沉默信息調節因子2 對大腸癌細胞有氧糖酵解和生長增殖的調控作用及其機制

岳金金, 龐一心, 張秀梅

（錦州醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室,遼寧 錦州 121001）

代謝重編程是腫瘤細胞的一個主要代謝特征，能更好地協調腫瘤細胞對葡萄糖的利用過程，也能對腫瘤細胞生理機能進行調節。越來越多的研究［1-2］表明：代謝重編程能夠維持腫瘤細胞惡性增殖的特征，目前針對腫瘤細胞的代謝研究已經成為腫瘤治療新的靶點。腫瘤細胞快速增殖的重要機制之一是磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP），而在生物大分子合成過程中PPP 的中間產物起重要作用。PPP 是糖酵解途徑的一個旁路，從糖酵解的中間產物葡糖6-磷酸開始進入PPP，經過一系列氧化和基團轉移代謝轉變產生2 個重要的中間產物：還原當量煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和5-磷酸核糖。對于增殖速度較快的細胞，尤其是腫瘤細胞，充足的NADPH 和5-磷酸核糖的供應是維持其生長繁殖所必需的。研究［3-4］表明：與正常細胞比較，卵巢癌和胰腺癌腫瘤細胞中葡糖6-磷酸進入磷酸戊糖途徑的流量有明顯升高，其主要機制是腫瘤細胞內葡糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）的表達或活性增加。因此，G6PD 可能與腫瘤的發生發展有密切關聯，其活性和定位受p21 激活激酶4（p21-activated kinase 4，PAK4）、p53、B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）相關基因3（Bcl-2 associated athanogene 3，BAG3）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和AMP 激 活 的蛋 白 激 酶［Adenosine 5′-monophosphate （AMP）-activated protein kinase，AMPK］等 直 接 調 控［5-7］。沉默信息調節因子（silent information regulator factor，SIRT）是一類由多個組蛋白去乙酰化酶成員組成的蛋白家族，SIRT 家族有7 個成員，包含SIRT1～SIRT7。SIRT 家族成員通過對組蛋白及多種非組蛋白進行去乙酰化修飾調節體內多種代謝途 徑［8-10］。SIRT2 是SIRT 家 族 的 一 員，研 究［11-13］表明：SIRT2 可有效抑制乳腺癌的發展，在惡性腫瘤的生長和侵襲轉移中發揮重要作用。但SIRT2在大腸癌中的作用目前還鮮有報道。本研究旨在探討SIRT2 對大腸癌細胞有氧糖酵解及生長增殖的影響，闡明其調控機制，從而為結腸癌的臨床治療提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞、臨床樣本、主要試劑和儀器

HCT116 和SW480 大腸癌細胞為本實驗室自有。大腸癌組織病理切片取自錦州醫科大學附屬第一醫院病理科大腸癌患者手術切除的標本，本研究已獲得錦州醫科大學基礎醫學院倫理委員會批準，所有患者均對本研究內容充分知情，并簽署知情同意書，均取癌組織和癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣>5 cm 處），所有病例均經病理診斷證實且術前未經放療和化療。細胞培養基和胎牛血清購自美國Gibco 公司，SIRT2 干擾RNA 購自蘇州吉瑪基因股份有限公司，葡萄糖氧化酶試劑盒購自Solarbio 公司，SIRT2、β-actin 和G6PD 抗體均購自英國Abcam 公司，CCK-8 試劑盒購自安諾倫（北京）生物科技有限公司，乳酸測試盒購自南京建成生物工程研究所，Clon Express Ultra One Step Cloning Kit 試劑盒購自日本 TaKaRa 公司，SIRT2 質粒購自武漢淼靈生物科技公司。凝膠成像儀和酶標儀購自美國 Bio-Rad 公司，CO2細胞培養箱購自美國Thermo 公司。

1.2 細胞培養、分組及轉染分別將HCT116 細胞和SW480 細胞接種在6 孔細胞培養板中，當細胞密度達到約70% 時進行轉染。HCT116 細胞轉染SIRT2-siRNA 進行干擾實驗，實驗分為陰性對照組、SIRT2-siRNA#1 組、SIRT2-siRNA#2 組、和SIRT2-siRNA#3 組；4 組小干擾RNA 序列分別為SIRT2-siRNA#1：5′-GGACGAGCUGACCUUGGAATTUUCCAAGGUCAGCUCGU C C T T-3′，SIRT2-siRNA#2：5′-CCACCGGCCUCUAUGACAATTUUGUCAUAGAGGCCGGUG G T T-3′，SIRT2-siRNA#3：5′-CCAUCUGUCACUACUUCAUTTAUGAAGUAGUGACAGAUG G T T-3′，陰 性 對 照 組：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。采用SW480 細胞進行過表達實驗，實驗分為空白組、空載體質粒轉染組和SIRT2 質粒轉染組。將SIRT2-siRNA#3 與G6PD 質粒均減半后混勻共轉染進行回復實驗，回復實驗對照組是將陰性對照與空載體質粒均減半后混勻共轉染進行實驗。在轉染后進行計時，6 h 后換液，將6 孔細胞培養板中液體吸出，更換為完全培養液進行培養。

1.3 Western blotting 法檢測大腸癌細胞中SIRT2和G6PD 蛋白表達水平轉染48 h 后，分別收取SIRT2 質粒轉染組和SIRT2-siRNA 干擾組的細胞。在6 孔細胞培養板內每孔加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑共100 μL，細胞刮刀直接刮取，提取細胞總蛋白。采用BCA 蛋白質濃度檢測法檢測蛋白濃度，將蛋白樣品濃度定量至20 μg；恒壓90 V 進行SDS-PAGE 電泳后，21 V、20 min 半干轉至PVDF膜，封閉液為5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h，將膜洗滌后分別與SIRT2 抗體（稀釋濃度為1∶2 000）、G6PD 抗體（稀釋濃度為1∶1 000）和β-actin 抗體（稀釋濃度為1∶1 000）進行4 ℃孵育過夜，第2 天將PVDF 膜經洗滌后放進HRP 標記抗兔（稀釋濃度為1∶10 000）二抗溶液中，室溫進行孵育1 h，利用ECL 發光儀進行發光成像。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。

1.4 試劑盒檢測大腸癌細胞培養液中葡萄糖和乳酸水平轉染和分組過程同實驗步驟“1.2”，分別收集SIRT2 質粒轉染組和 SIRT2-siRNA 干擾組轉染后24 h 的培養液。按照葡萄糖檢測試劑盒說明書和乳酸檢測試劑盒說明書分別檢測培養液中的葡萄糖水平和乳酸水平。

1.5 CCK-8 實驗檢測各組大腸癌細胞增殖活性轉染和分組過程同實驗步驟“1.2”，將轉染24 h 后的細胞消化并進行細胞計數，將各組細胞濃度調整至每毫升4×104個細胞，各組取細胞懸液100 μL 接種于96 孔細胞培養板內，并設3 個復孔。將接種好的細胞放入培養箱中繼續培養1、2 和3 d，每日定時每孔加入CCK-8 試劑10 μL，37 ℃恒溫培養2 h 后酶標儀于450 nm 波長處測量各組的吸光度（A）值，以A 值代表細胞增殖活性。

1.6 克隆形成實驗檢測大腸癌細胞克隆形成率轉染和分組過程同實驗步驟“1.2”，將轉染24 h 后的細胞消化并進行細胞計數，各組分別取一定數量的細胞接種于6 孔細胞培養板內，37 ℃恒溫進行培養10～15 d，期間觀察細胞群落生長狀態，當單株細胞群落內含有一定數量的細胞時可停止培養并進行染色。細胞固定時，每孔加入4%多聚甲醛1 mL，1 h 后吸出多聚甲醛，加入結晶紫覆蓋住細胞染色1 h，去除染色液后進行克隆計數，計算克隆形成率。克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。

1.7 反轉錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）法檢測轉染SIRT2 后大腸癌細胞中G6PD mRNA表達水平轉染和分組過程同實驗步驟“1.2”，分別收取SIRT2 質粒轉染組和SIRT2-siRNA 干擾組轉染48 h 后的細胞，采用Trizol 法提取各組細胞的總RNA，按照RT-PCR 試劑盒的說明書進行RT-PCR 一步法反應，反應體系：模板RNA 0.5 μg，上游引物和下游引物（10 μmol·L－1）各2 μL，One Step Enzyme Mix 2.5 μL，2×One Step Mix 25 μL，最后加入RNase free ddH2O 使得反應總體系為50 μL。反應程序：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共25 次循環；72 ℃、10 min，4 ℃保存。取1 g瓊脂糖加TAE電泳緩沖液定容至100 mL 配制成1%的瓊脂糖凝膠，對PCR 產物行電泳檢測，于凝膠成像系統中成像。采用2－ΔΔCt法計算G6PD mRNA 表達水平。

1.8 免疫組織化學技術檢測大腸癌組織中SIRT2和G6PD 蛋白表達水平60 ℃烘干箱對癌組織和癌旁組織的切片烤片2 h，烤片后將組織切片進行常規脫蠟，然后加入枸櫞酸緩沖液或EDTA 修復液進行修復，PBS 緩沖液（pH7.4）沖洗3 次；滴加3%過氧化氫后室溫孵育15 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，5%血清室溫封閉30 min，滴加一抗（稀釋濃度為1∶200），于4 ℃濕盒中孵育16 h；次日復溫后PBS 緩沖液沖洗3 次，滴加二抗工作液，37 ℃孵育30 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，滴加DAB 顯色液。鏡下觀察顯色反應充分反應后終止反應，Harris 蘇木素進行復染，1%的鹽酸乙醇進行分化，再經過脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，每張組織切片各選3 個視野采集圖像進行保存，根據染色強度和染色陽性率取均數進行評分。

1.9 統計學分析采用SPSS 17.0 統計軟件進行統計學分析，采用GraphPad Prism 8.0 軟件繪圖。各組細胞中相關基因mRNA 和蛋白表達水平，培養液中葡萄糖和乳酸水平，細胞增殖活性和細胞克隆形成率均行正態分布和方差齊性檢驗，符合正態分布的數據以±s表示，2 組間樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗；采用χ2檢驗分析癌組織與癌旁組織SIRT2 和G6PD 蛋白表達差異。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 過表達和沉默SIRT2 后各組細胞培養液中葡萄糖和乳酸的水平Western blotting 法檢測結果顯示：SW480 細胞中SIRT2 蛋白表達水平較低，HCT116 細胞中SIRT2 蛋白表達水平較高，組間比較差異有統計學意義（P<0.05），因此選擇SIRT2 本體表達高的HCT116 細胞進行后續的RNA 干擾實驗，選擇SIRT2 本體表達低的SW480細胞進行過表達實驗。SIRT2 的3 組不同siRNA 干擾序列通過Western blotting 法驗證，結果顯示：與陰性對照組比較，SIRT2-siRNA#3 轉染組HCT116 細胞中SIRT2 蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），故SIRT2-siRNA 干擾組處理均采用SIRT2-siRNA#3。Western blotting 法驗證結果顯示：與空白組和空載體質粒轉染組比較，SIRT2 質粒過表達組細胞中SIRT2 蛋白表達水平明顯升高（P<0.05）。見圖1。細胞培養液中葡萄糖水平的檢測結果顯示：與陰性對照組比較，SIRT2-siRNA 干擾組HCT116 細胞培養液中葡萄糖水平明顯升高（P<0.05）；與空載體質粒轉染組比較，SIRT2 質粒轉染組SW480 細胞培養液中葡萄糖水平明顯降低（P<0.05）。培養液中乳酸水平的檢測結果顯示：與陰性對照組比較，SIRT2-siRNA干擾組HCT116 細胞培養液中乳酸水平明顯降低（P<0.05）；與空載體質粒轉染組比較，SIRT2 質粒轉染組SW480 細胞培養液中乳酸水平明顯升高（P<0.05）。培養液中葡萄糖水平檢測結果顯示：在HCT116 細胞中，與陰性對照組（葡萄糖水平3.19 mmol·L－1）比 較，SIRT2-siRNA 干 擾 組（葡萄糖水平5.28 mmol·L－1）培養液中葡萄糖水平明顯升高（P<0.05）；在SW480 細胞中，與空載體質粒轉染組（葡萄糖水平5.02 mmol·L－1）比較，SIRT2質粒轉染組（葡萄糖水平2.66 mmol·L－1）培養液中葡萄糖水平明顯降低（P<0.05）。培養液中乳酸水平檢測結果顯示：在HCT116 細胞中，與陰性對照組（乳酸水平14.68 mmol·L－1）比較，SIRT2-siRNA 干擾組（乳酸水平11.29 mmol·L－1）培養液中乳酸水平明顯降低（P<0.05）；在SW480 細胞中，與空載體質粒轉染組（乳酸水平13.76 mmol·L－1）比較，SIRT2 質粒轉染組（乳酸水平20.32 mmol·L－1）培養液中乳酸水平明顯升高（P<0.05）。

2.2 過表達和沉默SIRT2 后各組細胞增殖活性和克隆形成率CCK-8 實驗檢測結果顯示：SIRT2-siRNA 干擾組細胞增殖活性較陰性對照組明顯降低P<0.05）（圖2A）；SIRT2 質粒轉染組細胞增殖活性較空載體質粒轉染組和空白組明顯升高（圖2B）（P<0.05）。沉 默SIRT2 后，SIRT2-siRNA 干擾組HCT116 細胞克隆數明顯少于陰性 對 照 組 （圖3A～3C）；過 表 達SIRT2 后，SIRT2 質粒轉染組SW480 細胞克隆數明顯多于空載體質粒轉染組和空白組（圖3D～3F）。沉默SIRT2 后，SIRT2-siRNA 干 擾 組HCT116 細 胞 克隆形成率明顯低于陰性對照組（P<0.05）（圖4A）；過表達SIRT2 后，SIRT2 質粒轉染組SW480 細胞克隆形成率明顯高于空載體質粒轉染組和空白組（P<0.05）（圖4B）。

圖2 CCK-8 法檢測各組細胞增殖活性Fig.2 Proliferation activities of cells in various groups detected by CCK-8 method

圖3 克隆形成實驗檢測各組細胞克隆形成情況（結晶紫）Fig.3 Colone formations of cells in various groups detected by colony formation assay（Crystal violet）

圖4 各組細胞克隆形成率Fig.4 Clone formation rates of cells in various groups

2.3 過表達和沉默SIRT2 后各組細胞中G6PD mRNA 和蛋白表達水平RT-PCR 法檢測結果顯示：與陰性對照組比較，SIRT2-siRNA 干擾組HCT116 細胞中G6PD mRNA 表達水平明顯降低；而SIRT2 質粒轉染組SW480 細胞中G6PD mRNA表達水平較空載體質粒轉染組明顯升高。Western blotting 法檢測結果顯示：與陰性對照組比較，SIRT2-siRNA 干 擾 組 的HCT116 細 胞 中G6PD 蛋白表達水平降低（P<0.05）；而SIRT2 質粒轉染組SW480 細胞中G6PD 蛋白表達水平較空載體質粒轉染組明顯升高（P<0.05），見圖5。

圖5 各組細胞中G6PD mRNA 和蛋白表達電泳圖和直條圖Fig.5 Electropherograms and histograms of expressions of G6PD mRNA and protein in cells in various groups

2.4 大腸癌組織和癌旁組織中SIRT2 和G6PD 蛋白的表達水平采用免疫組織化學技術檢測大腸癌臨床樣本中SIRT2 和G6PD 蛋白表達水平，結果顯示：癌旁組織中SIRT2［SIRT2 蛋白高水平表達：37.5%（15/40）］和G6PD 蛋白表達水平［G6PD蛋白高水平表達：27.5%（11/40）］低于癌組織［SIRT2蛋白高水平表達：67.5% （27/40），G6PD蛋白高水平表達：77.5%（31/40）］（P<0.05）。見圖6。

圖6 大腸癌和癌旁組織中SIRT2 和G6PD 的表達（免疫組織化學，×400）Fig.6 Expressions of SIRT2 and G6PD in colorectal cancer tissue and adjacent tissue (Immunohistochemistry,×400)

2.5 回復實驗中各組細胞培養液中葡萄糖和乳酸水平、細胞增殖活性和克隆形成率與對照組比較，SIRT2-siRNA#3 和G6PD 質粒共轉染組細胞培養液中葡萄糖和乳酸水平差異無統計學意義（P>0.05）；與 SIRT2-siRNA#3 組 比 較，SIRT2-siRNA#3 和G6PD 共轉染組細胞培養液中葡萄糖水平降低（P<0.05），乳酸水平升高（P<0.05）（圖7）。CCK-8 實驗檢測結果顯示：與對照組比較，SIRT2-siRNA#3 和G6PD 質粒共轉染組細胞增殖活性差異無統計學意義（P>0.05）；與SIRT2-siRNA#3 組 比 較，SIRT2-siRNA#3 和G6PD 共轉染組細胞增殖活性升高（P<0.05）（圖8）。克隆形成實驗結果顯示：與對照組比較，SIRT2-siRNA#3 和G6PD 質粒共轉染組細胞克隆形成數量和克隆形成率差異無統計學意義（P>0.05）；與 SIRT2-siRNA#3 組 比 較，SIRT2-siRNA#3 和G6PD 共轉染組細胞克隆數增加（P<0.05），克隆形成率升高（P<0.05）。見圖9和10。

圖7 各組細胞培養基中葡萄糖和乳酸水平Fig.7 Levels of glucose(A) and lactic acid(B) in culture medium of cells in various groups

圖8 CCK-8 法檢測3 組不同時間點細胞增殖活性Fig.8 Proliferation activities of cells in various groups at different time proteins detected by CCK-8 method

圖9 克隆形成實驗檢測各組細胞克隆形成情況（結晶紫）Fig.9 Colone formations of cells in various groups detected by colony formation assay（Crystal violet）

3 討 論

圖10 回復實驗中各組細胞克隆形成率Fig.10 Clone formation rates of cells in various groups in recovery experiment

SIRT2 作為SIRT 家族的一員，主要定位于細胞質，參與調控氧化應激和細胞程序性死亡等生物過程。研究［14］顯示：SIRT2 促進宮頸癌的發生發展，其表達水平與宮頸癌的惡性程度有關；在裸鼠原位肝癌肺轉移模型中，敲低SIRT2 基因可以激活蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）進而影響糖原 合 成 酶 激 酶 3β （glycogen synthase kinase3β，GSK3β）/β-連環蛋白（β-catenin）信號通路，抑制人肝癌細胞的增殖和肺轉移［15］。SIRT2 在大腸癌細胞糖代謝和增殖中的作用目前尚不明確。本研究選擇大腸癌HCT116 細胞和SW480 細胞，Western blotting 法檢測SIRT2 蛋白在HCT116 細胞中呈高表達，在SW480 細胞中呈低表達，因此選擇HCT116 細胞進行后續RNA 干擾實驗，選擇SW480 細胞進行后續的過表達實驗。合成si-RNA小鏈，構建重組質粒pcDNA3.1-HA-SIRT2，采用瞬時轉染法將si-RNA 小鏈和質粒分別轉染至HCT116 和SW480 細胞。細胞培養液中葡萄糖和乳酸水平檢測結果顯示：si-SIRT2 轉染組培養液中葡萄糖水平明顯高于陰性對照組，乳酸水平明顯低于對照組；而SIRT2 轉染組培養液中葡萄糖水平明顯低于對照組，乳酸水平高于對照組。20 世紀30 年代 WARBURG 首次提出腫瘤細胞中存在“Warburg 效應”，即有氧糖酵解，是指腫瘤細胞即使在氧氣充足的情況下也會利用糖酵解供能產生乳酸。因此本研究證實了SIRT2 促進大腸癌細胞葡萄糖的攝取和乳酸的生成，即促進大腸癌細胞有氧糖酵解。有氧糖酵解可以為腫瘤細胞的生長提供以下優勢：一是迅速產生能量；二是為腫瘤細胞生物大分子的合成提供原料，滿足腫瘤細胞快速增殖的需求［16］。本文作者推測SIRT2 可能通過提高糖酵解進而促進大腸癌細胞的增殖，CCK-8 實驗和克隆形成實驗均證實SIRT2 促進大腸癌細胞的增殖。CHEN 等［17］研究證實：SIRT2 調節Akt 的去乙酰化和活化，隨后影響GSK3β/β-catenin 信號通路以調節上皮間質轉化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT）。牛虹等［18］研究證實：在胃癌細胞中SIRT2 存在明顯的表達上調，沉默SIRT2可 能 通 過 調 節 磷 脂 酰 肌 醇 -3- 激 酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt 通 路，從而抑制胃癌細胞遷移、增殖和侵襲；GUO 等［19］研究也證實敲低 SIRT2 使子宮內膜癌（endometrial carcinoma，EC）細胞增殖降低，其機制與SIRT2 對 EC 細胞大鼠肉瘤病毒/細胞外信號調節激酶（rat sarcoma virus/extracellular signalregulated kinase，RAS/ERK）通路的調節有關，與本研究結果一致。

磷酸戊糖途徑是糖酵解支路，該途徑與細胞增殖密切相關，其中間產物最終進入糖酵解途徑。G6PD 是磷酸戊糖途徑的限速酶，研究［20-22］證實：G6PD 在多種腫瘤組織或細胞系中均表現出高表達和高活性，降低G6PD 的表達將抑制癌細胞的增殖［23］。本研究結果顯示：沉默SIRT2 后細胞中G6PD mRNA 和蛋白表達水平均降低，而過表達SIRT2 后細胞中G6PD mRNA 和蛋白表達水平均升高，SIRT2 對G6PD 有明顯的正向調控作用。作為去乙酰化酶，SIRT2 通過何種機制調控G6PD 的基因表達需進一步研究。為了證實 G6PD 參與SIRT2 對大腸癌細胞的有氧糖酵解和細胞增殖的調控作用，本研究在 HCT116 細胞中共轉染SIRT2-siRNA 和G6PD 質粒，結果顯示：與 si-SIRT2 單獨轉染組比較，si-SIRT2&G6PD 質粒共轉染組細胞的有氧糖酵解和增殖能力均得以恢復。由此推斷 G6PD 參與 SIRT2 調控大腸癌細胞葡萄糖的消耗、乳酸的生成和細胞增殖。已有研究［24-25］證實：SIRT2 能夠激活G6PD 進而促進白血病細胞的克隆形成和增殖，沉默SIRT2 抑制G6PD 活性，導致白血病細胞的增殖降低，與本研究結果一致。本研究中免疫組織化學檢測結果顯示：SIRT2 和G6PD 在大腸癌組織中均為高表達。

綜上所述，SIRT2 促進大腸癌細胞的有氧糖酵解和增殖，其機制可能與SIRT2 調控G6PD 的基因表達有關。