阿托伐他汀對人舌鱗癌CAL-27 細胞增殖、凋亡和遷移的影響及其機制

王 開, 黃 漢

（錦州醫科大學附屬第一醫院口腔頜面外科，遼寧 錦州 121000）

舌鱗癌的發生率在口腔癌中一直位于首位并呈持 續 升 高 趨 勢［1］，且 近 年 來 發 展 趨 向 年 輕 化［2］，高惡性、高復發率、高淋巴結轉移率和低存活率是舌鱗癌的主要特征［3］。目前，手術聯合術后放化療是舌鱗癌的首要治療方法，但由于其部位特殊、手術難度大、放化療不良反應大且易復發，患者預后并不十分理想。因此，探討關于舌鱗癌的有效靶向治療藥物具有重要意義。他汀類藥物是一種主要針對甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVP）的限速酶——3-羥甲基戊二醇輔酶A 還原酶（3-hydroxymethylpentanediol coenzyme A reductase，HMGCR）的抑制劑，阿托伐他汀（atorvastatin，ATO）是其最常見的一種，臨床上常用于治療高脂血癥和動脈粥樣硬化等心血管循環系統疾病［4］。近年來多項研究［5-10］表明：ATO 在腫瘤的發生發展過程中具有抑制作用，且與腫瘤患者的生存率有密切關聯，可調控前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和非小細胞肺癌等多種癌癥細胞的表達。但目前，關于ATO 在舌鱗癌中所發揮的作用及其機制的報道較少，本研究通過探討ATO 對舌鱗癌CAL-27 細胞增殖、細胞凋亡和細胞遷移的影響及其可能的作用機制，為臨床舌鱗癌的治療及提高舌鱗癌患者的生存率提供必要的理論支持和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人舌鱗癌細胞株CAL-27 購于中科院上海細胞庫。ATO （藥物濃度 ≥ 98%）購于北京索萊寶生物科技有限公司，DMEM-高糖培養基和雙抗購于美國Hyclone 公司，胎牛血清購于美國Gemini 公司，CCK-8 檢測試劑盒、4% 甲醛固定液、結晶紫染色液、Hoechst33342 染色液、BCA 蛋白定量試劑盒和超敏ECL 化學試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司，Annexin Ⅴ-FITC/7-AAD 凋亡檢測試劑盒購于北京四正柏生物科技有限公司，蛋白Marker購于美國Thermo 科技有限公司，β-actin 抗體和P53 抗體購于南京巴傲德生物科技有限公司，P21抗體和周期蛋白依賴性激酶6 （cyclin-dependent kinase 6，CDK6）抗體購于北京博奧森生物技術有限 公 司，B 細 胞 淋 巴 瘤2 （B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗 體、Bcl-2 相 關X 蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）-3 抗體和Caspase-9 抗體購于沈陽萬類生物科技有限公司。恒溫細胞培養箱和酶標儀購于美國Thermo 公司，倒置顯微鏡購于德國LEICA 公司，熒光顯微鏡購于日本Olympus 公司，流式細胞儀購于美國BD 公司，蛋白電泳儀購于美國BIORAD 公司，ECL 發光成像系統購于上海天能科技有限公司。

1.2 細胞培養使用含有10% 胎牛血清和1% 雙抗（青霉素/鏈霉素）的高糖DMEM 培養基，將CAL-27 細胞置于37 ℃、5% CO2的恒溫孵育箱中培養。當細胞長至皿底80%～90% 時，使用胰蛋白酶消化，離心重懸后傳代，之后根據預實驗將細胞分為對照組（不含 ATO）和1、5、10、20 及40 μmol?L－1ATO 組并進行實驗。

1.3 CCK-8 法檢測各組細胞存活率取對數生長期CAL-27 細胞，消化離心后，將細胞（每孔5×103個細胞）均勻接種于96 孔細胞培養板中，邊緣以無菌PBS 緩沖液封閉，孵箱孵育直至貼壁。分為對照組和不同濃度ATO 組，分別采用含0、1、5、10、20 和40 μmol?L－1ATO 的培養基繼續孵育24 和48 h。孵育結束每孔加入10 μL CCK-8 試劑，2 h 后采用酶標儀于波長450 nm 處測定每孔吸光度（A）值，計算細胞存活率。細胞存活率=（實驗組A 值－空白組A 值）/（對照組A 值－空白組A 值）×100%。

1.4 克隆形成實驗檢測各組細胞克隆形成率將對數生長期的CAL-27 細胞消化離心重懸，均勻接種于6 cm 的培養皿中，每皿1 000 個細胞。細胞貼壁及生長狀態良好時，分為對照組和不同濃度ATO 組，分別采用含0、1、5、10、20和40 μmol?L－1ATO 的培養基進行常規培養，每2 d 更換1 次培養基，連續培養14 d。4%多聚甲醛固定后結晶紫染色液進行染色，拍照記錄并計算細胞克隆形成率。細胞克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。

1.5 Hoechst33342 熒光染色觀察各組細胞凋亡情況以每皿2×105個細胞的密度，將生長狀態良好的CAL-27 細胞消化離心重懸，均勻接種于6 cm 的培養皿中。細胞貼壁后，分為對照組和不同濃度ATO 組，分別采用含0、1、5、10、20和40 μmol?L－1ATO 的培養基繼續孵育48 h，加入Hoechst33342染色液染色30 min，熒光顯微鏡下拍照記錄。細胞凋亡時可觀察到細胞核呈致密濃染或碎塊狀。

1.6 流式細胞術AnnexinⅤ-FITC/7-AAD 雙標記檢測各組細胞凋亡率將對數生長期的CAL-27 細胞消化離心重懸后，將5×105個細胞接種于6 cm的培養皿中。細胞貼壁且生長狀態良好時，分為對照組和不同濃度ATO 組，分別采用含0、1、5、10、20 和40 μmol?L－1ATO 的培養基繼續孵育48 h。用不含EDTA 的胰酶消化細胞，Binding buffer 重懸，每組取100 μ L 細胞懸液加入流式管中，加入8 μL Annexin Ⅴ-FITC 室溫避光孵育30 min，再加10 μL 7-AAD 和400 μL 的PBS 緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率=早期凋亡率（Q3 象限）+ 晚期凋亡率（Q2 象限）。

1.7 細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移率以每皿1.5×105個細胞的密度，將生長狀態良好的CAL-27 細胞消化離心重懸后，均勻接種于6 cm 的培養皿中。細胞鋪滿整個皿底時，使用200 μL 移液器槍頭均勻劃痕，PBS 緩沖液清洗懸浮細胞，分為對照組和不同濃度ATO 組，分別采用含0、1、5、10、20 和40 μmol?L－1ATO 的培養基繼續孵育48 h。分別于0 和48 h 進行拍照記錄，計算細胞遷移率。細胞遷移率=（0 h 劃痕寬度－24 h 劃痕寬度）/ 0 h 劃痕寬度×100%。

1.8 Western blotting 法檢測各組細胞中P53、P21、CDK6、Bcl-2、Bax、Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達水平將CAL-27 細胞分為對照組和不同濃度ATO 組，分 別 采 用 含0、1、5、10、20 和40 μmol?L－1ATO 的培養基常規培養48 h。使用細胞刮刀刮下經不同濃度ATO 處理的CAL-27 細胞，加入蛋白裂解液于冰上充分裂解，離心后取上清，BCA 蛋白定量法進行定量，調整蛋白濃度并制樣。電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后依次加入β-actin、P53、P21、CDK6、Bcl-2、Bax、Caspase-3 和Caspase-9 兔抗人一抗，4 ℃ 搖床過夜。TBST 洗膜6 次后加入HRP 標記的二抗，室溫孵育2 h 后洗膜3 次，ECL 顯影，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值×100%。

1.9 統計學分析采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞存活率，克隆形成率，細胞凋亡率，細胞遷移率及細胞中P53、P21、CDK6、Bcl-2、Bax、Caspase-3 和Caspase-9 蛋 白 表 達 水 平均符合正態分布且方差齊，以x±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組CAL-27 細胞的細胞存活率CCK-8 法檢測結果顯示：對照組和不同濃度ATO （1、5、10、20 和40 μmol?L－1ATO）組CAL-27 細 胞 的24 h 細 胞 存 活 率 分 別 為（100.00±0.00）%、（95.33±0.50）%、（90.47±0.81）%、（84.47±0.90）%、（75.47±1.59）% 和 （64.17±0.59）%，48 h 細胞存活率分別為（100.00±0.00）%、（94.70±0.95）%、（86.47±1.34）%、（81.03±1.04）%、（61.27±0.64）%和（37.06±1.62）%。與對照組比較，不同濃度ATO 組CAL-27 細胞存活率明顯降低（P<0.05），且呈濃度依賴性和時間依賴性。見圖1。

2.2 各組CAL-27 細胞克隆形成率與對照組（69.28%±2.26%）比 較，1、5、10、20 和40 μmol?L－1ATO 組細胞克隆形成率（58.16%±1.16%、44.72%±1.32%、20.86%±0.87%、7.47%±0.83% 和0.15%±0.18%）呈濃度依賴性降低（P<0.01）。見圖2。

圖2 克隆形成實驗檢測各組細胞克隆形成情況（結晶紫）Fig.2 Colony formations of CAL-27 cells in various groups detected by clone formation assay（Crystal violet）

2.3 各組CAL-27 細胞凋亡率Hoechst33342 染色檢測結果顯示：對照組細胞為均勻的淡藍染色，核膜完整，細胞形態正常；1 和5 μmol?L－1ATO 組細胞呈現大小形態不均，細胞核呈高亮狀態；10 μmol?L－1ATO 組細胞核固縮明顯，細胞核熒光強度更高；20 和40 μmol?L－1ATO 組細胞幾乎全部凋亡。見圖3。

圖3 倒置熒光顯微鏡觀察各組CAL-27 細胞凋亡情況（Hoechst33342 染色，×20）Fig.3 Apoptosis of CAL-27 cells in various groups observed by inverted fluorescence microscope（Hoechst33342 staining，×20）

流式細胞術檢測結果顯示：經Annexin Ⅴ-FITC /7-AAD雙標記后，與對照組（9.23%±0.38%）比較，1、5、10、20 和40 μmol?L－1ATO 組細胞凋亡 率 （10.25%±0.09%、12.45%±0.38%、16.71%±0.11%、31.00%±0.29% 和48.43%±0.42%）均明顯升高（P<0.05），且呈濃度依賴性。見圖4。

圖4 Annexin Ⅴ-FITC/7-AAD 法檢測各組 CAL-27 細胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis of CAL-27 cell in various groups detected by Annexin Ⅴ-FITC/7-AAD method

2.4 各組CAL-27 細胞遷移率與對照組（89.83%±4.15%）比 較，1、5、10、20 和40 μmol?L－1ATO 組細胞遷移率（80.59%±6.28%、68.90%±4.03%、51.13%±4.07%、30.82%±3.70% 和 16.77%±1.46%）明 顯 降 低 （P<0.05），且呈濃度依賴性。見圖5。

圖5 細胞劃痕實驗檢測CAL-27 細胞遷移情況（×20）Fig.5 Migration of CAL-27 cells in various groups detected by cell scratch test(×20）

2.5 各組CAL-27 細胞中P53、P21、CDK6、Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達水平不同濃 度ATO （1、5、10、20 和40 μmol?L－1）作 用CAL-27 細胞48 h 后，Western blotting 法檢測結果顯示：與對照組比較，不同濃度ATO 組CAL-27細胞中P53、P21、Bax、Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達水平升高（P<0.05），CDK6 和Bcl-2 蛋白表達水平降低（P<0.05）。見圖6 和7。

圖6 各組CAL-27 細胞中P53、P21 和CDK6 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.6 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of P53, P21, and CDK6 proteins in CAL-27 cells in various groups detected by Western blotting method

圖7 各 組CAL-27 細 胞 中Bax、Bcl-2、Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達電泳圖（A)和直條圖（B）Fig.7 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of Bax, Bcl-2, Caspase-3, and Caspase-9 proteins in CAL-27 cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

舌鱗癌由于其豐富的淋巴循環以及缺少筋膜組織，易發生淋巴結轉移和擴散［11］，與其他類型口腔癌癥比較預后較差。為尋找更好的治療方法，研究者對于舌鱗癌分子靶向治療藥物的研究開始逐漸深入。他汀類藥物通過多種信號通路阻斷癌癥的發展［12］，ATO 是他汀類藥物中最具代表性的藥物，能夠通過抑制腫瘤細胞增殖及誘導腫瘤細胞凋亡［13］、自 噬［14］和周期阻滯［15］等相關通路發揮抗癌作用。但其對舌鱗癌的影響及機制尚不清楚。

本研究中CCK-8 實驗和克隆形成實驗檢測結果表明：ATO 對CAL-27 細胞的細胞增殖有抑制作用。研究［16］顯示：P53-P21 轉錄軸對癌細胞具有負調控作用，可以調節下游多種轉錄因子，從而實現對癌癥的調控作用。CDK6 是細胞轉錄因子作用靶點，CDK6 活化異常時，細胞周期調節紊亂，導致細胞異常增殖［17］，而激活P53-P21 轉錄軸的表達可以顯著抑制CDK6 的異常活化，達到抑制癌細 胞 增 殖 的 作 用［18］。本 研 究 中Western blotting 法檢測結果顯示：ATO 處理后的CAL-27 細胞中 P53和P21 蛋白表達上調，CDK6 蛋白表達下調，表明ATO 激活了P53-P21 轉錄軸的表達，進而抑制CDK6 的活化，與相關研究［18］結果一致。因此，ATO 通過調控P53/P21/CDK6 信號通路發揮對CAL-27 細胞增殖的抑制作用。

凋亡是一種細胞的程序性死亡，在該過程中，細胞內特定機制以一種有序、受控的方式終止細胞的存在［19］。本研究中的Hoechst33342 染色和流式細胞術檢測結果顯示：ATO 處理后的CAL-27 細胞發生明顯凋亡，且呈濃度依賴性。線粒體凋亡是凋亡途徑中最常見的一種，主要通過Caspase 級聯反應誘導腫瘤細胞凋亡［20］。Bcl-2 是一種主要分布于細胞核和線粒體膜的抗凋亡蛋白，Bax 是主要分布于細胞質的促凋亡蛋白，2 種蛋白比例失衡將導致Caspase-3 和Caspase-9 的異常表達，阻礙腫瘤細胞 的 凋 亡［21-22］。Bax 是P53 的 重 要 轉 錄 靶 點，P53表達上調可引起Bax 表達上調和Bcl-2 表達下調，從而促使Caspase-3 和Caspase-9 的表達，進而誘導腫 瘤 細 胞 凋 亡［23］。本 研 究 中Western blotting 法 檢測結果顯示：經ATO 處理后的CAL-27 細胞中，Bax 表 達 上 調，Bcl-2 表 達 下 調，Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達上調，表明ATO 通過調節Bax/Bcl-2 比值促進CAL-27 細胞凋亡。

綜上所述，ATO 作為一種常見降血脂藥，可以抑制舌鱗癌CAL-27 細胞增殖和遷移并且誘導凋亡，其機制可能與P53/P21/CDK6 通路和上調Bax/Bcl-2 比值有關，表明ATO 可能在舌鱗癌治療方面具有一定的應用前景。