溫補(bǔ)脾腎經(jīng)驗(yàn)方治療視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

宮玉霜, 付業(yè)繁, 許會(huì)靜, 郭 健, 相 琳, 胡 睿, 樊 睿, 王 捷, 李 淼, 孫美艷

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，吉林 吉林 132013；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130033）

視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病（neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD）是一種罕見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性炎性脫髓鞘疾病，呈復(fù)發(fā)-緩解病程，可導(dǎo)致失明及長(zhǎng)節(jié)段脊髓損傷［1-2］。NMOSD 好 發(fā) 于32.6～45.7 歲 女 性 人 群［3］，其 發(fā) 病機(jī)制尚未完全明確。目前主要通過(guò)糖皮質(zhì)激素和血漿置換等方法緩解急性期癥狀，緩解期多以免疫抑制劑和單克隆抗體進(jìn)行治療，但以上治療費(fèi)用高昂且效果不佳，甚至存在嚴(yán)重不良反應(yīng)。因此，如何為NMOSD 患者提供安全有效的治療方法仍是臨床面臨的一大難題。NMOSD 在中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中屬于“痿病”“暴盲”范疇［4］。研究［5］顯 示：NMOSD以“脾腎陽(yáng)虛”“痰淤濕熱”等為病機(jī)。《靈樞·海論》云：“髓海不足，目無(wú)所見(jiàn)，懈怠安臥”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：腎藏精，為先天之本，主骨生髓，腎陽(yáng)虛衰，髓海空虛，不能充髓生骨，則會(huì)腰膝酸軟，肢冷麻木無(wú)力，發(fā)為痿病，髓海空虛亦不能充養(yǎng)睛目，目失所養(yǎng)而視物模糊，發(fā)為青盲病。《黃帝內(nèi)經(jīng)靈樞·本神》記載：“脾虛則四肢不用。若脾虛弱，則氣血乏源，運(yùn)化布散精氣失司，則視物昏花、肌肉筋骨痿弱麻木無(wú)力”，因此導(dǎo)致視力障礙和運(yùn)動(dòng)障礙，治療上則以“補(bǔ)脾益腎、填精補(bǔ)髓”為治療要點(diǎn)。由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中醫(yī)科教授親自擬定的由15 味中藥組成的溫補(bǔ)脾腎經(jīng)驗(yàn) 方 （Tonifying Slpeen and Kidney Empirical Prescription，TSKEP），主要被用于近5 年來(lái)明確診斷為NMOSD 且于門診復(fù)診的約30 例患者。其中熟地黃滋陰填精益血、補(bǔ)益肝腎；黃連及三顆針清熱燥濕、瀉火解毒；黃芪可大補(bǔ)元?dú)狻⒔∑⒁鏆猓卉蜍呒鞍仔g(shù)滲濕健脾以杜生痰之源；當(dāng)歸養(yǎng)血活血。諸藥合用，可改善NMOSD 患者臨床癥狀，減輕神經(jīng)功能缺損，降低復(fù)發(fā)頻率，臨床療效顯著。鑒于中藥方劑多組分和多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，TSKEP 治療NMOSD 的效果及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接的方法構(gòu)建多維靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，探索TSKEP 治療NMOSD 的效果及其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器SPF 級(jí)C57BL/6 雌性小鼠，體質(zhì)量（25±5）g，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2021-0001。實(shí)驗(yàn)由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，編號(hào)：2017-104。小鼠分為對(duì)照組、NMOSD組和TSKEP組，每組6只。2019 年10 月—2021 年10 月 收 集10 例NMOSD 患 者 和10 名健康志愿者的血清標(biāo)本，10 例患者均在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院就診并參照2015 年NMOSD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)明確診斷為抗水通道蛋白4 抗體（antiaquaporin 4-immunoglobulin，AQP4-IgG）陽(yáng) 性 的NMOSD。本研究使用的人血清標(biāo)本獲得吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)：2017022238。

TSKEP 由吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)系制備，中藥復(fù)方由15 味中藥組成：熟地15 g，千金藤30 g，山梔10 g，枸杞15 g，牡丹皮10 g，當(dāng)歸15 g，黃連10 g，十大功勞葉30 g，三顆針30 g，黃芪30 g，黨參30 g，生地15 g，茯苓10 g，白術(shù)15 g，黃柏10 g。所有中藥藥材均購(gòu)自北京同仁堂股份有限公司并經(jīng)吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中醫(yī)科主任醫(yī)師、副教授馮桂梅鑒定，均符合《中國(guó)藥典》要求。中藥原材料混合，加潔凈的冷水浸泡30～60 min 后，每劑藥煎2～3 次，首次煎煮加水至超過(guò)藥物表面3～5 cm；第2 和3 次煎煮加水 至 超 過(guò) 藥 物 表 面1～2 cm，煎煮時(shí)沸前用強(qiáng)火，沸后用文火。每次煎煮濾出藥汁150～200 mL，煎后將3 次藥汁混合。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液進(jìn)行濃縮并在烘箱中 60 ℃烘干至粉末狀，置于4 ℃冰箱中備用。每1 g 干提取物含有3.56 g 生藥材，臨用前用水配置成相應(yīng)濃度藥液。Melon Gel IgG 純化試劑盒（賽默飛世爾科技公司，商品號(hào)45206），增強(qiáng)型 BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（碧云天科技公司，商品號(hào)P0010），髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白肽 MOG35-55（由上海頂肽生物技術(shù)公司合成），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司），蘇木素-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，商品號(hào)C0105S）。Amicon Ultra 離心過(guò)濾器（美國(guó)密理博科技公司，商品號(hào)ES-A01-4243），SpectraMax M5/M5e 多 功 能 酶 標(biāo) 儀 （美 國(guó)Molecular Devices 公司），伯樂(lè)Mini-PROTEAN?Tetra小型垂直電泳套裝（美國(guó)伯樂(lè)公司），5418R 型Eppendorf 高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司），ChemiDocTMMP 型全能成像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)公司），愛(ài)華QPJ-1C 石蠟切片機(jī)（天津愛(ài)華醫(yī)療器械有限公司），HH-MMB-2 型移動(dòng)式微屏障鼠籠（蘇州猴皇動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)備科技有限公司）。

1.2 NMOSD 動(dòng)物模型制備及給藥方式用PBS緩沖液稀釋 MOG35-55至終濃度為0.5 g·L－1，并與含有 12.5 g·L－1熱滅活結(jié)核分枝桿菌的完全弗氏佐劑（complete freund’s adjuvant，CFA）1∶1 混合，充分乳化，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmue encephalomyelitis，EAE）模型［6］。分別于小鼠背部中線兩側(cè)皮下注射100 μL乳化液，免疫當(dāng)天（第0 天）和48 h（第2 天）腹腔內(nèi)注射百日咳毒素（PTX，每只300 ng）。對(duì)照組小鼠以生理鹽水代替。免疫第5～7 天，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射 NMO-IgG［7］（4 g·L－1PBS 緩沖液）和10 μL 人補(bǔ)體，對(duì)照組以IgG（4 g·L－1PBS 緩沖液）代替。NMO-IgG 和IgG 分別來(lái)自于NMOSD患者和健康志愿者血清，利用Melon Gel IgG 純化試劑盒和Amicon Ultra 離心過(guò)濾器純化濃縮［8］。根據(jù)人與小鼠的體表面積折算等效劑量確定給藥濃度和劑量［9］，即TSKEP 組小鼠在免疫第5 天開(kāi)始以灌胃方式連續(xù)給予TSKEP（15.6 g·kg－1體質(zhì)量）26 d。對(duì)照組和NMOSD 組每天灌胃等量生理鹽水，在免疫第30 天處死所有小鼠。

1.3 動(dòng)物行為學(xué)觀察免疫當(dāng)天開(kāi)始每日觀察小鼠發(fā)病情況，同時(shí)采用5 分法記錄神經(jīng)功能評(píng)分［10］。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分為無(wú)明顯異常；0.5 分為尾巴略微無(wú)力或步態(tài)略有異常；1.0 分為尾巴無(wú)力或尾巴略微無(wú)力且輕度后肢麻痹；1.5 分為尾巴無(wú)力且后肢輕度麻痹；2.0 分為尾巴無(wú)力伴中度后肢麻痹；2.5 分為后肢麻痹，但有部分腿部活動(dòng)；3.0 分為后肢麻痹且無(wú)活動(dòng)；3.5 分為后肢麻痹且前肢輕度麻痹；4.0 分為四肢完全麻痹，但頭部有一定活動(dòng)；4.5 分為垂死；5.0 分為死亡。

1.4 HE 染色觀察各組小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)免疫第30 天處死小鼠，4%甲醛灌注。取出小鼠腦組織后石蠟包埋，常規(guī)處理，制備成厚度為5 μm 切片進(jìn)行HE 染色，顯微鏡下觀察。根據(jù)病理評(píng)分評(píng)估腦組織病理學(xué)改變。病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分為無(wú)炎性細(xì)胞；1 分為散在的炎性細(xì)胞（輕度）；2 分為血管周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)，有“袖套樣”改變（中度）；3 分為致密的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和實(shí)質(zhì)壞死（嚴(yán)重）。

1.5 TSKEP 潛在活性化學(xué)成分及靶點(diǎn)篩選通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)［11］（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以 口 服 生 物 利 用 度（oral bioavailability，OB）≥30% 和 藥 物 相 似 性（drug-likeness，DL）≥0.18 等 毒 藥 物 動(dòng) 力 學(xué)ADME （Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion）參數(shù)［12］作為篩選條件，依次檢索熟地、黃芪和黨參等15 味中藥的活性化學(xué)成分及其 對(duì) 應(yīng) 靶 點(diǎn)，借 助STRING v11.0b 數(shù) 據(jù) 庫(kù)［13］（https：//cn.string-db.org/）將得到的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因名，匯總?cè)ブ睾蟮玫饺降幕钚曰瘜W(xué)成分和靶點(diǎn)。

1.6 NMOSD 相關(guān)靶點(diǎn)以視神經(jīng)脊髓炎、視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病、NMO 和NMOSD 為關(guān)鍵詞，利用DisGeNET v7.0［14］（https：//www.disgenet.org）、GeneCard v5.3［15］（https：//www.genecards.org）、The Online Mendelian Inheritance in Man［16］（OMIM，https：//mirror.omim.org）和Drugbank v5.1.8［17］（https：//www.drugbank）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，匯總?cè)ブ睾蟮玫絅MOSD 相關(guān)靶點(diǎn)。

1.7 TSKEP 治療NMOSD 潛在靶點(diǎn)的獲取利用在線網(wǎng)站Venny 2.1.0［18］（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪 制TSKEP治療NMOSD 相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)。

1.8 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，挑選度值（degree）較高的化合物，從而尋找發(fā)揮重要作用的核心活性成分。

1.9 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將TSKEP 治療NMOSD 的潛在作用靶點(diǎn)映射到STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“Homo sapiens”，設(shè)定最低的置信區(qū)間為0.7（置信度高），得到的數(shù)據(jù)以TSV 格式導(dǎo)出。將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件生成PPI 網(wǎng)絡(luò)并使用Network Analyzer 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。拓?fù)涮卣靼? 個(gè)參數(shù)：degree 值、介數(shù)中心性（betweenness centrality，BC）和 接 近 中 心 性（closeness centrality，CC），上述3 個(gè)參數(shù)是新藥發(fā)現(xiàn)和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的關(guān)鍵指標(biāo)［19］，其中節(jié)點(diǎn)的大小代表degree 值，節(jié)點(diǎn)越大，表示degree 值越大。通過(guò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析來(lái)確定PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。

1.10 潛在核心靶點(diǎn)基因本體論（Gene Ontology，GO）功能注釋分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析將潛在核心靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，GO 包括分子功能（molecular function，MF）、生物過(guò)程（biological process，BP）和細(xì)胞組成（cellular component，CC）［20］。利 用OmicShare 云平臺(tái)（https：//www.omicshare.com/）對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.11 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將Omicshare 平臺(tái)輸出的KEGG 通路富集結(jié)果進(jìn)行分析，選擇最相關(guān)的通路信息整理成表格，輸入到Cytoscape 3.6.0 軟件中得到靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.12 分子對(duì)接篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)及靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)中degree 值較高的核心靶點(diǎn)與化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中degree 值較高的核心化合物進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。在PDB 數(shù) 據(jù) 庫(kù)［21］（https：//www.rcsb.org/）中 找到核心靶點(diǎn)的PDB 文件，在Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)［22］（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中找到核心化合物的sdf 文件，基于AutoDock Tools 軟件進(jìn)行分子對(duì)接。以結(jié)合能評(píng)價(jià)化合物與靶點(diǎn)結(jié)合能力的高低，結(jié)合能<0 表明可以自由結(jié)合，結(jié)合能越低，結(jié)合活性越強(qiáng)，受體與配體之間的親和力越大，二者之間發(fā)生相互作用的可能性越大，結(jié)合能小于?5 kcal·mol?1表明結(jié)合良好。

1.13 ELISA 法檢測(cè)各組小鼠血清中細(xì)胞因子水平分別在免疫第5、15 和30 天收集小鼠尾靜脈血，室溫下靜置20 min，使血液凝固。4 ℃、1 000 g離心10 min（離心半徑=10 cm），去除血清中的凝塊。采用腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素10 （interleukin-10，IL-10）和白細(xì)胞介素17 （interleukin-17，IL-17）ELISA 試劑盒檢測(cè)小鼠血清中相應(yīng)細(xì)胞因子水平。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分、病理學(xué)評(píng)分及血清中炎性細(xì)胞因子水平等數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分對(duì)照組小鼠在免疫后30 d 內(nèi)無(wú)神經(jīng)功能障礙。NMOSD組和TSKEP組小鼠在造模后第6 天開(kāi)始陸續(xù)發(fā)病，疾病程度逐漸加重，表現(xiàn)為尾巴無(wú)力、四肢不同程度麻痹、精神萎靡和活動(dòng)減少等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。NMOSD 組小鼠最高神經(jīng)功能評(píng)分為3.5 分。TSKEP 組小鼠平均神經(jīng)功能評(píng)分第11～30 天均低于NMOSD 組，從第17 天開(kāi)始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束與NMOSD 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分Fig.1 Neurological function scores of mice in various groups

2.2 各組小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腦組織切片HE 染色結(jié)果（圖2），對(duì)照組小鼠腦結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均勻分布；NMOSD 組小鼠腦組織中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有部分細(xì)胞核固縮，病理學(xué)評(píng)分為（2.83±0.41）分；與NMOSD 組比較，TSKEP 組小鼠腦組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕，病理學(xué)評(píng)分［（1.33±0.52）分］明顯降低（P<0.05）。

圖2 各組小鼠大腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×100）Fig.2 Pathomorphology of brain tissue of mice in various groups(HE，×100)

2.3 TSKEP 中潛在活性成分及靶點(diǎn)根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18 的條件在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，剔除重復(fù)項(xiàng)后TSKEP 中共得到304 個(gè)活性化合物和655 個(gè)有效活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。

2.4 TSKEP 治療NMOSD 的潛在靶點(diǎn)在DisGeNET、GeneCard、OMIM 和Drugbank 數(shù) 據(jù)庫(kù)中分別檢索到171、171、84 和3 個(gè)NMOSD 相關(guān)的靶點(diǎn)，刪除重復(fù)項(xiàng)后共得到358 個(gè)疾病靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)取交集，共獲得TSKEP 治療NMOSD 的潛在靶點(diǎn)43 個(gè)。見(jiàn)圖3。

圖3 655 個(gè)藥物靶點(diǎn)（A）和358 個(gè)疾病靶點(diǎn)（B）的共同靶點(diǎn)基因Fig.3 Common target genes of 655 drug targets (A) and 358 disease targets (B)

2.5 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過(guò)Cytoscape 3.6.0 軟件對(duì)化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯詃egree 值和CC 值作為拓?fù)浞治龅闹饕獏⒖贾笜?biāo)，結(jié)合degree 值和CC 值篩選，包括槲皮素（Quercetin）、山柰酸（Kaempferol）和木犀草素（Luteolin）等在內(nèi)的12 種化合物，均具有較高的degree 值和CC 值，可能是TSKEP 治療NMOSD的核心活性成分。見(jiàn)表1。

表1 TSKEP 核心化合物的相關(guān)參數(shù)Tab.1 Related parameters of core compounds of TSKEP

2.6 GO 和KEGG 富集分析以P值作為篩選條件并按照P值大小進(jìn)行排列，GO 功能富集分析分別選取BP、CC 和MF 的前20 條通路進(jìn)行展示（圖4A～C），TSKEP 治療NMOSD 主要作用于以下環(huán)節(jié)：①對(duì)外界刺激的反應(yīng)調(diào)控、對(duì)有機(jī)物質(zhì)反應(yīng)及對(duì)化學(xué)刺激的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)等生物過(guò)程；②細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)部分及細(xì)胞組分、胞漿內(nèi)部分等細(xì)胞組成；③細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、受體調(diào)節(jié)活性、分子功能調(diào)控和信號(hào)受體結(jié)合等分子功能等。以P<0.05 作為篩選條件并按照P值大小展示前20 條KEGG 通路（圖4D），共同靶點(diǎn)主要通過(guò)細(xì)胞因子受體相互作用、Toll 樣 受 體（Toll-like receptor）信 號(hào) 通 路、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、Jak-STAT 信號(hào)通路和核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號(hào)通路等多條信號(hào)通路在NMOSD 的治療中發(fā)揮重要作用。見(jiàn)表2。

表2 核心靶點(diǎn)的KEGG 代謝通路相關(guān)參數(shù)Tab.2 Related parameters of KEGG metabolic pathways of core targets

圖4 43 個(gè)候選靶點(diǎn)的GO 和KEGG 富集分析Fig.4 GO and KEGG enrichment analysis of 43 candidate targets

2.7 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將14 條顯著富集的信號(hào)通路及對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入到Cytoscape 3.6.0 軟件中，得到靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。根據(jù)degree 值篩選核心成分，結(jié)果提示IL-6、IL-1β、TNF、IL-4和PIK3CA 等degree 值較高，可能在中藥復(fù)方治療NMOSD 中發(fā)揮主要作用。

圖5 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Target-pathway network diagram

2.8 分子對(duì)接將9個(gè)核心靶點(diǎn)（IL-6、TNF-α和IL-1β 等）與10 個(gè)核心化合物（槲皮素、芹菜素、大豆黃酮和木犀草素等）進(jìn)行分子對(duì)接來(lái)評(píng)估化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合能力。結(jié)果提示：所有對(duì)接結(jié)合能均<－5 kcal·mol－1，說(shuō)明核心靶點(diǎn)與核心化合物之間具有較好的親和力。其中，IL-6 與槲皮素、ALB 與 芹 菜 素、IL-10 與 豆 甾 醇、IL-1β 與 木 犀 草素、C-X-C 基序趨化因子配體10 （C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10）與β-谷甾醇之間具有相對(duì)較好的結(jié)合能力，部分分子對(duì)接模式圖見(jiàn)圖6。

圖6 分子對(duì)接結(jié)果示意圖Fig.6 Schematic diagrams of molecular docking

2.9 各組小鼠血清中細(xì)胞因子水平造模后第5、15 和30 天，與正常組比較，模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α 和IL-17 水平明顯升高（P<0.01），IL-10 水平明顯降低（P<0.01）；與NMOSD 組比較，TSKEP 組 小 鼠 血 清 中IL-6、TNF-α 和IL-17 水平明顯降低（P<0.05 或P<0.01），IL-10水平明顯升高（P<0.01）。見(jiàn)圖7。

圖7 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中IL-6（A）、TNF-α(B)、IL-10(C)和IL-17(D)水平Fig.7 Levels of IL-6（A）, TNF-α(B), IL-10(C), and IL-17(D) in serum of mice in various groups at different time points

3 討 論

本研究首先對(duì)TSKEP 治療NMOSD 的效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示：TSKEP 可以明顯減緩NMOSD 模型小鼠的神經(jīng)功能障礙，降低腦組織中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度，下調(diào)血清中炎性因子水平，表明TSKEP 在治療NMOSD 方面具有一定的效果。TSKEP 中的黃芪可有效降低血清IL-6 和TNF-α 水平，減輕全身炎癥反應(yīng)。在自身免疫性脊髓炎模型中，黃芪可明顯抑制IL-17、IL-23 和單核細(xì)胞趨化蛋白 （monocyte chemoattractant protein，MCP）的表達(dá)，降低血清中的氧自由基，同時(shí)增加損害性細(xì)胞凋亡，減少神經(jīng)阻滯［23］。本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示：槲皮素、木犀草素、豆甾醇、芹菜素和β-谷甾醇等與核心靶點(diǎn)之間具有較好的結(jié)合能力。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，可減輕由雙環(huán)己酮草酰二腙（cuprizon，CPZ）誘導(dǎo)的脫髓鞘模型小鼠的髓鞘損傷，促進(jìn)髓鞘再生，有一定的神經(jīng)保護(hù)作用［24］。槲皮素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB 的活性，在mRNA 和蛋白水平抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)氧化酶2 和C 反應(yīng)蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用［25-26］，同時(shí)可抑制IL-6 的合成和分泌，從而在炎癥早期減輕炎癥反應(yīng)［27］。植物甾醇是一類具有多種功效的天然化合物，其中含量最為豐富的是豆甾醇和β-谷甾醇。β-谷甾醇可通過(guò)抑制多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路的活化，導(dǎo)致細(xì)胞中IL-6、TNF-α 和IL-1β 等細(xì)胞因子合成明顯減少而起到抗炎作用［28］。同時(shí)豆甾醇也可調(diào)節(jié)各種炎性因子而發(fā)揮抗炎作用［29］。木犀草素是一類天然黃酮類化合物，已被證實(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)（IL-6、IL-4和TNF-α 等炎性因子）發(fā)揮抗炎作用，并能通過(guò)抑制NF-κB 的活化來(lái)調(diào)節(jié)NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以抑制促炎基因的表達(dá)［30］，同時(shí)還具有神經(jīng)保護(hù)作用。以上研究結(jié)果表明：TSKEP 中的有效活性成分可能是通過(guò)抗炎和促進(jìn)髓鞘再生等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

PPI 網(wǎng)絡(luò)和靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示：IL-6、IL-1β、IL-10、TNF- α、IL-4、白 蛋 白（albumin，ALB）、胰 島 素 （insulin，INS）和CXCL10 等可作為TSKEP 治療NMOSD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。多種炎性細(xì)胞因子在NMOSD 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)細(xì)胞因子參與神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)和再生過(guò)程［31］。IL-10 可通過(guò)代謝重組對(duì)巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用。IL-6 作為重要的核心靶點(diǎn)，是免疫系統(tǒng)中的多效細(xì)胞因子，參與抗體的產(chǎn)生和T 細(xì)胞的活化［32-33］。研究［34-36］顯示：NMOSD 患者血清和腦脊液中較高的IL-6 水平可能與神經(jīng)功能的缺損有關(guān)。IL-1β 和TNF-α 是一類促炎細(xì)胞因子，IL-1β 能夠招募白細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)。IL-1β 可通過(guò)激活環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋 白（cAMP-response element binding，CREB）和NF-κB 促進(jìn)血漿上皮嗜中性粒細(xì)胞活化肽78（epithelial neutrophil activating reptide 78，ENA78）的表達(dá)，同時(shí)IL-1β 和TNF-α 在中性粒細(xì)胞募集的過(guò)程中可促進(jìn)激肽B1 受體（kinin B1 receptor，KB1R）蛋白表達(dá)，從而提高中性粒細(xì)胞的活性，誘 導(dǎo) 中 性 粒 細(xì) 胞 的 黏 附 和 遷 移［37］。TNF-α 與IL-17A 具有協(xié)同作用，參與輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。本研究經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TSKEP 可降低外周血中多種炎性細(xì)胞因子（IL-6、IL-1β 和TNF-α）的表達(dá)，由此減輕緩解期NMOSD 中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，從而改善神經(jīng)功能損傷。

本研究KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示：富集的通路主要與感染性疾病、免疫系統(tǒng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，包括IL-17 信號(hào)通路、Jak-STAT、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B （protein kinase B，Akt）、TNF 和NF-κB 等多條信號(hào)通路。IL-17 是一種重要的促炎癥細(xì)胞因子，由Th17 和先天性免疫細(xì)胞等分泌，IL-17 與相關(guān)的IL-17R 結(jié)合通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體IL-17R-Act1-腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）激活下游NF-κB 和MAPK 等信號(hào)通路，以誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的表達(dá)，并在多種自身免疫性疾病的炎癥病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TSKEP 可通過(guò)對(duì)IL-17 相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控降低血清細(xì)胞因子在外周血中的表達(dá)。另外，Jak-STAT、PI3K-Akt、TNF-α 和NF-κB 等信號(hào)通路與神經(jīng)系統(tǒng)功能有密切關(guān)聯(lián)，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)，以及促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)再生等發(fā)揮 作 用［38］。NF-κB 和Jak-STAT 與PI3K-Akt 信 號(hào)通路相互交織，并在NMOSD 治療中發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)作用［39-41］。

綜上所述，TSKEP 可通過(guò)槲皮素、木犀草素、豆甾醇和β-谷甾醇等多種活性成分作用于IL-6、IL-1β 和TNF-α 等 多 種 炎 癥 及 神 經(jīng) 細(xì) 胞 因 子，由IL-17 和NF-κB 等多條信號(hào)通路參與調(diào)控外周血中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)、改善神經(jīng)功能缺損癥狀以及促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)再生，減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療效果。本研究為中藥復(fù)方通過(guò)多組分、多靶點(diǎn)和多通路協(xié)同作用治療NMOSD提供了理論依據(jù)。