茯苓酸對人胰腺癌PANC-1 細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化的抑制作用

李 銳, 譚曉冬, 胡耀元

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院第十二普通外科病房，遼寧 沈陽 110004；2.中國醫科大學附屬盛京醫院胰腺甲狀腺外科病房，遼寧 沈陽 110004）

胰腺癌是消化道惡性腫瘤中最具破壞性、預后最差的一種高度致命的癌癥，是男性和女性癌癥死亡的第四大原因，其發病率呈逐年上升趨勢［1］。完全手術切除可明顯延長胰腺癌患者的生存期，但胰腺癌通常為晚期確診，因此適合手術的患者較少，且手術后復發率仍較高，患者5 年生存率低于10%［2］。此外，胰腺癌具有侵襲性，50%的胰腺癌患者就診時發生轉移，多數接受手術治療的患者在術后4 年內發生轉移［3］。因此，了解胰腺癌發生發展的分子機制對制定胰腺癌診斷及治療的新方案是必要的。中藥是多成分、多靶點和多階段的藥物，其作為癌癥預防和治療的藥物被廣泛接受［4］。萜類化合物是最大的一類植物特化次生代謝產物，具有抗高血壓、降低膽固醇和抗組胺保護作用以及抗腫瘤和抗血管生成活性［5］。茯苓酸（pachymic acid，PA）是一種來自茯苓的羊毛甾烷型三萜類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、鎮靜和催眠活性等多種藥理作用［6］。關于PA 在胰腺癌中發揮作用的相關研究較少，CHENG 等［7］發現：PA 通過激活內質網應激誘導吉西他濱耐藥的胰腺癌細胞凋亡，從而發揮抗癌作用。PA 對胰腺癌細胞遷移和細胞侵襲的作用及發揮作用的機制尚未見報道，有待進一步研究。本研究應用PA 處理胰腺癌PANC-1 細胞及細胞的裸鼠移植瘤模型，探究其對胰腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響，同時采用GSE64111 數據集中PA 處理及未處理胰腺癌細胞的差異表達基因，驗證差異表達基因作為PA 治療胰腺癌的靶點的潛力。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、試劑和主要儀器10 只6 周齡雌性SPF 級BALB/c nude 裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2021-0011。PANC-1 細胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司。PA 購自美國MCE 公司，si-NC 和si-ATF3 購自上海吉瑪基因公司，DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco 公司，Lipofectamine 3000 轉染試劑購自美國Thermo 公司，CCK-8 檢測試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液和ECL 化學發光試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司，上皮鈣黏素、神經鈣黏素、波形蛋白、熱休克蛋白家族A 成員6 （heat shock protein family A member 6，HSPA6）、轉錄激 活 因 子 3 （activating transcription factor 3，ATF3）和GAPDH 抗體均購自美國Abcam 公司。5424 低溫高速離心機購自德國艾本德公司，EG1150 石蠟包埋機和RM2135 石蠟切片機購自德國Leica 公司，CKX53 倒置顯微鏡購自日本Olympus 公 司，ELx800 酶 標 儀 購 自 美 國Bio-Tek 公司，5200 全自動化學發光分析系統購自上海天能科技有限公司。

1.2 細胞培養及轉染胰腺癌PANC-1 細胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM 高糖培養基在37 ℃含5%二氧化碳的恒溫細胞培養箱中長期培養。將細胞分為si-NC 組和si-ATF3 組，根據實驗方案嚴格按照Lipofectamine 3000 轉染試劑說明書將對照siRNA 和ATF3 siRNA 轉染PANC-1 細胞，轉染結束后用含終濃度為30 μmol·L－1PA 的完全培養基繼續培養細胞24 h。

1.3 CCK-8 法檢測各組細胞活性取對數生長期的PANC-1 細胞，均勻接種于96 孔細胞培養板中，每孔3 000 個細胞，培養過夜后，分別用含終濃度為0、2、5、10、20、30、40和50 μmol·L－1PA 的 完全培養基繼續培養細胞24 h，棄培養基，加入110 μL 含10 μL CCK-8 法檢測試劑的無血清培養基，37 ℃孵育1 h，酶標儀檢測450 nm 處吸光度（A）值，計算細胞活性。細胞活性=（實驗組A值－空白組A 值）/（對照組A 值－空白組A 值）×100%。

1.4 Transwell 小室實驗檢測各組細胞遷移能力和細胞侵襲能力取對數生長期的PANC-1 細胞，用不含血清的DMEM 培養基重懸細胞，取50 000 個細胞加入無基質膠包被（遷移實驗）及包被基質膠（侵襲實驗）的Transwell 小室上室中，小室下室中加入含20%胎牛血清的DMEM 培養基，待細胞貼壁，分 別用含終濃度為0、10、30 和50 μmol·L－1PA 的無血清培養基繼續培養細胞24 h。取出小室，棄培養基，PBS 緩沖液洗滌3 次，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 緩沖液洗滌3 次，加入0.5%結晶紫染色液，室溫染色1 h，PBS 緩沖液洗滌3 次，棉簽擦去小室內側細胞，倒置顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J 軟件進行細胞計數。

1.5 Western blotting 法檢測各組細胞中EMT 相關蛋白、HSPA6 和ATF3 蛋白表達水平收集處理后的細胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上孵育30 min 后超聲破碎3 次，4 ℃、12 000 g 離心20 min，收集上清液。BCA 法檢測蛋白濃度并根據蛋白濃度配置上樣量為30 μg 的蛋白樣品，煮樣5 min 使蛋白樣品變性并將樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中，電泳分離蛋白，將蛋白轉移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h 后，加入一抗4 ℃孵育過夜，PBST 洗膜3 次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，PBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL 化學發光法顯影，使用Image J 軟件進行灰度分析。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.6 基于高通量基因表達匯編（gene expression omnibus，GEO）分析胰腺癌細胞中差異表達基因

通過GEO2R 軟件分析GSE64111 數據集中的差異表達基因，該數據集中包含4 個30 μmol·L－1PA 處理的胰腺癌細胞樣本和4 個二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）處理的胰腺癌細胞樣本，以 log 差 異 倍 數 （fold change，FC）>1或<－1 及調整后的P<0.05 作為篩選標準篩選差異表達基因。

1.7 裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型的建立及處理將10 只裸鼠隨機分為對照組和PA 處理組，每組5 只。收集胰腺癌PANC-1 細胞，將2.5×106個細胞皮下注射于裸鼠左腋下，每日用游標卡尺測量腫瘤長徑（mm）和短徑（mm），計算腫瘤體積，腫瘤體積=（長徑×短徑）2/2。待腫瘤體積達到60 mm3時，PA 處 理 組 裸 鼠 腹 腔 注 射25 mg·kg－1PA，對照組裸鼠注射等量生理鹽水，每周注射3 次，持續5 周［7］。實驗結束后處死裸鼠，取移植瘤組織。游標卡尺測量腫瘤長徑和短徑，計算腫瘤體積，電子秤稱量瘤質量。將移植瘤組織置于4%多聚甲醛中，采用免疫組織化學檢測腫瘤組織Ki-67 蛋白表達情況。

1.8 統計學分析采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞活性，細胞遷移和侵襲能力，EMT 相關蛋白、HSPA6 和ATF3 蛋白表達水平，腫瘤體積及瘤質量均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey 檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組PANC-1 細胞的細胞活性CCK-8 法檢測結果顯示：與空白對照（0 μmol·L－1PA）組比較，不同濃度（5、10、20、30、40 和50 μmol·L－1）PA 處理組的PANC-1 細胞活性呈濃度依賴性降低（P<0.05）。見表1。

表1 CCK-8 法檢測各組PANC-1 細胞的細胞活性Tab.1 Activities of PANC-1 cells in various groups detected by CCK-8 assay (n=3,±s,η/%)

表1 CCK-8 法檢測各組PANC-1 細胞的細胞活性Tab.1 Activities of PANC-1 cells in various groups detected by CCK-8 assay (n=3,±s,η/%)

*P<0.05 compared with blank control（0 μmol·L－1PA）group.

Group Blank control PA(μmol·L－1)Cell activity 100.00±4.71 2 5 10 20 30 40 50 96.31±7.15 88.49±3.56*78.50±3.90*71.13±4.02*59.33±3.34*40.67±7.69*22.40±3.83*

2.2 各組細胞遷移和侵襲能力及EMT 相關蛋白表達水平Transwell 小室實驗檢測結果顯示：與空 白 對 照（0 μmol·L－1PA）組 比 較，不 同 濃 度（10、30 和50 μmol·L－1）PA 處 理組PANC-1 細胞遷移和細胞侵襲能力呈濃度依賴性降低（P<0.05）。見圖1 和圖2。Western blotting 法檢測結果顯示：與空白對照（0 μmol·L－1PA）組比較，不同 濃 度（10、30 和50 μmol·L－1）PA 處 理 組PANC-1 細胞中上皮鈣黏素蛋白表達水平呈濃度依賴性升高（P<0.05），神經鈣黏素和波形蛋白表達水平呈濃度依賴性降低（P<0.05）。見圖3。

圖1 Transwell 小室實驗檢測各組PANC-1 細胞遷移和侵襲能力(結晶紫，×200)Fig.1 Migration and invasion abilities of PANC-1 cells in various groups detected by Transwell chamber experiment（Crystal violet,×200）

圖2 各組PANC-1 細胞中遷移細胞數（A）和侵襲細胞數（B）直條圖Fig.2 Histograms of numbers of migration (A) and invasion (B) cells in PANC-1 cells in various groups

圖3 各組PANC-1 細胞中EMT 相關蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.3 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of EMT-related proteins in PANC-1 cells in various groups

2.3 各組裸鼠移植瘤生長和Ki-67 蛋白表達情況

對照組裸鼠移植瘤體積為（1 173.19±171.00）mm3，瘤 質 量 為（0.676±0.080）g；PA 組裸鼠移植瘤體積為（354.3±86.66）mm3，瘤質量為（0.234±0.023）g。與對照組比較，PA 組裸鼠移植瘤體積和瘤質量均明顯降低（P<0.05），見圖4。免疫組織化學檢測結果顯示：與對照組比較，PA 組裸鼠移植瘤組織中Ki-67 蛋白棕色陽性染色減少。見圖5。

圖4 各組裸鼠移植瘤照片大體表現Fig.4 General morphology of xenografted of nude mice in various groups

圖5 對照組（A）和PA 組（B）裸鼠移植瘤組織中Ki-67 蛋白表達情況（免疫組織化學,×200）Fig.5 Expressions of Ki-67 protein in xenografted tissue of nude mice in control group (A) and PA group (B)（Immunohistochemistry,×200）

2.4 PA 處理后胰腺癌細胞中差異表達基因的數據庫分析通過GEO2R 軟件分析GSE64111 數據集中的差異表達基因，該數據集中包含4 個30 μmol·L－1PA 處 理 的 胰 腺 癌 細 胞 樣 本 和4 個DMSO 處理的胰腺癌細胞樣本，分析結果顯示：共23 個差異表達基因，其中16 個基因表達上調，7 個基因表達下調，其中差異表達倍數最高的基因為HSPA6 和ATF3。見圖6。

圖6 PA 處理后胰腺癌細胞中差異表達基因Fig.6 Differentially expression genes in pancreatic cancer cells after treated with PA

2.5 各組PANC-1 細胞中HSPA6 和ATF3 蛋白表達水平Western blotting 法檢測結果顯示：與空白對照組比較，PA 組PANC-1 細胞中HSPA6 和ATF3 蛋白表達水平明顯升高（P<0.05）。見圖7。

圖7 Western blotting 法檢測各組PANC-1 細胞中HSPA6 和ATF3 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.7 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of HSPA6 and ATF3 proteins in PANC-1 cells in various groups detected by Western blotting method

2.6 沉 默ATF3 后PANC-1 細 胞中HSPA6 和ATF3 蛋白表達水平Western blotting 法檢測結果顯示：與si-NC 組比較，si-ATF3 組PANC-1 細胞中HSPA6 和ATF3 蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）。見圖8。

圖8 Western blotting 法檢測沉默ATF3 后PANC-1 細胞中HSPA6 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.8 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of HSPA6 protein in PANC-1 cells after silencing of ATF3 detected by Western blotting method

2.7 沉默ATF3 后PANC-1 細胞遷移能力和細胞侵襲能力及EMT 相關蛋白表達水平Transwell 小室實驗檢測結果見圖9，si-NC 組侵襲細胞數為（172.20±11.44）個，si-ATF3 組侵襲細胞數為（264.80±9.36）個，2 組間比較差異有統計學意義（P<0.05）；si-NC 組遷移 細胞數（132.80±7.36）個，si-ATF3 組 遷 移 細 胞 數（239.80±6.64）個，2 組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。進一步通過Western blotting 法檢測EMT相 關 蛋 白 表 達，結 果 顯 示：與si-NC 組 比 較，si-ATF3 組PANC-1 細胞中上皮鈣黏素蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），神經鈣黏素和波形蛋白表達水平明顯升高（P<0.05）。見圖10。

圖9 各組PANC-1 細胞遷移和侵襲形態表現（結晶紫，×200）Fig.9 Morphology of migration and invasion of PANC-1 cells in various groups（Crystal violet,×200）

圖10 各組PANC-1 細胞中EMT 相關蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.10 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of EMT-related proteins in PANC-1 cells in various groups

3 討 論

由于胰腺癌的高轉移性和侵襲能力，傳統的手術治療及化療藥物治療效果并不明顯［8］。PA 對多種癌癥的侵襲和轉移具有抑制作用，研究［8］發現PA 以時間和劑量依賴性方式明顯降低膽囊癌細胞生長、遷移和侵襲。GAO 等［9］發現：PA 劑量依賴地抑制卵巢癌細胞體外生長、遷移和侵襲，并上調上皮鈣黏素表達。CHENG 等［10］發現：PA 抑制胰腺癌細胞侵襲。本研究結果顯示：PA 處理可以抑制胰腺癌PANC-1 細胞體外生長、遷移和侵襲及體內移植瘤生長。

EMT 是導致胰腺癌腫瘤細胞侵襲、轉移和化學抗性等高度惡性潛能的主要原因［11］。EMT 是指上皮-間質狀態轉變，上皮細胞經歷表型和基因型轉化以獲得間充質表型，上皮表型是可定植和穩定的，而間充質表型能夠抵抗細胞凋亡，具有侵襲性和遷移能力［12］。上皮鈣黏素是細胞表面的上皮鈣黏蛋白分子，有助于頂端-基底極性的上皮細胞之間的外側連接，可作為上皮細胞標志蛋白［13］。神經鈣黏素和波形蛋白是間充質細胞標志蛋白，EMT 中間充質標記物的表達和上皮標記物的抑制同時發生，一旦EMT 程序被激活，癌細胞就會獲得遷移和侵襲能力，進而促進癌癥的侵襲和轉移［14-15］。在本研究中，PA 處理可明顯上調胰腺癌PANC-1 細胞上皮鈣黏素表達，下調神經鈣黏素和波形蛋白表達，表明PA 抑制PANC-1 細胞EMT。

為了進一步探究PA 抑制胰腺癌細胞遷移、侵襲和EMT 的機制，本研究分析了GEO 數據庫GSE64111 數據集中的差異表達基因，該數據集包括4 個30 μmol·L－1PA 處 理 的 胰 腺 癌 細 胞 樣 本 和4 個DMSO 處理的胰腺癌細胞樣本，結果顯示：HSPA6 和ATF3 在PA 處理的胰腺癌細胞中表達上調。HSPA6 位于人類染色體1q23.3，編碼一種相對 分 子 質 量 為70 000 的 蛋 白［16］。SHEN 等［17］發現：百里香醌通過上調HSPA6 表達抑制三陰性乳腺癌細胞生長、遷移和侵襲，且HSPA6 高表達與乳腺癌患者的長總生存期呈正相關關系。COTO-LLERENA 等［18］發 現：HSPA6 表 達 上 調促進肝細胞肝癌細胞體外增殖和遷移以及體內腫瘤生長。ZHOU 等［19］發現：HSPA6 在膠質母細胞瘤患者中呈高水平表達，且HSPA6 通過促進增殖、侵襲和抗凋亡促進膠質瘤細胞的惡性進展。總之，HSPA6 在不同癌癥中發揮致癌或抑癌作用。ATF3是活化轉錄因子（activating transcription factor，ATF）/環 磷 酸 腺 苷 （cyclic adenosine monophosphate，cAMP）反應元件結合家族的成員，在調節代謝、免疫和腫瘤發生中起重要作用，且可能作為癌基因和腫瘤抑制因子發揮雙重作用［20］。YOUNS 等［21］研究顯示：雷公藤紅素通過上調ATF3 表達抑制胰腺癌細胞生長并誘導細胞凋亡。DUNCAN 等［22］發現：組蛋白去乙酰化酶抑制劑和蛋白質二硫鍵異構酶抑制劑聯合處理誘導膠質母細胞瘤和胰腺癌細胞ATF3 表達，ATF3 表達上調誘導HSPA6 上調，從而發揮抗腫瘤協同作用。本研究結果顯示：PA 誘導HSPA6 和ATF3 蛋白表達，沉默ATF3 降低了PA 誘導的HSPA6 蛋白表達，此外，沉默ATF3 逆轉了PA 對胰腺癌細胞生長、遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，鑒于PA 抑制胰腺癌細胞體外增殖、遷移、侵襲和EMT 且在體內抑制胰腺癌細胞移植瘤生長，PA 有望成為抗胰腺癌轉移的有效藥物。PA 通過上調ATF3 和HSPA6 蛋白表達發揮抗腫瘤作用，ATF3 和HSPA6 有望成為抗胰腺癌治療的靶點。本研究結果為抗胰腺癌治療提供理論依據。