顯微鏡（尤其是油鏡觀察）觀察細菌形態和革蘭氏染色法，使用的是實驗二劃線分離的單菌落。確保每一個學生都至少做出三個樣品，一是各自所篩選的產蛋白酶細菌，二和三分別是用于參照的已知的革蘭氏陽性和陰性菌。要求學生拍照最終的染色結果，判斷所篩選的產蛋白酶細菌屬于陽性菌還是陰性菌，同時觀察細菌的形態（桿狀還是球狀或者其他形狀），也可以增加其他染色方法實驗，比如鞭毛染色。

（四）實驗四——產蛋白酶細菌的生化試驗和藥敏試驗

實驗四可以安排4～6個學時。本次實驗主要是訓練學生掌握常見生化試驗方法和藥敏試驗的紙片擴散法，這兩方面知識都是細菌學檢驗的重要內容，菌種是使用之前實驗接種到平板和斜面的產蛋白酶細菌的菌落。為了節省時間，生化試驗通過購買商品化生化鑒定管來開展，可以多達20余種生化鑒定項目，主要測定項目包括氧化酶、DNA酶、乙酰胺酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、苯丙氨酸脫氨酶、脲酶、硫化氫試驗、OF試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、多種糖類和醇類發酵試驗（包括葡萄糖、麥芽糖、木糖、乳糖、甘露醇、衛矛醇等）。有條件的情況下，可以增設對細菌進行分子生物學鑒定，比如16S?rRNA基因的PCR擴增和測序。藥敏試驗的藥敏紙片也是可以通過購買獲得，可以做至少6種藥物，比如慶大霉素、氨芐西林、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、四環素和新霉素等。藥敏試驗使用的MH培養基可以由實驗室在課前制備，也可以由學生在實驗三提前配制和滅菌，同時需要配備濁度管。第二天觀看和記錄試驗結果，有些生化試驗需要在看結果時加入試劑反應才能判定結果，比如硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗。

三、實驗結果匯報

筆者此前多年指導本科畢業論文發現，許多學生在寫畢業論文時還是存在很多問題，包括格式問題，論文指導教師要花大量時間糾正這些問題。究其原因，重要一點在于學生在寫畢業論文之前缺乏論文寫作訓練，對于不少學生來說，畢業論文是第一次寫論文。因此迫切需要在畢業論文之前的學習中，增加學生的論文寫作訓練。把綜合實驗報告寫成論文形式是一種極好的訓練方式［10］。以往做法通常是在實驗后要求學生寫實驗報告。而經過筆者重新規劃設計，幾個原先獨立的實驗串聯成一個有研究主題的綜合性實驗，實驗結果也相對比較多，因此可以要求每個學生把實驗結果寫成一篇小型論文進行報告，論文題目統一為“產蛋白酶細菌的篩選及其特性研究”，內容包括常規的研究背景、方法、結果、討論等部分，論文格式可以參照本校的本科畢業論文。強調每個學生都要單獨完成這篇實驗論文，雖然在開展實驗時，受實驗條件所限，很難做到每個學生單獨完成所有實驗。同一實驗小組，實驗結果可以相同，但是不同人寫出來的論文終究是不同的。

可以給予學生充足的時間去完成這篇實驗論文，比如1個月，教師在布置實驗論文任務時可以講解論文寫作注意問題。教師在批改完實驗論文后，也應當總結學生在論文中出現的問題，做成PPT，在課上進行集中點評，這樣才能真正讓學生得到提高，論文點評可以安排2個學時。

鑒于實驗論文均由每個學生單獨撰寫，也耗費了較多時間，論文寫作也能較好反映學生的能力水平。因此，應適當提高實驗論文在課程平時成績中的占比，具體比例應依據具體情況而定，如除了實驗論文，沒有其他特別的考核項目，可以將比例提高到課程平時成績的50%。這樣才能更好地區分學生的能力水平，也可以讓學生更有學習積極性。

結語

基于細菌篩選及其特性研究的微生物綜合實驗可以安排15～21學時，具體內容包括：實驗一：培養基配制和細菌分離；實驗二：細菌純化和保存；實驗三：細菌的革蘭氏染色和形態觀察；實驗四：細菌的生化試驗和藥敏試驗、實驗論文點評（實驗報告寫成論文形式）。通過此綜合實驗，不僅可以讓學生學習培養基配制、細菌接種技術、細菌分離純化保存、細菌形態觀察、革蘭氏染色法、各種生化試驗和藥敏試驗等重要的微生物檢驗基本技術，還可以訓練學生撰寫論文的能力，讓學生有開展課題研究的體驗。

參考文獻：

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基金項目：2021廣東省本科高校教學質量與教學改革工程建設項目“衛生檢驗與檢疫專業五位一體的新實踐技能培養體系的構建”（粵教高涵〔2021〕29號）；廣東醫科大學高等教育教學研究課題“以提高學生綜合能力和增加學習興趣為導向的專業課程改革”（2JY20022）；2021年廣東醫科大學教學質量與教學改革工程項目“衛生檢驗與檢疫專業五位一體的新實踐技能培養體系的構建”（1JG21075）

作者簡介：林伯坤（1982—?），男，漢族，廣東肇慶人，博士，副教授，研究方向：微生物檢驗。

*通訊作者：邵軍麗（1980—?），女，漢族，河南安陽人，博士，副教授，研究方向：衛生檢驗。