通絡糖泰方治療糖尿病周圍神經病變作用機制的網絡藥理學和分子對接分析

李周泉, 李 慧, 唐 瑩, 楊莉君, 姜迎宏, 殷麗平,2

（1.成都中醫藥大學臨床醫學院中醫內科學，四川 成都 610075；2.成都中醫藥大學附屬醫院內分泌科，四川 成都 610075）

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病常見的慢性并發癥，60%～90%的糖尿病患者會在10 年后出現不同程度的神經功能損害，其中半數為DPN［1］，與創傷性相關的截肢患者比較，其5 年生存率低于50%［2］，現已成為患者非創傷性截肢最主要的危險因素，嚴重影響患者的生活質量［3］。目前關于DPN 的發生機制尚未完全清楚，可采用控制血糖、飲食及生活方式干預、手術及對癥治療和病因治療等方法治療DPN［4-6］。針對DPN 中涉及的潛在分子和細胞機制的諸多治療，包括醛糖還原酶抑制劑、苯酞胺和蛋白激酶C 抑制劑等，雖然已在臨床應用40 余年，但因其皆為針對DPN 單一發病機制的治療，療效有限［7-9］。中醫藥治療DPN 具有整體調節、毒副作用小和臨床效果好等特點。通絡糖泰方（Tongluo Tangtai Power，TLTT）由黃芪、當歸、地骨皮、水蛭、蠶沙、川牛膝、玄參、白芥子和赤芍等藥物組成，是本院內分泌科謝春光教授的臨床經驗方，主要用于治療DPN。中藥具有多成分、多靶點和多通路的特點，網絡藥理學［10］是探索藥物成分與靶點相互作用的新興研究方法。本研究通過探討TLTT 的主要活性化合物及其作用靶點，借助網絡藥理學的方法從系統生物整體的角度闡明TLTT 治療DPN 的作用機制，為TLTT 的進一步應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 TLTT 有效成分篩選

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（https：//tcmsp-e.com/）［11］以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類 藥 性 （druglikeness，DL）≥0.18 為篩選條件，篩選TLTT 有效成分。

1.2 靶點預測

在TCMSP 數據庫中將成分Mol ID 號輸入相關靶點信息欄進行預測，再通過蛋白質序列數據庫（https：//www.uniprot.org/）進行核對。

1.3 疾病靶點搜集

在基因卡片數據庫（https：//www.genecards.org/）中以“diabetic peripheral neuropathies”為檢索詞，搜集疾病靶點。

1.4 核心靶點篩選及構建蛋白-蛋白互作（proteinprotein interaction，PPI）網絡

將成分靶點與疾病靶點交集得到的數據，輸入 STRING 數據庫（https：//string-db.org/），物種選擇“人類”，置信度調整為“較高”，隱藏無聯動靶點，在線導入Cytoscape 3.9.1 軟件進行分析，在軟件工具箱中選擇“統計信息生成模式”，根據度值篩選出核心靶點。

1.5 TLTT-活性化合物-核心靶點網絡構建

將以上數據導入 Cytoscape 3.9.1 軟件，構建中藥-活性成分-核心靶點的網絡。

1.6 基因本體分析及基因組通路富集

將交集靶點導入基因富集分析庫（https：//metascape.org/）中，物種選擇“人類”，選擇基因本體論（Gene Ontology，GO）模式，完成生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3 個層面的富集分析，在京都基因與基因組百 科 全 書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（https：//www.kegg.jp/）進行富集分析，將數據表格保存，結果以柱狀圖和氣泡圖的形式輸出。

1.7 分子對接

從蛋白質結構數據庫（http：//www.rcsb.org/）中獲取靶點的蛋白結構，使用分子對接軟件將核心靶點與活性成分進行對接驗證。

1.8 核心靶點的驗證

1.8.1 實驗動物、細胞、試劑和主要儀器 30 只SPF 級SD 大鼠（成都森威實驗動物有限公司，動物生產與使用許可證號：2021DL-020）。大鼠雪旺細胞（上海賽佰康生物技術股份有限公司，貨號：RSC96）。TLTT 由黃芪、當歸、地骨皮、水蛭、蠶沙、川牛膝、玄參、白芥子和赤芍等藥物組成，由成都中醫藥大學附屬醫院制劑科制作，1 g 浸膏相當于生藥4.3 g，批號：20201108。彌可保（甲鈷胺片）購自衛材（中國）藥業有限公司（批準文號：國藥準字H20143107）。Cell Counting Kit 8 檢測盒（型號：ab228554），重組Anti-絲氨酸/蘇氨酸激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）抗體（型號：ab81283），重組Anti-TP53 抗體（型號：ab241566）（英國Abcam 公司），辣根過氧化物酶標記兔二抗（型號：A0208）和極超敏ECL 化學發光試劑盒（型號：P0018FS）（南京碧云天生物公司）。熒光顯微鏡（型號：Leica DM IL LED，德國徠卡公司），多功能酶聯免疫分析儀（型號：BK-EL10C，山東博科生物產業有限公司），化學發光成像儀（型號：MiniChem，廣州合眾生物有限公司）

1.8.2 含藥血清制備 大鼠適應期結束，將其隨機分為對照組、彌可保組和TLTT 組，每組10 只，TLTT 組大鼠按人體等效劑量灌胃，每日2 次，連續給藥3 d；對照組和彌可保組大鼠采用同等劑量的生理鹽水和彌可保溶液灌胃。末次灌胃2 h 后，各組大鼠在藥物麻醉后于腹主動脈取血，離心得到血清并將其置于無菌離心管。經滅活和滅菌處理后封口膜密封，標記后凍存備用。

1.8.3 實驗建模 將雪旺細胞培養至第3 代后接種于6 孔細胞培養板和96 孔細胞培養板進行分組干預：10%彌可保組大鼠血清+50 mmol·L－1葡萄糖培養基（彌可保組），10%TLTT 組大鼠血清+50 mmol·L－1葡萄糖培養基（TLTT 組），10%對照組大鼠血清+5.6 mmol·L－1葡萄糖培養基（對照組），10%對照組大鼠血清+50 mmol·L－1葡萄糖培養基（高糖模型組）。

1.8.4 實驗方法 ①CCK-8 法檢測雪旺細胞存活率：在96 孔細胞培養板上培養各組細胞并更換含藥血清進行干預，48 h 后每孔滴加CCK-8 試劑，繼續放在孵育箱等待1 h，最后應用多功能酶聯免疫分析儀測定吸光度（A）值，計算各組細胞存活率。②Western blotting 法檢測關鍵靶點AKT1 和抑癌基因TP53 蛋白表達水平：將6 孔細胞培養板中培養狀態良好的各組雪旺細胞中加入裂解液，收集上清液采用BCA 法進行蛋白定量后，經電泳后切取目的條帶轉印至PVDF 膜上，隔夜進行一抗和二抗孵育，再采用ECL 法顯色，將ECL 的AB 混合液體滴在PVDF 膜上，將膜放置于化學發光成像儀中，在電腦上操作掃描，采用Image J 軟件分析計算條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值，每個實驗重復3 次。

1.8.5 統計學分析 采用SPSS 26.0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞存活率符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，方差齊時采用多重比較法（Turkey），方差不齊時采用Dunnett T3 檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TLTT 的活性成分及靶點預測

TLTT 中共檢索出95 種活性成分，463 個靶點，再將預測出的靶點蛋白名稱轉換為基因名稱。

2.2 TLTT 有效成分及靶點網絡構建

將檢索的TLTT 有效成分與靶蛋白導入Cytoscape 3.9.1 軟件構建“成分-靶點”網絡，得到479 個節點和1 256 條相互作用關系，其中藥物間共有成分8 個，記為A、B、C、D、E、F、G 和H，見圖1。

圖1 藥物成分的靶點網絡Fig.1 Target networks of drug components

2.3 TLTT 與DPN 共 同 作 用 靶 點

從基因卡片數據庫中獲得1 187 個DPN 的相關靶點。將463 個TLTT 的共有作用靶點與1 187 個DPN 相關靶點輸入Bioinformatics & Evolutionary Genomics 平臺，在線獲取交集韋恩圖，得到TLTT 與DPN 共同作用靶點137 個。見圖2。

圖2 藥物和疾病靶點交集圖Fig.2 Intersection graphs of drugs and disease targets

2.4 TLTT 治療DPN 潛在靶點的PPI 網絡圖構建及核心靶點圖

利用STRING 數據庫構建PPI 網絡圖，見圖3。通過Cytoscape 軟件對網絡節點的拓撲參數（度值和中介中心性）進行分析篩選，即度值≥16.4，中介 中 心 性≥3.07×10－3。經 篩 選 得 到 核 心 靶 點26 個，包括AKT1、TP53、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、表 皮 生 長 因 子 受 體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和血管內皮生長因子A （vascular endothelial growth factor-A，VEGFA）等。見圖4。

圖3 藥物與疾病共同靶點 PPI 網絡圖Fig.3 PPI network diagram of common targets of drugs and diseases

圖4 藥物與疾病共同靶點蛋白頻數圖Fig.4 Frequency graph of common target proteins of drugs and diseases

2.5 藥物-成分-疾病-靶點圖

合并成分-靶點網絡和PPI 圖，得到重疊部分即為藥物-成分-疾病-靶點圖（圖5），可觀察到前10 種作用最明顯的活性成分，具體見表1。

2.6 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析結果

將治療靶點導入 Metascape 軟件和KEGG Pathway 數據庫分別進行 GO 三層面分析和 KEGG通路富集分析。結果顯示：TLTT 主要通過調控細胞對無機物的反應、對激素刺激的反應、正向調節細胞遷移、調節激酶活性和對細胞外刺激的反應等生物學過程，以及癌癥通路、脂質和動脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B （protein kinase B，Akt）信號通路、晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體信號通路和絲裂原活化蛋白激酶（mitosolysis-activated protein kinase，MAPK）等信號通路發揮治療DPN 的作用。見圖6 和7。

圖6 潛在靶點的KEGG 富集分析圖Fig.6 KEGG enrichment analysis diagram of potential targets

2.7 分子對接結果

根據表1 所示槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、7-O-methylisomucronulatol、常春藤皂苷元、山柰酚、柳杉酚、刺芒柄花素、異鼠李素和黃芩素前10 個化合物分別與前5 個核心靶點進行分子對接，見圖8，結合能均小于－6.5 kcal·mol－1，表明藥物成分與靶蛋白結合穩定，對接活性較強。其中圖9A為MOL008583 與 TP53、圖9B 為 MOL000449 與EGFR、圖9C 為MOL005460 與IL-6、圖9D 為MOL008583與AKT1、圖9E為MOL000098與TNF、圖9F 為MOL000296 與AKT1。其 中MOL000296與AKT1結合力最強，為－10.3 kcal·mol－1，見圖9F。圖9 圖左為整體視圖，右為局部視圖，圖中淺橙色stick 為小分子，淺青色cartoon 為蛋白，灰色虛線表示疏水作用，圖中可見其主要與蛋白周圍K268、W80、L264、V270、T82、I84、Y272 和R273 氨基酸殘基發生疏水作用。

圖7 潛在靶點的GO 富集分析圖Fig.7 GO enrichment analysis diagram of potential targets

圖8 分子對接結合能熱圖Fig.8 Heat map of molecular docking binding energy

圖9 核心成分和核心靶點分子對接結合能最佳結果示意圖Fig.9 Schematic diagram of optimal binding energy results of core components and core target molecules

表1 藥物主要活性成分Tab.1 Main active ingredients of drugs

2.8 細胞實驗結果

2.8.1 各組雪旺細胞存活率 與對照組比較，高糖模型組雪旺細胞存活率明顯降低（P<0.05）；與高糖模型組比較，TLTT 組雪旺細胞存活率明顯升高（P<0.05）；彌可保組與TLTT 組雪旺細胞存活率比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組雪旺細胞活性和存活率Tab.2 Activities and survival rates of Schwann cells in various groups （n=10,±s）

表2 各組雪旺細胞活性和存活率Tab.2 Activities and survival rates of Schwann cells in various groups （n=10,±s）

*P<0.05vscontrol group；ΔP<0.05vshigh glucose model group.

Group Control High glucose model TLTT MKB Activity 0.99±0.02 0.66±0.02*0.82±0.01Δ 0.74±0.03 Survival rate(η/%)100.00±0.00 67.23±0.04 83.01±0.02 74.92±0.01

2.8.2 各組雪旺細胞中AKT1 和TP53 蛋白表達水平 與對照組比較，高糖模型組AKT1 蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），TP53 蛋白表達水平明顯升高（P<0.05）；與高糖模型組比較，TLTT 組AKT1 蛋白表達水平明顯升高（P<0.05），TP53 蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）；TLTT 組與彌可保組雪旺細胞中AKT1 和TP53 蛋白表達水 平比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖10。

圖10 各組雪旺細胞中AKT1 和TP53 蛋白表達電泳圖(A)和直條圖(B)Fig.10 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of AKT1 and TP53 proteins in Schwann cells in various groups

3 討 論

DPN 是糖尿病常見并發癥之一，主要累及感覺神經和運動神經，產生感覺及運動障礙，主要表現為雙側肢體疼痛、麻木和感覺異常等，嚴重者最終選擇截肢［12］。2021 年12 月6 日，國際糖尿病聯盟（international diabetes federation，IDF）官網發布了2021 年全球糖尿病地圖，數據顯示：2011—2021 年間中國糖尿病患者由0.9 億增加至1.4 億例，增幅達56%，其中約7 283 萬例糖尿病患者尚未被確診，另有約1.7 億成人伴有糖耐量受損，約2 700 萬名成人伴有空腹血糖受損。由于糖尿病的發病率迅速上升且病程逐步延長，糖尿病慢性并發癥的發病率逐年升高［13］。DPN 不僅危害人們的健康，還給社會經濟帶來沉重的負擔，美國2001 年數據調查顯示其1 年內DPN 直接醫療費用為1 760 億美元，高達 27%的糖尿病直接醫療費用歸因于 DPN［14］，給社會醫療體系和經濟發展增添較大負擔。因此，DPN 的防治工作意義重大。目前DPN 的治療手段以控制血糖、飲食及生活方式干預、手術及對癥治療和病因治療為主。強化血糖控制對1 型糖尿病周圍神經病變患者有明顯益處，但對于2 型糖尿病周圍神經病變患者效果并不明顯［15-16］。飲食及生活方式干預可有效預防 DPN，在糖耐量異常（impaired glucose tolerance，IGT）受試者中可增加表皮內神經纖維密度，改善神經性疼痛，但多數患者依從性較差，難以堅持［17］。手術松解腓總神經、腓深神經和脛神經對改善患者生活質量、降低糖尿病足及截肢發生率有所幫助，但并不是所有DPN 患者均適用，對于肢端對稱性感覺障礙和血糖波動引起的急性痛性糖尿病神經病變手術治療不能獲益，且該方法為有創操作，故未能被推薦于臨床應用［18］。對癥止痛藥和抗抑郁藥物對 DPN 患者的臨床癥狀有益，但此類藥物不良反應較大，并且不會延緩神經病變的發展［19］。

雖然DPN 在中醫學沒有具體的病名，但根據DPN 臨床表現，通常將其歸屬于中醫學“痿證”“血痹”等范疇［20］，其病機主要與病程日久所致陰陽氣血虧虛、血行瘀滯和脈絡痹阻等有關，臨床可將DPN 分為氣虛血瘀和陽虛寒凝等證型［21］，與西醫的單一效果比較，中藥具有整體調節、多靶點和多途徑等特點，采用中醫藥治療DPN 療效顯著。本院謝春光教授總結前人經驗并經過長期臨床工作反復實踐調整，研制出了具有益氣活血、養陰潤燥、開玄通絡、祛瘀止痛和標本兼治的TLTT。該方組方包含生黃芪、水蛭、當歸、玄參、川牛膝、地骨皮、赤芍和蠶砂等藥物，作為臨床制劑使用近30 年，前期臨床研究顯示出穩定的療效。既往研究［22］證實：TLTT 可以降低患者血糖，調節血脂異常，改善感覺、運動神經傳導速度和改善糖尿病患者感覺障礙和痛覺過敏等癥狀，能夠改善DPN炎癥狀態。同時，還可以改善DPN 大鼠糖脂代謝、神經傳導速度和降低血清炎癥因子水平，能一定程度下調c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和 磷 酸 化JNK （phosphorylated JNK，p-JNK）mRNA，抑制 JNK 信號通路的激活，改善高糖誘導的雪旺細胞凋亡從而治療DPN［23-25］。

本研究采用網絡藥理學預測TLTT 治療DPN的可能作用機制，結果顯示：槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、常春藤皂苷元、芒柄花素和異鼠李素是TLTT 治療DPN 的主要化合物。現代研究［26-27］結果表明：谷甾醇和豆甾醇等植物類甾醇具有降低膽固醇、抗糖尿病及鎮痛作用，能延緩2 型糖尿病的發病進程。槲皮素是一種具有降血脂、抗糖尿病并發癥作用的黃酮類化合物，研究［28］顯示：在糖尿病大鼠模型實驗中，槲皮素對糖尿病周圍神經病變具有較強的治療作用。山奈酚作為一種類黃酮化合物，具有改善胰島素抵抗和保護胰島β 細胞功能的作用，山奈酚通過不同干預途徑均對糖尿病并發癥有一定的保護作用［29］。常春藤皂苷元是一種五環三萜類化合物，其質量分數達70% 以上的續斷皂苷元可明顯抑制α-糖苷酶活性［30］。芒柄花素屬于異黃酮類化合物，長期使用芒柄花素能改善高血糖，增加神經組織中Sirtuin 蛋白和神經生長因子的表達，從而減輕熱痛覺，提高神經傳導速度，進而保護神經元［31］。異鼠李素是槲皮素的直接代謝物，對熱痛覺具有明顯鎮痛效果［32］。但山奈酚和常春藤皂苷元對DPN 是否具有確切治療作用尚需進一步研究。

對TLTT 與DPN 的共同靶點進行 PPI 映射，出現頻次較高的關鍵靶點有26 個，前10 位分別為AKT1、TNF、TP53、EGFR、IL-6、VEGFA、JUN、CTNNB1、CASP3 和GADPH，可作為潛在治療靶點。AKT1 是AKT 激酶之一，能夠調節細胞存活、增殖、代謝和血管生成，具有誘導葡萄糖轉運的功能，具有調節葡萄糖的攝取，調控糖尿病及并發癥的作用。TP53 是一種抑癌蛋白和轉錄因子，在調節神經細胞凋亡相關基因中的平衡方面起重要作用，是調節細胞凋亡的核心，脂肪細胞和胰腺β 細胞的老化與TP53 有很強的關聯性，其嚴重影響胰島素分泌功能、胰島素抵抗和葡萄糖穩態。

本研究中代謝通路富集分析表明：關鍵靶點富集在癌癥通路、脂質和動脈粥樣硬化、PI3K/Akt信號通路、晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體信號通路和MAPK 等通路。本研究發現26 個核心靶點中有10 個基因（AKT1、FN1、IL-1B、IL-6、JUN、MAPK1、MAPK8、PIK3CA、TNF和VEGFA）富集在晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體（AGE-RAGE）信號通路上。研究［33］顯示：AGEs 與RAGE 結合造成神經病變是因血腦屏障被損傷，使毒性物質更多地通過，最終損害神經。從分子對接結果可知，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、7-O-甲基異芥糖醇、常春藤皂苷元、山柰酚、柳杉酚、刺芒柄花素、異鼠李素和黃芩素分別與AKT1、TP53、TNF、EGFR 和IL-6 結合能均小于－6.5 kcal·mol－1。本研究結果顯示：TLTT能提高雪旺細胞存活率，具有上調AKT1 和下調TP53 的作用。

綜上所述，本研究初步探索了TLTT 治療DPN 的作用機制和物質基礎，后續研究可針對本研究篩選的信號通路進行深入探索，進一步拓展TLTT 治療DPN 的機制研究。本研究還存在以下不足之處：①藥物成分和對應靶點來源于有限的數據庫，未知成分有待深入研究；②中藥復方雖由單味藥物構成，但由于多味藥物煎煮生成的最終化學成分與單味藥物的有效成分并不完全相同，因此復方最終的成分與網絡藥理分析成分必然存在一定差異；③中藥真正發揮效應的根本是藥物在血中發揮作用的成分，主要涉及藥物在體內的藥代動力學和藥物血清化學，因此以動物和藥物為對象進行網絡藥理研究，得出的結果與臨床患者數據存在一定的偏差。