轉位蛋白配體XBD173 對香煙煙霧提取物誘導小鼠肺炎癥反應的減輕作用及其機制

高興洪, 唐紅梅, 李月蛟, 王孝蕓, 王 星, 袁謝芳, 吳 敏

（西南醫科大學附屬醫院炎癥與變態反應實驗室，四川 瀘州 646000）

自1956 年RICHARD-DOLL 闡述了吸煙與肺癌高度相關［1］，吸煙的危害已經被廣泛研究。煙霧暴露可參與機體多種疾病的發生發展，巨噬細胞在受到香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）刺激時，可極化為M1 型巨噬細胞，分泌多種炎癥因子，在CSE 誘導的肺部炎癥反應中具有重 要 作 用［2］，轉 位 蛋 白（translocator protein，TSPO）廣泛分布于線粒體外膜，具有調節膽固醇轉運、類固醇類激素合成、卟啉轉運、血紅素合成、細胞凋亡、細胞增殖、離子運輸、線粒體功能調節和免疫調節等多種功能［3］。XBD173 為人工合成的TSPO 配體，研究［4］顯示：XBD173 具有良好的抗炎作用和神經保護作用，但XBD173 對CSE誘導的肺炎癥反應和巨噬細胞極化是否有作用及其可能機制，國內外尚未見相關報道。因此本研究以C57BL/6 小鼠和RAW264.7 細胞為研究對象，探討XBD173 對CSE 所致小鼠肺部炎癥反應和CSE誘導的巨噬細胞M1 型極化的影響及其可能分子機制，以期為吸煙者的肺炎癥治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、主要試劑和儀器18 只8 周齡SPF 級C57BL/6 雄性小鼠購于重慶騰鑫生物技術有限公司，動物使用許可證號：SYXK （川）2018-065，體質量（20±2）g。12 h 交替照明，溫度保持在22 ℃～26 ℃，自由獲取食物和水，按照《實驗動物許可管理辦法》和《實驗動物管理條例》的相關規定進行實驗；香煙（嬌子牌）購自成都卷煙廠；小鼠Raw264.7 巨噬細胞購于中國科學院細胞庫；血清購于澳大利亞Bovogen Biological 公司，高糖DMEM 培養基購于上海源培生物科技股份有限公司，XBD173 購于美國MedChemExpress 生物科技公司，CD80、CD86 和誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）流式抗體均購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司，活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司，凋亡檢測試劑盒購于四正柏生物有限公司，逆轉錄試劑盒和逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購于南京諾維贊生物科技有限公司，Western blotting 抗體GADPH、核因子κB/p65 （nuclear factor-κB/p65，NF-κB/p65）和磷酸化NF-κB/p65（phosphorylated NF-κB/p65，p-NF-κB/p65）均 購 于 美 國 Cell Signal Technology 公司，ECL 超敏化學發光試劑盒購自四正柏生物有限公司，TSPO 轉染慢病毒、轉染試劑和嘌呤霉素購于吉凱基因，HE 染色試劑盒、RIPA 裂解液和SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒均購于碧云天生物技術公司。凝膠成像分析儀購自美國BIO-RAD 公司，Leica DM2000 顯微鏡購自德國Leica Microsystems 公 司，Centrifuge 5810R 離 心 機購自德國艾本德公司，Nano400 微量分光光度計購自北京原平皓生物技術有限公司，LightCycler480 Ⅱ實時熒光定量PCR 系統購自瑞士羅氏醫學儀器公司。

1.2 CSE 制備參 照NAKAMURA 等［5］方 法 制備：將香煙煙嘴與泵連接，通過泵的抽氣作用吸取香煙燃燒后的煙霧，按每支香煙煙霧溶解于2 mL PBS 液制成懸液。懸液經NaOH 調節pH 值為7.4，經孔徑為0.2 μm 濾膜過濾除去細菌和大顆粒后備用。

1.3 實驗動物分組、肺炎癥模型制備及處理18 只小鼠隨機分為對照組、CSE 組和CSE+XBD173 組，每組6 只。CSE 組和CSE+XBD173組小鼠給予CSE 滴鼻，每 次20 μ L，連 續28 d，2 次 間 隔24 h；在 第22～28 天，CSE+XBD173 組小鼠在CSE 刺激前0.5 h 給予10 mg·kg－1XBD173腹腔注射。第29 天處死小鼠。

1.4 HE 染色觀察各組小鼠肺組織病理形態表現處死小鼠后取新鮮肺組織，4%多聚甲醛固定20 h。脫水、透明、浸蠟和包埋，將包埋好的肺組織蠟塊切片，厚度為4 μm，按HE 染色試劑盒進行后續步驟。染色完成后，顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理形態表現。

1.5 PAS 染色觀察各組小鼠肺組織病理形態表現 處死小鼠后取新鮮肺組織，10% 甲醛固定，石蠟包埋，2 μm 厚度切片后常規脫蠟至水，PAS染色后中性樹膠封固。顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理形態表現。

1.6 RAW264.7 細胞TSPO 蛋白敲低和篩選將處于對數生長期的RAW264.7 細胞經細胞刮刮下，完全培養基制成細胞密度為（3～5）×104mL－1的細胞懸液，6 孔細胞培養板鋪板，每孔2 mL，培養24 h 后，采用感染復數（multiplicity of infection，MOI）為20 的慢病毒感染RAW264.7 細胞以敲低TSPO 基因，培養12 h 后完全培養基換液繼續培養，在完全培養基中加入2 mg·L－1嘌呤嘧啶篩選，當病毒載體上的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）陽性表達率大于80%時，收集細胞進行后續實驗。TSPO 基因敲低序列，上游引物：5′-ACCATTGGGCC-3′，下 游 引 物：5′-CTGGTCTA-3′。

1.7 RT-qPCR 法檢測各組RAW264.7 細胞中白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA 表達水平將實驗處理后的細胞按照RNA 提取試劑盒說明書提取RNA；采用微量分光光度計測定總RNA純度，檢測RNA 樣本在波長260 和280 nm 處的吸光度（A）值，控制A（260）/A（280）在1.9～2.1，RNA 電泳檢測其完整性。檢測濃度及純度后取2 μg 總RNA，采用逆轉錄試劑盒合成cDNA。逆轉錄條件：37 ℃反應15 min，85 ℃反應5 s。將逆轉錄所得cDNA 純化后應用RT-qPCR 儀進行PCR 擴增。反應總體積為20 μL：2 μ L cDNA 模板，2 μ L 引 物，10 μL SYBR qPCR Master Mix，6 μL H2O。PCR 反應條件：95 ℃預變性30 s，擴增循環95 ℃、5 s，56 ℃、34 s，共40 個 循 環。以β-actin 為 參 照，采 用2－ΔΔCt法 計 算IL-6 和TNF-α mRNA 相對表達水平。引物序列見表1。

1.8 Western blotting 法檢測各組RAW264.7 細胞中NF-κB/p65 和p-NF-κB/p65 蛋白表達水平細胞刺激結束后，吸去培養基，PBS 緩 沖 液 洗 滌1 次，加入200 μL RIPA 強裂解液，檢測蛋白濃度；加入含SDS 上樣緩沖液，煮10 min；進行SDSPAGE 凝膠配制，上樣電泳；采用PVDF 膜轉膜；5%脫脂奶粉進行封閉；按照抗體說明書稀釋一抗，4 ℃過夜孵育。TBST 洗滌3 次，進行二抗孵育，4 ℃孵育2 h，TBST 洗滌3 次后，采用ECL 超敏化學底物試劑盒上機檢測拍照分析；Image J 軟件分析各蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。

1.9 流式細胞術檢測各組RAW264.7 細胞CD80、CD86、iNOS 和ROS 表達水平將各組細胞分裝入5 mL 流式細胞管內，離心細胞，棄上清，CD80、CD86 和iNOS 抗體用孵育緩沖液按照1∶1 000 稀釋，加入100 μL 含抗體的孵育緩沖液，重懸細胞；在冰上孵育30 min。1 200 r·min－1離心5 min，棄上清液；加入100 μL 孵育緩沖液重懸細胞，使用流式細胞分析儀檢測分析。ROS 按照試劑盒說明書檢測。CD80 和CD86 表達水平以各組熒光陽性細胞數量占總細胞數百分比表示，iNOS 和ROS 表達水平以各組細胞的平均熒光強度表示。

1.10 流式細胞術檢測各組RAW264.7 細胞凋亡率收集已處理好的細胞至離心管內，1 000 g 離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS 緩沖液輕輕重懸細胞并計數，取（5～10）×104個萬重懸的細胞，1 000 g 離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC 結合液輕輕重懸細胞；加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，混勻；加入10 μL 碘化丙啶染色液，混勻；室溫避光孵育10 min，流式細胞儀檢測，按說明書分析。

1.11 統計學分析采用SPSS 24.0 軟件進行統計學分析。各組細胞中CD80、CD86、iNOS 和ROS表達水平，IL-6 和TNF-α mRNA 表達水平，細胞凋亡率，NF-κB/p65 和p-NF-κB/p65 蛋白表達水平均符合正態分布，以x±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠肺組織病理形態表現HE 染色和PAS 染色結果顯示：對照組小鼠肺組織中支氣管結構完整，肺泡腔結構清晰，肺泡壁厚度均勻，無增寬和滲出等現象，肺泡間隔無水腫、無炎癥細胞浸潤、無分泌物滲出。CSE 組小鼠肺組織中支氣管管腔變窄，管壁增厚，有分泌物滲出，可見大量炎癥細胞浸潤，肺泡結構不完整。CSE+XBD173組小鼠肺組織中炎癥表現減輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態表現（×200）Fig.1 Pathomorphology of lung tissue of mice in various groups（×200）

2.2 各組RAW264.7 細胞中M1 表面標志物CD80、CD86 和iNOS 表達水平與對照組比較，CSE 組RAW264.7 細 胞 中CD80、CD86 和iNOS 表達水平明顯升高（P<0.05或P<0.01）；與CSE組比較，CSE+XBD173 組RAW264.7 細 胞 中CD80、CD86 和iNOS 表 達 水 平 明 顯 降 低（P<0.05）。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測各組細胞中CD80、CD86 和iNOS 表達水平Fig.2 Expression levels of CD80, CD86，and iNOS in cells in various groups detected by flow cytometry

2.3 各組RAW264.7 細胞中ROS 表達水平與對照組（19 290±2 906）比較，CSE 組RAW264.7細胞中ROS 表達水平（26 789±3 980）明顯升高（P<0.05）；與CSE 組 比 較，CSE+XBD173 組RAW264.7 細胞中ROS 水平（20 120±4 114）明顯降低（P<0.05）。

2.4 各組RAW264.7 細胞凋亡率與對照組（8.80%±0.42%）比較，CSE 組RAW264.7 細胞凋亡率（28.96%±1.73%）明顯升高（P<0.05）；與CSE 組 比 較，CSE+XBD173 組RAW2647 細 胞凋亡率（22.94%±2.2%）明顯降低（P<0.05）。見圖3。

圖3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率Fig.3 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.5 各組RAW264.7 細胞中IL-6 和TNF-α mRNA表達水平與對照組比較，CSE 組RAW264.7 細胞 中IL-6 和TNF-α mRNA 表 達 水 平 明 顯 升 高（P<0.05）；與CSE 組 比 較，CSE+XBD173 組RAW264.7 細 胞 中IL-6 和TNF-α mRNA 表 達 水 平明顯降低（P<0.05）。當RAW264.7 細胞TSPO蛋白敲低后，在TSPO KD+control 組、TSPO KD+CSE 組 和 TSPO KD+CSE+XBD173 組RAW264.7 細 胞 中IL-6 和TNF-α mRNA 表 達 水 平差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 RT-qPCR 法檢測各組細胞中IL-6 和TNF-α mRNA 表達水平Tab.2 Expression levels of IL-6 and TNF-α mRNA in cells in various groups detected by RT-qPCR method (n=3，±s）

表2 RT-qPCR 法檢測各組細胞中IL-6 和TNF-α mRNA 表達水平Tab.2 Expression levels of IL-6 and TNF-α mRNA in cells in various groups detected by RT-qPCR method (n=3，±s）

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with CSE group.

TNF-α 1.09±0.13 1.61±0.22*0.65±0.14△1.00±0.10 0.91±0.06 0.75±0.13 Group Control CSE CSE+XBD173 TSPO KD+control TSPO KD+CSE TSPO KD+CSE+XBD173 IL-6 0.95±0.07 2.75±0.98*0.87±0.30△0.32±0.18 0.14±0.07 0.14±0.11

2.6 各組 RAW264.7 細胞中 NF-κB/p65 和p-NF-κB/p65 蛋白 表達水平3 組RAW264.7 細 胞中NF-κB/p65 蛋白表達水平比較差異無統計學意義 （P>0.05）；與 對 照 組 比 較，CSE 組RAW264.7 細胞中p-NF-κB/p65 蛋白表達水平明顯升高（P<0.05）；與CES組比較，CSE+XBD173組RAW264.7 細胞中p-NF-κB/p65 表達水平明顯降低（P<0.05）。見圖4。

圖4 Western blotting 法檢測各組細胞中NF-κB/p65 和p-NF-κB/p65 蛋白表達電泳圖（A）及直條圖（B 和C）Fig.4 Electrophoregram (A) and histograms (B，C) of expressions of NF-κB/p65 and p-NF-κB/p65 proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

香煙是一種具有多重毒性的成癮物，與全身多個器官的損害有關［6］。香煙煙霧對心血管具有嚴重的損傷作用，可表現為內皮功能障礙氧化應激增加、心血管發病率和死亡率增加等［7］。TSPO 首先由BRAESTRUP 于1977 年發現，被認為與外周的苯二氮卓類結合位點有高親和性［8］。正常情況下，TSPO 在中樞神經系統中表達較低，僅限于星形膠質細胞和小膠質細胞，但當腦損傷或炎癥時，其表達水平明顯升高［9-10］。在急性肺炎模型中，TSPO可作為衡量炎癥損傷的指標［11-12］。研究［13-14］表明：TSPO 配體XBD173 可有效緩解視網膜缺血模型中的神經退行性變，還可減輕視網膜色素上皮細胞的炎癥反應。本研究結果顯示：XBD173 可有效抑制CSE 誘導的肺部炎癥反應。

巨噬細胞是重要的免疫細胞，其主要的功能包括：①吞噬病原體、感染細胞、碎片和死亡細胞；②呈遞抗原；③分泌各種細胞因子［15］。當巨噬細胞受到刺激時，會極化為M1 型巨噬細胞和M2 型巨噬細胞，M1 型巨噬細胞作為一種促炎癥細胞存在，主要參與體內的1 型輔助T 細胞（T helper 1 cell，TH1）介 導 的 免 疫 反 應，可 分 泌TNF-α、IL-1β、IL-12 和IL-6 等 炎 癥 因 子［15-16］，M1 型 巨 噬細胞參與多種疾病的病理過程。在小鼠蛛網膜下腔出血模型中，TSPO 配體處理可降低小膠質細胞活化 和 增加抗炎因子的產生［17］，TSPO 配體2-（2-氯苯基）喹唑啉-4-基二甲基氨基甲酸酯（2-Cl-MGV-1）和2-苯基喹唑啉-4-基二甲基氨基甲酸酯（MGV-1）可降低脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小 膠 質 細 胞 炎 癥 因 子TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達［18］。本研究結果顯示：CSE 刺激使RAW264.7細胞增加M1 極化水平和細胞因子分泌，XBD173處理可抑制巨噬細胞M1 極化和細胞因子分泌，與小鼠肺組織的病理結果一致；而在TSPO 敲低組中，各組之間無明顯變化，提示TSPO 對巨噬細胞功能起重要的調控作用。

ROS 既是一種重要的抗菌介質，也是重要的信號分子［19］，在細胞增殖、缺氧適應和細胞信號傳遞決定中起重要作用，但過量的ROS 會導致不可逆的細胞損傷甚至細胞死亡，許多疾病的發生和發展與ROS 生產過剩有密切關聯［20］。在視網膜損傷模型中，XBD173 可降低巨噬細胞的吞噬能力，減少ROS 產生從而發揮保護作用［21］。本研究結果顯示：XBD173 可抑制CSE 誘導的ROS 產生。細胞產生過量ROS 會導致細胞凋亡。本研究結果同時顯示：XBD173 可抑制CSE 誘導的細胞凋亡水平。凋亡的巨噬細胞通過釋放代謝產物和炎癥因子，激活MAPK 信號通路，導致巨噬細胞M1 極化增加和炎性因子釋放［22］。年齡相關黃斑變性模型的 研 究［13］結 果 顯 示：XBD173 可 通 過NADPH 氧化酶2 （NADPH oxidase 2，NOX2）通路或鈣離子減少ROS 的產生，降低小膠質細胞激活。研究［23］顯 示：TSPO 可 與NOX2 亞 基gp91phox 和p22phox 結合，其機制可能與NOX2 通路相關。

NF-κB 于1986 年作為結合B 細胞的κ 輕鏈增強子 的 轉 錄 因 子 被 發 現［24］。NF-κB 家 族 是 真 核 轉 錄因子結構相關的蛋白家族，包括5 個成員：NF-κB1（p50 及其前體p105）、NF-κB2（p52 以及其前體p100）、RelA （p65）、c-Rel 和RelB，5 個成員在正常狀態下通常在細胞質中與NF-κB 抑制因子（inhibitory of NF-κB，IκB）家族結合保持未激活狀態，在其經典激活途徑中，當受到相應信號分子刺激時，IκB 首先被磷酸化，繼而降解，從而促使NF-κB 異二聚體（RelA-p50 二聚體）從細胞質中轉移至細胞核，調控巨噬細胞向M1 型極化，進 而 促 進IL-1β、TNF-α 和IL-6 等 促 炎 因 子 的 釋放［25-26］。研究［27］顯示：NF-κB 通 路參與小膠質細胞炎癥的激活。本研究結果顯示：CSE 處理組細胞中p-NF-κB/p65 蛋白表達水平升高，而XBD173可降低其表達水平，提示XBD173 可能通過調節NF-κB 通路而發揮抗炎作用。

綜上所述，TSPO 配體XBD173 可減輕CSE 誘導的小鼠肺部炎癥反應，TSPO 可調控巨噬細胞M1 極化和炎癥因子的產生，其機制可能與NF-κB通路有關，但其具體機制仍需進一步研究。本研究為XBD173 對香煙煙霧誘導的肺部炎癥反應的保護作用提供了理論和實驗依據，未來應進一步結合動物實驗和臨床試驗探索XBD173 的炎癥抑制作用機制，為香煙煙霧引起的肺部炎癥的改善提供新思路。