鹿茸多肽預處理通過miR-133a 調控TGF-β/Smad 信號通路對TBHP 誘導心肌H9c2 細胞損傷的保護作用

周高峰, 肖 靜,2, 周 佳, 劉俊秀, 律廣富, 王雨辰, 林 賀, 黃曉巍

（1.長春中醫藥大學藥學院臨床藥學與中藥藥理教研室，吉林 長春 130117；2.中國醫學科學院藥用植物研究所，北京 100094；3.長春中醫藥大學 吉林省人參研究科學院中藥藥理組，吉林 長春 130117）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）在心血管疾病中死亡率較高，死亡人數近年來迅速增加，并傾向于在年輕個體中較多發生，且預后較差，給患者和社會均帶來沉重負擔［1］。鹿茸為鹿科動物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，是哺乳動物中唯一具有完全再生能力的附屬器官［2］。心肌梗死后再灌注治療也會導致炎癥和氧化應激等一系列的病理生理反應，進而導致細胞凋亡及壞死。慢性心肌梗死后會發生持續性的細胞凋亡及心室重構和心肌纖維化，最終導致心力衰竭［3］。心肌梗死及再灌注損傷仍是臨床難題，中藥及其提取物在保護心臟、防止心肌細胞凋亡及纖維化等方面具有良好的療效［4］。《本草綱目》記載：“鹿茸能生精補髓，養血益陽，強筋健骨，治一切虛損，耳聾，目暗，眩暈，虛痢”。鹿茸多肽（velvet antler polypeptide，VAP）對大鼠循環、免疫、運動和神經系統具有改善和治療作用，并對心肌缺血損傷、心肌梗死、心肌缺血再灌注和冠心病心絞痛具 有 保 護 作 用［5-6］。VAP 通 過 調 控Notch 通 路 和 蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（protein kinase B/mammalian target of rapamycin，Akt/mTOR）信號通路調控內皮祖細胞增殖和遷移保護心臟微血管［7］；VAP 能明顯降低阿霉素誘導的心肌細胞損傷模型中轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）蛋白表達水平，減少心肌細胞凋亡，保護心肌組織［8］；通過調節心肌特異性 轉 錄 因 子 Nkx2.5 和 GATA 結 合 蛋 白 4（transcription factor GATA4，GATA4）的表達緩解阿霉素所致的心肌細胞損傷［9］。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類由內源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子。miR-133是一種肌源性miRNA，可通過降低TGF-β1表達保護心肌細胞，在正常的心肌細胞中表達豐富，具有調節心肌細胞肥大和心肌細胞分化發育的功能，其表達與多種心臟疾病密切相關［10-11］。李敏［12］研究表明：穩心中藥可提高血清球蛋白水平，降低血清心肌酶水平，增加miR-133 表達水平發揮強心作用。YU 等［13］研究發現：蘆薈大黃素可通過上調miR-133 表達水平來減輕心肌梗死和心肌細胞凋亡。同時，miR-133 可調控TGF-β/Smads、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和 磷 脂 酰 肌 醇 3-激 酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/Akt 等 多 條 通路改善心肌細胞能量代謝，修復受損心肌［14］。本課題組前期動物實驗研究［15］表明：VAP 可通過TGF-β/Smads 信號通路改善大鼠冠狀動脈左前降支結扎誘導的心肌梗死后缺血損傷及纖維化損傷，改善心肌組織病理狀態，減少心肌細胞凋亡。本研究通過采用叔丁基過氧化氫 （tert-butyl hydroperoxide，TBHP）誘 導 大 鼠 心 肌H9c2 細 胞損傷，探討VAP 含藥血清對心肌細胞的保護作用，闡明VAP 對miR-133/TGF-β/Smad 軸的作用機制，為研究VAP 對心肌細胞損傷的修復作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、藥物、主要試劑和儀器SPF級Wistar 雄性大鼠21 只，體質量（180±20）g，購自長春市億斯實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（吉）-2020-0002。VAP（長春中醫藥大學藥學院制備，每1 g VAP 約含生藥28.9 g，批號：20201120）。大鼠H9c2 細胞（中國科學院上海細胞庫，批號：3111C0001CCC000219）。青鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司，貨號：P1400），胎牛血清（中國CLARK Bioscience 公司，貨號：FB15015C），高糖DMEM 培養基（貨號：31053036）和胰蛋白酶-EDTA （0.25%）（批號：25200072）購自美國Gibco 公司，TBHP［西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，貨號：458139］，micrOFF gga-miR-133a-3p inhibitor（廣州銳博生物技術有限公司），二甲基亞砜和PBS 緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號：D8371、P1022），肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）和心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）酶聯免疫吸附 試 驗 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（江蘇酶免生物科技有限公司，貨號：MM-0625R1、MM-0795R1和MM-61550R1），PrimeScript? Ⅱ High Fidelity RT-PCR Kit 試 劑 盒（日本TaKaRa 技術有限公司，貨號：R023A50），RNAsimple Total RNA Kit 總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號：DP419），全蛋白提取試劑盒（貨號：p0033）和BCA 蛋白濃度測試試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：p0012s），TGF-β1 抗體、Smad4 抗體和p-Smad2/3抗體（北京索萊寶科技有限公司，貨號：21898-1-AP、10231-1-AP 和K009346P）。多功能微孔板酶標儀（型號：SUNERGY-HTX）和二氧化碳培養箱（型號：311）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，電泳儀和電泳槽（型號：BE6085）購自美國伯樂 Bio-Rad 公司，多道生理記錄儀（型號：ML22）購自埃德儀器國際貿易有限公司，倒置熒光顯微鏡（型號：CKX4）購自日本奧林巴斯公司。

1.2 VAP 含藥血清制備健康Wistar 大鼠21 只，隨機分為空白血清組、低劑量（100 mg·kg－1）VAP 組和 高劑量（400 mg·kg－1）VAP 組，均灌胃給藥，每天1 次，連續7 d。于第7 天灌胃2 h 后，腹主動脈 取 血，3 000 r·min－1離 心15 min，分 離 血 清，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后分裝，置于－80 ℃冰箱保存備用。

1.3 細胞培養與轉染大鼠H9c2 細胞生長于含10% 胎牛血清的DMEM 培養液中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的恒溫密閉培養箱中進行常規培養并傳代，0.25%胰蛋白酶消化，每3 d 消化傳代1 次。接種2×104個細胞至含有適量完全培養基的24 孔細胞培養板中。轉染：用30 μL 1×Buffer 稀釋1.25 μL 20 μmol·L－1miRNA inhibitor，輕 輕 混勻；加入3 μL CP Reagent，輕輕吹打混勻，室溫孵育0～15 min。將混合液加入到無雙抗完全培養基中，輕輕混勻；24 h 后進行加藥處理。

1.4 實驗分組將6 孔細胞培養板中培養24 h 的H9c2 細胞更換新培養液，每2 孔行不同的藥物處理。H9C2 細胞分為空白對照組、空白血清組、TBHP 組、TBHP+低劑量VAP 組、TBHP+高劑量VAP 組和miR-133 inhibitor 組；除空白對照組和TBHP 組外，其余各組細胞均給予VAP 20%含藥血清，miR-133 inhibitor 組細胞先轉染miR-133 inhibitor 后再給予VAP 含藥血清。

1.5 MTT 法檢測各組細胞存活率將H9c2 細胞分為空白對照組（無任何處理）、正常對照組（加入5%或10%或20%空白血清）、低劑量VAP 組（加入5% 或10% 或20% 低劑量VAP 含藥血清）和高劑量VAP 組（加入5%或10%或20%高劑量VAP 含藥血清）。藥物干預24 h 后，每孔加入15 μL 四甲基偶氮唑藍，孵育4 h 后，棄去上清液。每孔加入150 μL 二甲基亞砜，避光處振搖10 min，采用多功能微孔酶標儀測定490 nm 處的A 值。將H9c2 細胞分為6 組：空白對照組（無任何處理）、正常對照組（20%空白血清）、TBHP 組（20%空白血清+200 μmol·L－1TBHP）、低劑量VAP 含藥血 清組（20%低劑量VAP 含藥血清+200 μmol·L－1TBHP）、高劑量VAP 含藥血清組（20% 高劑量VAP 含 藥 血 清+200 μmol·L－1TBHP）、miR-133抑 制 劑 組（miR-133 inhibitor 24 h+400 mg·kg－1VAP 24 h+200 μmol·L－1TBHP）。藥物干預24 和48 h 后，按照上述實驗方法操作。細胞存活率=實驗孔平均A 值/對照孔平均A 值×100%。

1.6 ELISA 法檢測各組細胞培養上清液中cTnT、cTnI 和CK-MB 水平將H9c2 細胞接種于6 孔細胞培養板（每孔6×104個細胞）中培養24 h。收集細胞上清液，采用ELISA 法檢測各組細胞培養上清液中cTnT、cTnI 和CK-MB 水平，具體步驟參照試劑盒說明書進行。

1.7 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測各組細胞中miR-133 表達水平將H9c2 細胞接種于6 孔細胞培養板（每孔6×104個細胞）中培養24 h。實驗分組同“1.4”，收集細胞，TRIzol 法提取細胞中的總RNA，實驗步驟參照試劑盒說明書。應用紫外分光光度計檢測RNA 的濃度和純度，反轉錄合成cDNA，步驟參照cDNA 合成試劑盒，根據RT-qPCR 試劑盒檢測miR-133 表達水平，內參基因為GAPDH。反應總體積為20 μL，反應程序：94 ℃、15 s（變性）；58 ℃、15 s（退火），72 ℃、15 s（延伸），30個循環。miR-133a正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGGCAAAGTTACAGTGC-3′，反 向引 物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；GAPDH 正 向 引 物：5′-GCTVATTTGCAGGGGGGAG-3′，反 向 引 物：5′-GTTGGTGGTGCAGGAGGCA-3′。以GAPDH為內參對照，采用2－△△Ct法計算各組細胞中miR-133 表達水平。

1.8 Western blotting 法檢測各組細胞中TGF-β1、p-Smad2/3 和Smad4 蛋白表達水平將細胞接種于6 孔細胞培養板（每孔6×104個細胞）中培養24 h。細胞分組和處理見“1.4”。收集各組細胞，按照總蛋白提取試劑盒說明書提取各組總蛋白，采用BCA 定量，每孔上樣20 μL 蛋白，進行凝膠電泳，90 min 后轉膜至PVDF 膜上，奶粉封閉液封閉1 h，加入兔抗GAPDH、TGF-β1、p-Smad2/3 和Smad4 一抗，4 ℃孵育過夜，次日加入抗兔二抗，并在室溫搖床孵育2 h，按照高敏感度化學發光檢測試劑盒說明書滴加發光工作液顯色后，以GAPDH 為內參，采用Imageproplus 6.0 軟件進行灰度值分析。目的蛋白表達水平＝目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.9 統計學分析采用SPSS 21.0 統計軟件進行統計學分析。各組H9c2 細胞存活率，各組H9c2 細胞培養上清中cTnT、cTnI 和CK-MB 水平，各組H9c2 細 胞 中 miR-133 表 達 水 平 及 TGF-β1、p-Smad2/3 和Smad4 蛋白表達水平均符合正態分布且方差齊，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組細胞存活率與空白對照組比較，空白血清組細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)；與空白對照組比較，5%和10%VAP 含藥血清組細胞存活率明顯降低（P<0.05），故選取20%含藥血清濃度。TBHP 作用H9c2 細胞24 和48 h 后，與空白對照組比較，TBHP 組細胞存活率明顯降低(P<0.05)；與TBHP 組比較，低和高劑量VAP 組的細胞存活率明顯升高（P<0.05)，miR-133 inhibitor組的細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組H9c2 細胞存活率Tab.1 Survival rates of H9c2 cells in various groups (n=6，±s，η/%）

表1 各組H9c2 細胞存活率Tab.1 Survival rates of H9c2 cells in various groups (n=6，±s，η/%）

“－”：No data.*P<0.05vsblank control group；△P<0.05vsTBHP group.

Survival rate Group 20% serum containing drugs 100.00±0.00 104.50±3.13－82.08±3.51 86.89±4.46 66.73±3.75*48 h after treated with TBHP 100.00±0.00 95.44±3.74 45.90±3.09*64.35±2.47△76.90±5.22△49.69±2.99 24 h after treated with TBHP 100.00±0.00 105.00±3.34 61.55±3.64*83.08±2.73△94.14±3.68△63.86±3.75 5% serum containing drugs 100.00±0.00 95.03±6.91－63.53±2.11*68.34±4.41*51.68±2.40*10% serum containing drugs 100.00±0.00 98.80±1.96－75.20±2.73*75.28±3.18*55.42±3.75*Blank control Blank serum TBHP TBHP+ low dose of VAP TBHP+ high dose of VAP miR-133 inhibitor

2.2 各組細胞培養上清液中cTnT、cTnI 和CK-MB 水平與空白對照組比較，TBHP 組細胞培養上清液中cTnT、cTnI 和CK-MB 水平明顯升高（P<0.05）；與TBHP 組比較，TBHP+低劑量VAP 組和TBHP+高劑量VAP 組細胞培養上清液中cTnT、cTnI 和CK-MB 水平明顯降低（P<0.05 或P<0.01），miR-133 inhibitor 組細胞培養上清液中cTnT、cTnI 和CK-MB 水平差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組H9c2 細胞中cTnT、cTnI 和CK-MB 水平Tab.2 Levels of cTnT, cTnI, and CK-MB in H9c2 cells in various groups (n=6，±s）

表2 各組H9c2 細胞中cTnT、cTnI 和CK-MB 水平Tab.2 Levels of cTnT, cTnI, and CK-MB in H9c2 cells in various groups (n=6，±s）

*P<0.05vsblank control group；△P<0.05，△△P<0.01vsTBHP group.

Group Blank control Blank serum TBHP TBHP+ low dose of VAP TBHP+ high dose of VAP miR-133 inhibitor CK-MB[ρB/(μg·L－1)]11.27±1.98 11.33±1.37 25.21±3.06*19.87±2.25△△15.45±1.32△△22.72±1.34 cTnT[ρB/(pg·L－1)]15.27±2.46 16.56±1.97 25.76±3.29*19.34±3.69△17.66±3.26△△24.33±3.34 cTnI[ρB/(pg·L－1)]53.72±4.97 56.12±1.66 84.16±6.55*64.44±6.96△59.96±4.04△△75.66±8.20

2.3 各組H9c2 細胞中miR-133 表達水平與空白對照組比較，TBHP 組細胞中miR-133a 表達水平明顯降低（P<0.05）；與TBHP 組比較，TBHP+低劑量VAP 組和TBHP+高劑量VAP 組細胞中miR-133a 表達水平明顯升高（P<0.05 或P<0.01），miR-133 inhibitor 組 細 胞 中miR-133a 表 達水平明顯降低（P<0.01）。見表3。

表3 各組H9c2 細胞中miR-133 表達水平Tab.3 Expression levels of miR-133 in H9c2 cells in various groups (n=6，±s）

表3 各組H9c2 細胞中miR-133 表達水平Tab.3 Expression levels of miR-133 in H9c2 cells in various groups (n=6，±s）

*P<0.05vsblank control group；△P<0.05，△△P<0.01vsTBHP group.

Expression leve of miR-133a 1.00±0.00 0.97±0.14 0.40±0.06*0.66±0.13△0.89±0.15△△0.27±0.05△△Group Blank control Blank serum TBHP TBHP+ low dose of VAP TBHP+ high dose of VAP miR-133 inhibitor

2.4 各組 細 胞中TGF-β 1、p-Smad2/3 和Smad4蛋白表達水平與空白對照組比較，TBHP組細胞中TGF-β1、p-Smad2/3和Smad4 蛋白表達水平明顯升高（P<0.05）；與TBHP 組比較，TBHP+低和高 劑 量VAP 組 細 胞 中TGF- β1、p-Smad2/3 和Smad4 蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），miR-133a inhibitor 組細胞中上述指標差異無統計學意義（P>0.05）。見表4 和圖1。

圖1 各組H9c2 細胞中p-Smad2/3、TGF-β1 和Smad4 蛋白表達電泳圖（A,C）和直條圖（B,D)Fig.1 Electrophoregrams(A,C) and histograms(B,D) of expressions of p-Smad2/3,TGF-β 1,and Smad4 proteins in H9c2 cells in various groups

表4 各組H9c2 細胞中TGF-β1、p-Smad2/3 和Smad4 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of TGF-β1,p-Smad2/3,and Smad4 in H9c2 cells in various groups (n=6，±s）

表4 各組H9c2 細胞中TGF-β1、p-Smad2/3 和Smad4 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of TGF-β1,p-Smad2/3,and Smad4 in H9c2 cells in various groups (n=6，±s）

*P<0.05vsblank control group；△P<0.05vsTBHP group.

Group Blank control Blank serum TBHP TBHP+ low dose of VAP TBHP+ high dose of VAP miR-133 inhibitor Smad4 1.00±0.00 0.96±0.11 2.81±0.24*1.32±0.35△1.47±0.32△2.63±0.41 p-Smad2/3 1.00±0.00 1.03±0.12 4.31±0.34*2.14±0.35△2.83±0.32△3.92±0.41 TGF-β1 1.00±0.00 1.11±0.12 2.92±0.36*1.86±0.15△1.96±0.22△2.51±0.31

3 討 論

TBHP 可以損傷心肌細胞，是誘導心肌細胞氧化應激和凋亡的體外造模方法。本研究采用MTT法篩選出TBHP 制備H9c2 損傷模型的作用最佳時間（24 h）和 濃 度（200 μmol·L－1）；當TBHP 濃度 為200 μmol·L－1時，cTnT、cTnI 和CK-MB 大量釋放至細胞中，TGF-β1、p-Smad2/3 和Smad4蛋白表達水平及miR-133 表達水平發生明顯變化，提 示TBHP 濃 度 在200 μmol·L－1時 引 起H9c2 損 傷明顯；通過VAP 含藥血清干預后，能夠達到改善H9c2 造模后的損傷程度［16］。VAP 可明顯降低阿霉素誘導心肌損傷模型大鼠心肌組織中TGF-β1 蛋白表達水平，改善心肌損傷；可激活核因子E2 相關因子2/抗氧化反應元件（nuclear factor E2-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE）信號通路，促進下游人血紅素加氧酶1 （heme oxygenases-1，HO-1）表達，防止心肌缺血再灌注損傷［17-18］。前期研究［15］證明：VAP 可以改善冠狀動脈左前降支結扎誘導的大鼠心肌梗死后缺血損傷，降低血清中cTnT、cTnI 和CK-MB 水平，調控TGF- β/Samds 表 達 水 平，降 低Ⅰ型 膠 原（collagen Ⅰ，ColⅠ）和Ⅲ型膠原（collagen Ⅲ，ColⅢ）蛋白表達，改善心肌組織病理狀態，減少心肌細胞凋亡。本研究結果顯示：與TBHP 組比較，VAP 給藥組細胞中cTnT、cTnI 和CK-MB 水平明顯降低，miR-133a 表達水平升高，TGF-β1、p-Smad2/3 和Smad4 蛋白表達水平降低，miR-133 inhibitor 可以逆轉VAP 給藥組相應的改變。本研究結果表明：VAP 對心肌細胞具有保護作用，可能是通過miR-133a 調控TGF-β/Smads 信號通路發揮相應作用。TGF-β/Smads 信號通路是典型的纖維化通路，心肌細胞發生損傷后，激活其通路并磷酸化下游的Smad2 和Smad3 蛋白，與Smad4 蛋白結合后入細胞核發揮相應作用［15］。miR-133 在正常心肌細胞中表達豐富，有研究［19-20］表明：過表達miR-133 能改善心肌細胞纖維化損傷，而抑制miR-133 表達會使心肌纖維化損傷加重。本研究結果表明：VAP 能通過增加miR-133 表達水平改善心肌細胞損傷。研究［21-23］表明：miR-133 被抑制并伴有心肌損傷時TGF-β 水平升高導致上皮間質轉化，相反，miR-133 表達水平升高時會阻斷TGF-β 誘導的上皮間質轉化。本研究結果表明：VAP 能通過提高miR-133 的表達調控TGF-β/Smads 信號通路進而保護TBHP 誘導的H9c2 細胞損傷。

綜上所述，VAP 含藥血清預處理可以有效抑制TBHP 所致的H9c2 細胞損傷，其機制可能是通過升高H9c2 細胞中miR-133a 表達水平調節TGF-β/Samds 傳導通路進而發揮保護心肌細胞的作用。