羅格列酮對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡的抑制作用及其機(jī)制

楊巧玲, 符 璐, 石 雨, 葉嚴(yán)玨, 盧日峰, 劉 永, 尹 俐

（1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院生物制藥系，重慶 400054；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶 400037；3.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，吉林 長春 130021）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種以腎功能迅速下降甚至喪失為特征的腎臟疾病，也是導(dǎo)致急慢性腎衰竭最常見的原因［1-2］。AKI 發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈不斷上升趨勢(shì)，2012—2020 年每年的死亡人數(shù)超過200 萬［3-4］。膿毒癥以全身炎癥、長期宿主免疫抑制和多器官功能障礙為特征，導(dǎo)致近一半膿毒癥住院患者發(fā)生AKI［5］，但膿毒癥引發(fā)AKI 的分子機(jī)制尚未完全闡明。鐵死亡是細(xì)胞程序性死亡的一種模式，被認(rèn)為在膿毒癥引發(fā)的AKI 中發(fā)揮重要作用［6-8］。長鏈脂酰CoA 合成 酶 4 （acyl CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）是一種將脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪酰輔酶A 酯的酶，調(diào)節(jié)脂質(zhì)生物合成，參與鐵死亡的發(fā)生發(fā)展過程［9］。上述研究提示ACSL4 可能在AKI 發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，但ACSL4 在膿毒癥引發(fā)的AKI 鐵死亡方面的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究以C57BL/6 小鼠為研究對(duì)象，探討ACSL4 抑制劑羅格列酮抑制腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡的潛在機(jī)制，為ACSL4 抑制劑Rosi 應(yīng)用于AKI的防治提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器18 只8 周齡雄性C57BL/6 小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK （渝）-2017-0010，體質(zhì)量20～25 g，在22 ℃恒溫動(dòng)物室中飼養(yǎng)，光照/黑暗周期為12 h，食物和水可以自由獲得。SYBR Green qPCR Master Mix （No ROX）（生產(chǎn)批號(hào)：HY-K0523）和RT Master Mix for qPCR（生產(chǎn)批號(hào)：HY-K0510）試劑盒均購自美國MCE 生物科技公司，ACSL4 抗體（生產(chǎn)批號(hào)：ab155282）購自美國Abcam 公司，谷胱甘肽過氧化物酶4 （glutathione peroxidase 4，GPX4）抗體（生產(chǎn)批號(hào)：381958）和溶質(zhì)載體家族7 成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）抗體（生產(chǎn)批號(hào)：382036）均購自成都正能生物技術(shù)有 限 責(zé) 任 公 司，β-actin 抗 體（生 產(chǎn) 批 號(hào)：AF0003）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔（生產(chǎn)批號(hào)：A0208）和山羊抗小鼠二抗（生產(chǎn)批號(hào)：A0216）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，ACSL4、GPX4、SLC7A11 和β-actin 引 物 序 列 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，羅格列酮（生產(chǎn)批號(hào)：302543-62-0）購自美國阿拉丁工業(yè)公司，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購自美國Sigma Aldrich 公司，肌酐（creatinine，CRE）（生產(chǎn)批號(hào)：C011-2-1）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）（生產(chǎn)批號(hào)：C013-2-1）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，SYBR Green qPCR Master Mix（No ROX）（美國Promega 公司）。全自動(dòng)數(shù)字病理切片掃描儀購自寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）儀購自瑞士Roche 公司，F(xiàn)luor Chem HD2 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國 Protein Simple 公司，全波長多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，JEM-1400PLUS 透射電鏡購自日本電子株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥18 只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS 組和LPS+ 羅格列酮組，每組6 只。LPS 組和LPS+羅格列酮組小鼠均腹腔注射10 mg·kg－1LPS，LPS+ 羅 格 列 酮 組 小 鼠 提 前30 min 尾靜脈注射0.5 mg·kg－1羅格列酮，對(duì)照組小鼠注射與LPS 組小鼠同體積的生理鹽水。24 h 后處死小鼠，收集腎組織和血液進(jìn)一步分析。

1.3 RT-qPCR 法檢測(cè)各組小鼠腎組織中 GPX4、SLC7A11、ACSL4、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA 表達(dá)水平從小鼠腎組織皮質(zhì)部分提取總RNA，RNA 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照RT Master Mix for qPCR 試劑盒說明書所示。逆轉(zhuǎn)錄完成后得到cDNA 采用RT-qPCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，RT-qPCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見SYBR Green qPCR Master Mix （No ROX）試劑盒說明書，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

1.4 Western blotting 法檢測(cè)各組小鼠腎組織中GPX4、SLC7A11 和ACSL4 蛋白表達(dá)水平取各組小鼠腎組織皮質(zhì)部分加入RIPA 裂解液用低溫勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，4 ℃裂解30～60 min 后BCA 法測(cè)定蛋白濃度。然后行SDS-PAGE 凝膠電泳，之后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。將膜封閉在5%脫脂奶粉中，并在4 ℃下分別與ACSL4、GPX4、SLC7A11 和β-actin抗體孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次5 min，在二抗中孵育1 h，TBST 漂洗后加入ECL 發(fā)光液，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯現(xiàn)印跡。Image J 軟件進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。目標(biāo)蛋白表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.5 HE 染色觀察各組小鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)石蠟切片（4 μm）放置60 ℃烘箱中烤1 h，脫蠟至水。蘇木素中染色2～3 min，自 來 水 沖 洗1 min，0.6% 鹽酸酒精分化液分化30 s，自來水15 min，氨水1 min 返藍(lán)。再用1%醇溶性伊紅溶液染色1 min，依次放至梯度濃度乙醇（80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇和100%乙醇）中各2 min，二甲苯Ⅰ 10 min，二甲苯Ⅱ 10 min，中性樹脂封片。全自動(dòng)數(shù)字病理切片掃描儀觀察各組小鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)。在光鏡下對(duì)每張切片取10 個(gè)皮髓交接區(qū)腎小管視野進(jìn)行損傷評(píng)分，對(duì)每個(gè)組小鼠損傷評(píng)分取平均值。急性損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)腎小管上皮細(xì)胞壞死、管型形成和腎小管擴(kuò)張占腎小管總數(shù)的百分率進(jìn)行評(píng)價(jià)。0 分，無損傷；1 分，損傷≤10%；2 分，損傷介于11%～25%；3 分，損傷介于26%～45%；4 分，損傷介于46%～75%；5 分，損傷>76%。

1.6 分光光度法檢測(cè)各組小鼠血清中CRE 和BUN水平小鼠安樂死后，用滅菌尖鑷眼球取血，血 樣 室 溫 靜 置30 min，3 000 r·min－1離 心15 min，取上清后按照南京建成生物工程研究所CRE 和BUN 測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，紫外分光光度計(jì)在波長546 和640 nm 處檢測(cè)吸光度（A）值，然后通過公式計(jì)算各組小鼠血清中CRE 和BUN 水平。CRE 水平（μmol·L－1）=（測(cè)定組ΔA 值－空白組ΔA 值）/（標(biāo)準(zhǔn)組ΔA 值－空白組ΔA 值）×標(biāo)準(zhǔn)組C 值。BUN 水平（mmol·L－1）=（測(cè)定組ΔA 值－空白組ΔA 值）/（標(biāo)準(zhǔn)組ΔA 值－空白組ΔA 值）×標(biāo)準(zhǔn)組C 值×樣本稀釋倍數(shù)。

1.7 透射電鏡觀察各組小鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)形態(tài)表現(xiàn)小鼠安樂死后取腎組織皮質(zhì)部分放至EP 管中，輕柔地加入1 mL 電鏡液（2.5%戊二醛固定液），4 ℃過夜，然后用磷酸緩沖液漂洗3 次，每次10 min，再用1%鋨酸固定液固定2 h，磷酸緩沖液繼續(xù)漂洗3 次，梯度丙酮脫水，丙酮/包埋劑滲透，純包埋劑包埋后進(jìn)行超薄切片，染色干燥后透射電鏡觀察。電鏡樣品檢測(cè)由陸軍軍醫(yī)大學(xué)電子顯微中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠腎組織中腎小管損傷評(píng)分，血清中CRE 和BUN 水平，腎組織中GPX4、SLC7A11 和ACSL4 mRNA 及蛋白表達(dá)水平，IL-6、IL-1β 和TNF-α mRNA 水 平 均 符 合 正 態(tài) 分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠腎臟病理形態(tài)表現(xiàn)及血清中CRE 和BUN 水平腎臟組織HE 染色結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)完整，排列整齊；LPS 組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)破壞，腎小管管腔內(nèi)出現(xiàn)明顯空泡結(jié)構(gòu)；與LPS 組比較，LPS+羅格列酮組小鼠腎組織中管腔內(nèi)基本無空泡結(jié)構(gòu)，見圖1。與對(duì)照組比較，LPS 組小鼠腎小管損傷評(píng)分明顯升高（P<0.01）；與LPS 組比較，LPS+羅格列酮組小鼠腎小管損傷評(píng)分明顯降低（P<0.01），見圖2。與對(duì)照組比較，LPS 組小鼠血清中CRE 和BUN 水平明顯升高（P<0.01）；與LPS 組比較，LPS+羅格列酮組小鼠血清中CRE 和BUN 水平明顯降低（P<0.01），見表2。

表2 各組小鼠血清中CRE 和BUN 水平Tab.2 Levels of serum CRE and BUN of mice in various groups (n=6，±s）

表2 各組小鼠血清中CRE 和BUN 水平Tab.2 Levels of serum CRE and BUN of mice in various groups (n=6，±s）

*P<0.01vscontrol group；△P<0.01vsLPS group.

Group Control LPS LPS+rosiglitazone BUN[cB/(mmol·L－1)]7.42±1.02 21.01±2.13*13.00±1.74△CRE[cB/(μmol·L－1)]15.13±2.61 32.66±6.28*22.83±4.17△

圖1 HE 染色觀察各組小鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)Fig.1 Pathomorphology of kidney tissue of mice in various groups observed by HE staining

圖2 各組小鼠腎小管損傷評(píng)分Fig.2 Injury scores of renal tubular of mice in various groups

2.2 各組小鼠腎組織中線粒體形態(tài)及鐵死亡標(biāo)志分子GPX4 和SLC7A11 mRNA 及蛋白表達(dá)水平透射電鏡觀察結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠腎小管上皮細(xì)胞線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴清晰；LPS 組小鼠腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)線粒體體積縮小、膜密度增加和線粒體嵴減少等鐵死亡典型特征；與LPS 組比較，LPS+羅格列酮組小鼠腎小管上皮細(xì)胞線粒體體積和嵴消失等形態(tài)改變明顯改善，見圖3。與對(duì)照組比較，LPS 組小鼠腎組織中GPX4 和SLC7A11 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）；與LPS 組比較，LPS+羅格列酮組小鼠腎組織中GPX4 和SLC7A11 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）。見圖4 和5。

圖3 各組小鼠腎組織中線粒體形態(tài)表現(xiàn)Fig.3 Morphology of mitochondrion in kidney tissue of mice in various groups

圖4 各組小鼠腎組織中SLC7A11 和 GPX4 mRNA 表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of SLC7A11 and GPX4 mRNA in kidney tissue of mice in various groups

圖5 各組小鼠腎組織中SLC7A11 和GPX4 蛋白表達(dá)電泳圖（A)和直條圖（B,C)Fig.5 Electrophoregram(A) and histograms(B,C) of expressions of SLC7A11 and GPX4 proteins in kidney tissue of mice in various groups

2.3 各組小鼠腎組織中ACSL4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，LPS 組小鼠腎組織中ACSL4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）；與LPS 組比較，LPS+羅格列酮組小鼠腎組織中ACSL4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）。見圖6。

圖6 各組小鼠腎組織中ACSL4 蛋白表達(dá)電泳圖（A)和ACSL4 蛋白（B)及mRNA(C)表達(dá)直條圖Fig.6 Electrophoregram(A) expression of ACSL4 protein(B) and histograms of expressions of ACSL4 protein(B)and mRNA(C) in kidney tissue of mice in various groups

2.4 各組小鼠腎組織中IL-6、IL-1β 和TNF-αmRNA 表達(dá)水平與對(duì)照組比較，LPS 組小鼠腎組織中 IL-6、IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）；與LPS 組比較，LPS+羅格列酮組小鼠腎組織中IL-6、IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）。見圖7。

圖7 各組小鼠腎組織中IL-1β、IL-6 和 TNF-α mRNA 表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of IL-1β, IL-6, and TNF-α mRNA in kidney tissue of mice in various groups

3 討 論

AKI 主要表現(xiàn)為腎功能在數(shù)天至數(shù)周內(nèi)急劇下降，在住院患者中AKI 發(fā)生率及病死率較高，已成為世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題［10-11］。由LPS 引起的膿毒癥是AKI 的常見病因，目前尚無理想的防治手段［12-13］。氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、自噬及炎癥等均參與AKI 的發(fā)生發(fā)展過程［14-15］。鐵死亡是由細(xì)胞膜中含多不飽和脂肪酸磷脂（poly-unsaturated fatty acids-containing phospholipids，PUFA-PLs）的鐵依賴性的過氧化引發(fā)的一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡。近年來，研究［16-17］表明：鐵死亡在AKI 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。但是目前關(guān)于鐵死亡在膿毒癥引發(fā)的AKI 作用機(jī)制的研究較少，因此本研究采用LPS 構(gòu)建膿毒癥引發(fā)的AKI 小鼠模型，并從鐵死亡特征和標(biāo)志分子GPX4 及SLC7A11 角度探討鐵死亡在AKI 中的作用機(jī)制，對(duì)于AKI 的防治具有重要意義。

ACSL4 是調(diào)控機(jī)體內(nèi)脂肪代謝關(guān)鍵酶ACSLs家族中的一員。ACSLs 家族包括ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5 和 ACSL6，主要負(fù)責(zé)將12～20 個(gè)碳鏈長度的脂肪酸、三磷酸腺苷和輔酶A 催化形成長鏈酰基輔酶 A［18-19］。ACSL4 能將花生四烯酸和腎上腺酸催化合成花生四烯酰CoA和腎上腺酰CoA，以使其參與膜磷脂的合成［20］。細(xì)胞膜上的長鏈多不飽和脂肪酸（二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸等）常被氧化，從而引 發(fā) 細(xì) 胞 的 鐵 死 亡［21-22］。徐 碩 等［23］研 究 表 明：ACSL4 敲除/過表達(dá)可以減少/增加細(xì)胞脂質(zhì)氧化物生成從而調(diào)控鐵死亡。敲除ACSL4 可以抑制鐵死亡而減輕腎臟缺血再灌注誘導(dǎo)的腎臟損傷［24］。本研究中，小鼠腹腔注射LPS 誘導(dǎo)AKI 后，鐵死亡標(biāo)志分子GPX4 和SLC7A11 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯降低，而ACSL4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明在LPS 模擬的膿毒癥誘導(dǎo)的AKI鐵死亡中，ACSL4 也具有調(diào)控鐵死亡從而保護(hù)腎臟免受LPS 損傷的潛在作用。

鑒于鐵死亡在AKI 中重要的調(diào)控作用，大量研究采用鐵死亡抑制劑來減輕AKI［25-27］。鐵死亡抑制劑種類較多，包括：① 以脂質(zhì)過氧化為靶點(diǎn)的ferrostatin-1、帕立骨化醇和維生素 E 等；② 以GPX4 為靶點(diǎn)的硒和多巴胺；③ 以鐵離子為靶點(diǎn)的去鐵胺等；④ 以Xc－系統(tǒng)（胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體）為靶點(diǎn)的環(huán)己酰亞胺和肝再生增強(qiáng)因子；⑤ 以ACSL4 為靶點(diǎn)的噻唑烷二酮類［25］。在缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的AKI 小鼠模型中，ferrostatin-1 可保護(hù)小鼠免受功能性急性腎衰竭［26］。帕立骨化醇能夠通過降低膜脂質(zhì)過氧化抑制鐵死亡而在功能和組織學(xué)上減輕順鉑誘導(dǎo)的AKI［27］。羅格列酮屬于噻唑烷二酮類，能減輕各種因素誘導(dǎo)的腎損傷［28-30］。谷名曉等［31］研究顯示：在慶大霉素誘導(dǎo)的大鼠急性腎損害模型中，給予羅格列酮灌胃的大鼠腎小管壞死程度、上皮細(xì)胞空泡變性程度和間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤程度較慶大霉素組輕。魏嘯等［32］研究顯示：羅格列酮預(yù)處理可以拮抗 LPS 激活過氧化物酶體增殖物激活受體 γ （peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ）介 導(dǎo) 的腎臟炎癥反應(yīng)從而減輕小鼠急性腎損傷。本研究從鐵死亡角度出發(fā)，發(fā)現(xiàn)鐵死亡分子ACSL4 在LPS誘導(dǎo)的AKI 中具有潛在的調(diào)控作用，進(jìn)一步選用以ACSL4 作為靶點(diǎn)的鐵死亡抑制劑噻唑烷二酮類藥物羅格列酮，結(jié)果顯示：羅格列酮能夠明顯改善LPS 誘導(dǎo)的AKI 小鼠中腎臟組織損傷、腎功能、鐵死亡和炎癥水平。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了羅格列酮能減輕LPS 誘導(dǎo)的腎損傷，但機(jī)制較前期研究［32］發(fā)現(xiàn)的羅格列酮以PPAR-γ 作為靶點(diǎn)有所不同，結(jié)果顯示：羅格列酮改善LPS 誘導(dǎo)的急性腎損傷時(shí)以鐵死亡調(diào)控分子ACSL4 作為靶點(diǎn)發(fā)揮作用。

綜上所述，羅格列酮可以ACSL4 為靶點(diǎn)減輕LPS 所致小鼠急性腎損傷，其保護(hù)機(jī)制可能是通過抑制 ACSL4 介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡而發(fā)揮作用。ACSL4 抑制劑羅格列酮可作為潛在藥物用于防治細(xì)菌LPS 所致膿毒癥誘發(fā)的AKI。