GFP唾液乳桿菌CCFM6105的構建

高彤 李明桂 梁水明 范麗佳 王長麗

摘?要：目的：構建、篩選并鑒定出重組GFP唾液乳桿菌CCFM6105。方法：利用GFP作為報告基因，從攜帶gWizGFP質粒的大腸桿菌中提取質粒，將gWizGFP質粒電轉化至唾液乳桿菌CCFM6105中，構建GFP唾液乳桿菌。結果：PCR產物電泳結果顯示約在750bp處出現明亮條帶，PCR反應成功；在1800V電壓下的菌落熒光暗沉；在2400V電壓下的菌落熒光致密明亮；在2200V、2600V電壓下菌落熒光偏暗；各代重組菌的GFP表達良好且無明顯減弱。結論：本實驗成功構建GFP唾液乳桿菌CCFM6105且GFP在唾液乳桿菌在穩定遺傳中得到了穩定的表達。

關鍵詞：唾液乳桿菌；綠色熒光蛋白；電轉化

Construction?of?GFP?Lactobacillus?Salivarius?CCFM6105

Gao?Tong1?Li?Minggui1?Liang?Shuiming1?Fan?Lijia1?Wang?Changli2*

1.Youjiang?Medical?College?for?nationalities，School?of?clinical?medicine?GuangxiBaise?533000；

2.Youjiang?Medical?College?for?nationalities，Medical?laboratory?College?GuangxiBaise?533000

Abstract：Objective：To?construct，screen?and?identify?recombinant?GFP?Lactobacillus?salivarius?CCFM6105.Methods：using?GFP?as?the?reporter?gene，the?plasmid?was?extracted?from?E.coli?carrying?gWiz?GFP?plasmid，and?the?gWiz?GFP?plasmid?was?electrotransformed?into?L.salivarius?CCFM6105?to?construct?L.salivarius?GFP.Results：The?electrophoresis?results?of?PCR?products?showed?that?a?bright?band?appeared?at?about?750bp，and?the?PCR?reaction?was successful；Colony?fluorescence?darkening?at?1800V?voltage；The?colony?fluorescence?was?dense?and?bright?at?2400V?voltage；The?colony?fluorescence?was?dark?at?2200V?and?2600V；The?expression?of?GFP?in?the?recombinant?strains?of?each?generation?was?good?without?obvious?weakening.Conclusion：In?this?experiment，GFP?in?L.salivarius?CCFM6105?was?successfully?constructed?and?GFP?in?L.salivarius?was?stably?expressed?in?the?stable?genetic.

Keywords：Lactobacillus?salivarius；Green?fluorescent?protein；Electroconversion

乳酸桿菌（Lactobacillus，Lac）是一類能利用糖類產生乳酸的細菌，且可與人或獸在體內長期共存的一種微生物，其對腸道上皮細胞具有很強的黏附力，具有促進機體體液和細胞免疫、調節腸道菌群、維持菌群微生態平衡的作用［13］。乳酸菌作為可食用益生菌，它的益生功能與其能否通過口服進入動物體內及運動分布情況密不可分。目前，對乳酸桿菌的研究主要集中在宿主生理和微生物菌群變化上，尚缺乏對菌株進入腸道后分布、運動及其定植的系統的針對性研究。細菌質粒是基因工程中最常用的載體，它可以將目標基因攜帶到受體細胞中，促進目標基因在受體中的表達［2］。綠色熒光蛋白（Green?fluorescent?protein，簡稱GFP）是一種實驗中常用的報告基因，分子量通常較小。因其能與多種蛋白質端結合且不破壞原始蛋白、細胞上可穩定表達、熒光強且易于檢測等一系列優良特性，故GFP是一種理想實驗觀察效果極佳的熒光標記物［2］。國內已有大量研究學者對GFP進行廣泛且多維度的實驗室應用：薩初拉［4］等采用GFP作為報告基因為構建植物乳桿菌高效特異表達載體；方來杉［5］等利用GFP作為標識研究乳桿菌在疫苗制備的用途等相關領域的研究，在GFP的標識下均取得了不錯的實驗觀察效果。因此，本研究將經過GFP基因修飾的質粒利用電轉化法轉入Lac中，構建GFP唾液乳桿菌，為研究唾液乳桿菌定植、動態監測和口服免疫機制奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?試驗菌種、主要試劑、培養基和儀器

唾液乳桿菌（Lactobacillus?salivarius）CCFM6105、攜帶gWizGFP質粒且具有卡那霉素抗性的大腸桿菌DH5α、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、PBS液、卡那霉素、限制性核酸內切酶（BamH?I和Sal?I）、蔗糖、甘油、SMRS培養基、LB培養基、MRS培養基。電轉化杯（規格0.2cm）、購自BioRad公司的電穿孔儀、LRH250型生化培養箱、恒溫培養箱和水浴鍋、冰盒、XS212型光學顯微鏡、PCR儀、TDL5型臺式離心機、共聚焦顯微鏡。

1.2?攜帶gWizGFP質粒的大腸桿菌的活化和復壯

取攜帶在-80℃冰箱中gWizGFP質粒的大腸桿菌甘油管（菌液∶甘油=1∶1）進行活化和復壯，取復壯后菌液于超凈工作臺內轉接至100mL/250mL?LB培養基，37℃、160r/min震蕩培養至對數生長期。取100μL原始菌液，對試管依次標記：試管1—6，稀釋濃度：10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。取100μL稀釋后菌懸液涂布在含Kanr培養皿（每個梯度3個），恒溫過夜培養。36h～48h后，挑選培養基內長勢較好菌落數在30～300范圍內的進行傳代培養。

1.3?提取大腸桿菌的gWizGFP質粒

添加50μL/mg?LB培養基培養過夜，取OD600≥1.6狀態下的大腸桿菌菌液提取質粒備用。試劑盒提取質粒gWizGFP作為模板，GFPup和GFPdown為引物進行擴增，具體擴增程序參照楊明陽［6］、張瑩［7］等實驗內容，應用電泳檢測擴增產物。

設計引物、PCR擴增GFP基因片段、測序鑒定：登錄GenBank中查詢GFP基因（GFP）的開放閱讀框架（ORF）序列信息，分析（圖1）選取存在gWiz質粒上啟動子后限制性核酸內切酶（BamH?I和Sal?I），酶切位點插入引物兩端，添加保護序列。應用primer5.0設計1對特異性引物進行驗證：

1.4?唾液乳桿菌感受態細胞的制備及電轉化實驗

感受態細胞的制備詳細參照方來杉［5］、張瑩［7］等實驗，電轉化實驗在其他條件不變的情況下電壓設置四個梯度（1800/2000/2400/2600V），確定唾液乳桿菌最適的轉化電壓。電轉化對陽性轉化子（在熒光顯微觀察有熒光的菌落則為陽性）進行計數，計算出四個電壓梯度下的轉化效率并分析。

1.5?檢測構建的GFP唾液乳桿菌的純化度與穩定度

通過稀釋法把菌液用NS進行稀釋，取10-1、l0-4、10-6稀釋度的菌液少許均勻涂在有抗體的MRS平板上。在37℃厭氧條件下培養36～48h，觀察并挑選長勢良好的轉化子繼續培養10代，純化篩選出穩定表達綠色熒光的唾液乳桿菌。

2?結果

2.1?gWizGFP質粒的大腸桿菌的活化與復壯結果

連續傳代結果表明：大腸桿菌從第1—4代培養基的生長速度稍慢，需要24～36h才能生長出明顯的菌落。隨著菌株繼代培養，生長速度顯著加快，第8代后約12～16h可見清晰的菌落。挑選生長良好的gWizGFP質粒大腸桿菌進行液體震蕩培養，隨著時間的增長，通過圖2可以看出，培養基中菌落的生長規律表現為先上升后趨于平穩，當OD值<6h時，出現一個生長期，緩慢增加；當6h<OD值<18h時，呈對數期快速增長，OD值>18h后增長速度逐漸達到平穩期，菌落的活性逐漸恢復。

2.2?在大腸桿菌中GFP基因的遺傳與表達情況

如圖3所示，可在共聚焦顯微鏡下觀察到攜帶gWizGFP質粒的大腸桿菌活化后的GFP能夠穩定表達，表明大腸桿菌的活性得到很好的恢復。

2.3?GFP基因的擴增結果

如圖4所示，PCR反應中出現了雙酶切質粒、擴增驗證GFP條帶、另有一條清晰條帶在約5000bp處、一條約750bp處。750bp處出現與預期片段大小一致的明亮條帶，說明PCR反應成功，測定PCR產物與T載體的結果與GeneBank中GFP序列達100%。

2.4?唾液乳桿菌的電轉化結果

圖5所示，唾液乳桿菌在其他條件不變的情況下，在1800V電壓下的菌落熒光暗沉；在2400V電壓下的菌落熒光致密明亮；在2200V、2600V電壓下菌落熒光偏暗。由圖6可看出，故電轉化效率在2400V時最高，表明該電壓為本實驗電轉化實驗的四個電壓中最適轉化電壓。

2.5?轉化子的熒光蛋白表達情況

把1—8代的轉化子液體震蕩培養，取OD=0.6的菌液稀釋10-2倍，將稀釋后的菌液滴在3個玻片上進行熒光檢測，把每個在顯微鏡下玻片的視野均等劃分為25塊，每個視野隨機取1塊，計算3塊視野的取樣平均值繪圖（圖7）比較發現，1—8代轉化子在共聚焦顯微鏡下GFP表達良好，表明在菌株的繁衍過程中GFP的表達未出現明顯的漸弱或丟失，工程菌株構建成功。

3?討論

唾液乳桿菌是一種細胞壁較厚的革蘭氏陽性菌，外源DNA轉移到唾液乳桿菌的效率低下［8］。利用電轉化法可以提高外源DNA轉移到唾液乳桿菌細胞轉化效率，并且相對穩定［9］。細胞膜表面在電擊時會形成臨時孔隙，外來分子可經孔隙進入受體細胞，若電壓過低，在細胞膜上難以形成適配的孔隙，外來分子難以轉入；電壓過高，細胞膜上形成的孔隙因增大而造成細胞膜通透性增加，外來分子更易進入細胞；而超過細胞的承受力的電壓則直接導致細胞破裂死亡［1011］，所以適當的電壓刺激至關重要。目前，大多數實驗者使用1600V到7kV的電壓，唾液乳桿菌一般在2400V～3200V電壓下，可以取得較好的轉化率［8］。近年來，通過優化電轉化方法，各類細菌的電轉化所需電壓存在明顯差異。韋云瑩等［12］利用響應面法優化發酵乳桿菌的電轉化條件，其中電壓強度為15kV/cm；在10kV/cm時，乳酸乳球菌NZ9000的電轉化效率達到最佳［13］。乳酸菌種類繁多，有研究發現在同樣的參數下，不同乳酸菌的最佳電轉化效率亦不盡相同，譬如唾液乳桿菌AR809與AR612相比，轉化效率差異明顯［9］，不同菌種的轉化能力差異或與菌株的特異性有關；同時乳酸菌的電轉化效率亦受質粒濃度的影響，在一定濃度范圍內質粒濃度提高，電轉化效率亦相對應地提高，當轉化效率超過一定范圍后會有不同程度的降低［1213］。綜上，乳桿菌的電轉化需要依據具體的菌株設立有效的轉化方法，除上述因素外，影響電轉化效率的因素還包括細菌的生理狀態、復蘇時間、質粒大小等。

本研究構建出了攜帶gWizGFP基因的唾液乳桿菌，結果表明重組的菌株在遺傳8代仍能穩定表達，但重組菌進入機體后是否會影響細菌本身的復制以及GFP的表達都還未可知，有待深入實驗考究。

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基金項目：廣西高校中青年教師基礎能力提升項目（2020KY13007）；自治區教育廳2021年和2022年創新創業訓練計劃項目（S202110599090、S202210599042）；右江民族醫學院2021年度校級科研課題（yy2021sk063）；2021年右江民族醫學院“新啟航”青年骨干項目

作者簡介：高彤（2000—?），女，廣西桂林人，本科在讀，研究方向：臨床醫學。

*通訊作者：王長麗（1992—?），女，廣西南寧人，研究生，講師，研究方向：基礎醫學、微生物資源挖掘與利用。