六價鉻致肝臟損傷作用機(jī)制的生物信息學(xué)分析

王 睿, 章 鼎, 諸葛瑞劍, 薛 倩, 郭 麗

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院脊柱外科，吉林 長春 130033）

六價鉻［hexavalent chromium，Cr（Ⅵ）］是環(huán)境中常見的重金屬污染物，常以鉻酸根離子的形式存在，具有較強(qiáng)的氧化活性和化學(xué)毒性［1］。在生產(chǎn)生活中，Cr（Ⅵ）可通過呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和皮膚接觸進(jìn)入人體，對肝臟、腎臟、心臟和脾臟等器官造成急慢性損害［1-2］。Cr（Ⅵ）經(jīng)口暴露后，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮主要毒作用及生物代謝作用的靶器官是肝臟［1］。目前關(guān)于Cr（Ⅵ）致肝臟損傷的毒作用機(jī)制包括：① 經(jīng)Cr（Ⅵ）暴露的肝組織中出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤［3］；② Cr（Ⅵ）會導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，還原過程中會產(chǎn)生過渡價態(tài)鉻和活性氧（active oxygen，ROS）［4］，還原產(chǎn)物還會與DNA 結(jié)合形成Cr-DNA 加合物［5］，導(dǎo)致DNA 損傷或染色體畸變［6］；③ Cr（Ⅵ）進(jìn)入肝細(xì)胞會破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)，使線粒體功能受損，過量ROS 蓄積影響能量代謝誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡［7］；④Cr（Ⅵ）會引起肝細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，鈣離子超載會影響細(xì)胞對損傷的敏感性，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死［8］；⑤ 低濃度Cr（Ⅵ）暴露會引起肝細(xì)胞DNA 合成期阻滯，高濃度則會引起DNA 合成后期和分裂期阻滯［9］；⑥ Cr（Ⅵ）也可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡［10］。但是Cr（Ⅵ）致肝臟損傷的毒作用機(jī)制尚未完全闡明。以往對于Cr（Ⅵ）致肝臟損傷機(jī)制的研究缺乏對生物信息學(xué)的整合和對關(guān)鍵通路的識別，且目前國內(nèi)外也缺少生物信息學(xué)方面報(bào)道，全面系統(tǒng)地研究基因表達(dá)譜的變化有助于更好地闡明Cr（Ⅵ）致肝臟損傷的潛在分子機(jī)制。本研究利用基因表達(dá)綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù) 據(jù) 庫［11］的 高 通 量測序數(shù)據(jù) GSE65198，篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析［12］，構(gòu)建蛋白-蛋白 互 作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng) 絡(luò)，篩選hub 基因以及預(yù)測靶向藥物分子，識別Cr（Ⅵ）致肝臟損傷的相關(guān)基因，為進(jìn)一步探討Cr（Ⅵ）致機(jī)體肝臟損傷的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集和標(biāo)準(zhǔn)化使用的分析數(shù)據(jù)來自GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)集GSE65198［13］，種屬為大鼠。數(shù)據(jù)集GSE65198 共有59 例樣本，該原始數(shù)據(jù)已通過Partek GS 6.6 中的主成分分析檢查了微陣列數(shù)據(jù)是否存在異常，并采用Robust Multi-Array Averaging 算法進(jìn)行了背景調(diào)整、規(guī)范化和總結(jié)。選擇其中20例樣本分為2組，第1 組肝臟20 mg·kg－1Cr（Ⅵ）1 次暴露后1 d 和對照樣本各5 例，第2 組肝臟20 mg·kg－1Cr（Ⅵ）1 次暴露后7 d 與對照樣本各5 例。

1.2 DEGs 的識別和分析將每組中的對照樣本作為陰性對照組，暴露樣本為實(shí)驗(yàn)組，采用R 語言（version 4.0.2）中 的limma 包（version 3.44.3）進(jìn)行差異分析，貝葉斯方法建立線性模型，采用t檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Benjamini-Hochberg 矯正錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）值與P值，差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）經(jīng)log 轉(zhuǎn)換后得到。篩選出每組的DEGs，顯著性閾值為｜log2FC｜>1且P<0.05。再利用R 語言的pheatmap （version 1.0.12）和ggplot2（version 3.3.2）包分析DEGs并可視化，繪制熱圖和火山圖。

1.3 富集分析將獲得的暴露后1 d 組和 7 d 組的DEGs 上 傳 至 DAVID 2021 （https：//david.ncifcrf.gov/ home.jsp）進(jìn)行GO 富集分析和KEGG信號通路富集分析。Fisher精確概率法檢驗(yàn)得出P值，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和hub 基因篩選在STRING 11.5（https：//cn.string-db.org/）［14］中分別構(gòu)建暴露后1 d 組、7 d 組和暴露后1 d 組及7 d 組均表達(dá)的DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)置置信度為0.400 進(jìn)行篩選，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Cytoscape（version 3.9.1）軟件進(jìn)行可視化，通過Cytoscape 中的Cytohubba 插件對PPI 網(wǎng)絡(luò)中DEGs進(jìn)行評分，其中每組degree 值前5 位DEGs 被認(rèn)為是參與Cr（Ⅵ）所致肝臟損傷的hub 基因。

1.5 預(yù)測與DEGs 相關(guān)的靶向藥物基于獲得的hub 基因和7 d 后依舊表達(dá)的DEGs，通過Enrichr網(wǎng) 站［15］（https：//maayanlab.cloud/ Enrichr/#）采用藥物特征數(shù)據(jù)庫DSigDB 預(yù)測靶向藥物分子。潛在的治療藥物由調(diào)整P值和作用于DEGs 的豐度所確定。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs 識別對數(shù)據(jù)集GSE65198 分析后，暴露后1 d 組有342 個DEGs，與對照組比較，暴露組包括202 個上調(diào)基因和140個下調(diào)基因；暴露后7 d組有61 個DEGs，與 對 照 組 比 較，暴 露 組 包 括41 個 上 調(diào) 基 因 和20 個 下 調(diào) 基 因（|log2FC|>1 且P<0.05）。圖1 A 和1B 分別為1 次暴露后1 d 組 和1 次暴露后7 d 組DEGs 的熱圖，圖1C 和1D 分別是1 次暴露后1 d 組和1 次暴露后7 d 組DEGs 的火山圖。其中天冬酰胺合成酶（asparagine synthetase，ASNS）、細(xì)胞周期蛋白B2（cyclin B2，CCNB2）、細(xì)胞分裂周期20（cell division cycle 20，CDC20）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑3 （cyclin dependent kinase inhibitor 3，CDKN3）、CXC 基 序趨化因子配體（C-X-Cmotif chemokine ligand 1，CXCL1）、脂肪酸結(jié)合蛋白4 （fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4）、動 粒 定 位Astrin 結(jié) 合 蛋 白（kinetochore localized Astrin binding protein，KNSTRN）、LOC100912602、金 屬 硫 蛋 白2A（metallothionein 2A，MT2A）、PQ 循環(huán)重復(fù)包含蛋 白 3 （PQ cycle repeats contain protein 3，PQLC3）、RT1 Ib 類 基因座EC2（RT1-EC2）和生長抑素受體3（somatostatin receptor 3，SSTR3）是2 組中均存在DEGs，共同影響糖皮質(zhì)激素反應(yīng)的生物學(xué)過程，均參與了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和細(xì)胞周期的信號通路。

圖1 Cr(Ⅵ)1 次暴露后1 d 組和7 d 組DEGs 的熱圖（A，B）和火山圖（C，D）Fig.1 Cluster heatmaps(A，B) and volcanic maps(C，D) of DEGs in 1 d and 7 d after single exposure to Cr (Ⅵ) groups

2.2 GO 富集分析和KEGG 通路分析對DEGs進(jìn)行GO 富集分析，GO 包括生物過程、分子功能和細(xì)胞成分3個注釋內(nèi)容。Cr（Ⅵ）1次暴露后1 d組DEGs 最顯著的生物學(xué)過程包括藥品反應(yīng)、異種生物刺激反應(yīng)和衰老等；Cr（Ⅵ）1 次暴露后7 d 組最顯著的生物學(xué)過程包括有絲細(xì)胞分裂、有絲分裂紡錘體中間區(qū)組合和細(xì)胞分裂的正向調(diào)節(jié)等。KEGG 通路分析結(jié)果顯示：Cr（Ⅵ）1次暴露后1 d 組DEGs 參與了代謝、真核生物中的核糖體生物發(fā)生、細(xì)胞色素P450 對異生素的代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝及過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）信號通路等信號通路；Cr（Ⅵ）1 次暴露后7 d 組DEGs 參與了孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞衰老、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和p53 信號通路等信號通路。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和hub 基因篩選基于STRING 數(shù)據(jù)庫分析DEGs 的PPI 關(guān)系，得到暴露后1 d 組共包含276 個節(jié)點(diǎn)和2 470 條關(guān)系，暴露后7 d組共包含43個節(jié)點(diǎn)和532條關(guān)系，見圖2A 和2B。通過Cytoscape 中的Cytohubba 插件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析篩選hub 基因，按照degree 值排序，暴露后1 d 組degree 值前5 位的 hub 基因分別為EBNA1 結(jié)合蛋白2（EBNA1 binding protein 2，EBNA1BP2）、核仁蛋白58 （nucleolar protein 58，NOP58）、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白樣3 （guanine nucleotide binding protein like 3，GNL3）、核 仁 蛋 白56（nucleolar protein 56，NOP56）和WD 重 復(fù) 域12（WD repeat domain 12 ，WDR12），暴露后7 d 組degree 值前5 位的hub 基因分別為CCNB2、細(xì)胞周期蛋白A2（cyclin A2，CCNA2）、細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1，CCNB1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）和驅(qū)動蛋白家族成員20B （kinesin family member 20B，KIF20B），其PPI 網(wǎng) 絡(luò) 見 圖2 C 和2D。ASNS、CCNB2、CDC20、CDKN3、CXCL1、FABP4、KNSTRN、LOC100912602、MT2A、PQLC3、RT1-EC2 和SSTR3 是暴露后1 d 組和7 d 組中均存在的DEGs。通過String 分析PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，其中CDC20、KNSTRN、CDKN3 和CCNB2 （在PPI網(wǎng)絡(luò)中標(biāo)識符：ENSRNOP00000017117）在網(wǎng)絡(luò)中心有多個連接節(jié)點(diǎn)，包含4 個節(jié)點(diǎn)和6 條邊。導(dǎo)入Cytoscape 軟件對PPI 網(wǎng)絡(luò)圖可視化，見圖2 E。

圖2 Cr(Ⅵ)1 次暴露后1 d 和7 d 組DEGs 及hub 基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network diagram of DEGs and hub genes in 1 d and 7 d after single exposure to Cr(Ⅵ) groups

2.4 預(yù)測與DEGs 相關(guān)的靶向藥物通過Enrichr平臺分析，根據(jù)調(diào)整P值預(yù)測，與已被篩選出的hub 基因和1 d 及7 d 均表達(dá)的DEGs 相關(guān)的前10 種潛在靶向藥物見表1。

表1 與已被篩選出的13 個Cr(Ⅵ)致肝臟損傷DEGs 相關(guān)的前10 種潛在靶向藥物Tab.1 Top 10 potential target drugs related to thirteen selected DEGs of liver injury induced by Cr (Ⅵ)

3 討 論

作為被公認(rèn)的人類致癌物，Cr（Ⅵ）對機(jī)體產(chǎn)生損害毒性效應(yīng)是一個非常復(fù)雜的過程。本研究共篩選出403 個DEGs，其中20 mg·kg－1Cr（Ⅵ）肝臟暴露后1 d 在實(shí)驗(yàn)組和對照組之間共識別出342 個DEGs，20 mg·kg－1Cr（Ⅵ）肝臟暴露后7 d共識別出61 個DEGs。對DEGs 構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析后，EBNA1BP2、NOP58 和GNL3 等基因被篩選為20 mg·kg－1Cr（Ⅵ）肝臟暴露后1 d 肝臟的hub 基 因，CCNB2、CCNA2 和CCNB1 等 基 因 被 篩選為20 mg·kg－1Cr（Ⅵ）肝臟暴露后7 d 的hub 基因。而20 mg·kg－1Cr（Ⅵ）肝臟暴露7 d 后均表達(dá)的DEGs 并且在PPI 網(wǎng)絡(luò)中有多個連接節(jié)點(diǎn)的基因分 別 為CDC20、KNSTRN、CDKN3 和CCNB2。上述基因在Cr（Ⅵ）致肝臟損傷的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用，GO 富集分析結(jié)果顯示：上述基因主要在有絲分裂細(xì)胞周期相變、細(xì)胞分裂、線粒體ATP 合成的正調(diào)控耦合電子傳遞和參與卵母細(xì)胞成熟的減數(shù)分裂細(xì)胞周期等生物過程中起重要作用；KEGG 通路分析結(jié)果顯示：上述基因與細(xì)胞周期、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和細(xì)胞衰老p53 信號通路等有密切聯(lián)系。Hub基因和DEGs 所涉及的生物學(xué)過程均與細(xì)胞周期有密切關(guān)聯(lián)，KEGG 通路分析也驗(yàn)證了該結(jié)果。研究［9］表明：低劑量Cr（Ⅵ）暴露會導(dǎo)致L-02 細(xì)胞S 期停止，而更高劑量的Cr（Ⅵ）暴露會導(dǎo)致細(xì)胞G2/M 期停止。在Cr（Ⅵ）暴露后，p53 通過調(diào)節(jié)S 期檢查點(diǎn)蛋白復(fù)制檢查點(diǎn)介體1 （mediator of replication checkpoint 1，Mrc1）和有絲分裂檢查點(diǎn)蛋白苯并咪唑出芽抑制解除同源物相關(guān)蛋白1（budding uninhibited by benzimidazoles related 1，BubR1）導(dǎo)致L-02 肝細(xì)胞的S 期或G2期停止。

基因表達(dá)概況也可以為潛在的早期基因生物標(biāo)志物和Cr（Ⅵ）暴露致肝臟損傷的毒作用機(jī)制提供理論依據(jù)。本研究所得出的hub 基因和暴露7 d后均表達(dá)的DEGs 顯示：Cr （Ⅵ）致肝臟損傷關(guān)鍵可能是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因。EBNA1BP2 是一種蛋白質(zhì)編碼基因，研究［16］顯示：在二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌過程中，EBNA1BP2 表達(dá)量不斷增加，在誘癌后期其表達(dá)量會明顯升高。NOP56 蛋白是與致癌基因表達(dá)密切關(guān)聯(lián)的核仁蛋白［17］，NOP58 蛋 白 與NOP56 蛋 白 高 度 同 源［18］。研究［19］表明：肝癌中的致癌基因長鏈非編碼RNA FAM83A-AS1 通過與 NOP58 結(jié)合以增強(qiáng)FAM83A mRNA 的穩(wěn)定性，促進(jìn)肝癌發(fā)展。GNL3 是MMR1/ HSRICTP 結(jié)合蛋白家族的成員，GNL3 通過SIRT1 介導(dǎo)肝癌干細(xì)胞樣特性，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為［20］。WDR12 是以色氨酸-天冬氨酸重復(fù)序列結(jié)尾的蛋白家族成員，在細(xì)胞分裂增殖、細(xì)胞周期調(diào)控和核糖體生物發(fā)生等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［21］。CCNB1、CCNB2、CCNA2、CDK1、CDC20 和CDKN3 均為細(xì)胞周期蛋白家族成員。CCNB1 在許多癌癥中均有明顯的高表達(dá)［22］，肝癌組織中CCNB1 的上調(diào)提示肝癌患者的總生存期和無病生存期更差［23］。敲除CCNB2 可抑制體內(nèi)肝癌細(xì)胞的增殖，CCNB2 可能通過增加JAG1 的表達(dá)來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［24］。CCNA2 是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，從S 期到有絲分裂早期高表達(dá)，并與腫瘤發(fā)生有關(guān)，CCNA2-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物驅(qū)動染色體復(fù)制，隨后促進(jìn)有絲分裂［25］。CDK1 是哺乳動物細(xì)胞增殖的必需基因，可與CCNB 組成復(fù)合物有絲分裂促進(jìn)因子，使細(xì)胞周期從G2期加快進(jìn)入M 期，CDK1 失活會導(dǎo)致染色體破裂和細(xì)胞死亡［26］。CDC20 能促進(jìn)腫瘤發(fā)生，抑制CDC20 表達(dá)能加快調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期和細(xì)胞凋亡［27］，其在染色體分離和有絲分裂中發(fā)揮重要作用［28］。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果［29］表明：在132 個匹配的肝癌組織中，68.18% 肝癌樣本中檢測到CDC20 蛋白高表達(dá)。CDKN3 可促進(jìn)很多腫瘤的發(fā)生［30］，抑制CDKN3可以提高肝癌細(xì)胞存活［31］。KIF20B 屬于驅(qū)動蛋白家族，是一種在M 期特異性磷酸化的微管相關(guān)蛋白，在胞質(zhì)分裂中起關(guān)鍵作用［32］。通過將微管相關(guān)藥劑與KIF20B 抑制相結(jié)合，抑制了肝癌細(xì)胞的中期和末期雙重有絲分裂［33］。KNSTRN 是有絲分裂紡錘體的重要組成部分，通過激活A(yù)KT 磷酸化促進(jìn)腫瘤發(fā)生［34］。

通過Enrichr 平臺的DSigDB 數(shù)據(jù)庫，確定了與hub 基因和20 mg·kg－1Cr（Ⅵ）暴露7 d 后均表達(dá)的DEGs 相關(guān)的藥物分子，按P值大小進(jìn)行了相關(guān)度排序。硫蒽酮、1H-吡唑［3，4-d］嘧啶、2H-1-苯并吡喃-2-酮，7-［（3，7-二甲基-2，6-辛二烯基）氧基、氧化銅、睪酮、0173570-0000、過氧化氫、2，3-二甲氧基-1，4-萘醌、曲格列酮和羅斯科維汀是與Cr（Ⅵ）致肝臟損傷相關(guān)的潛在治療藥物。其中羅斯科維汀是一種周期蛋白依賴性抑制劑，已被證實(shí)對急性和慢性肝臟炎癥以及纖維化有治療作用。研究［35］顯示：羅斯科維汀給藥明顯減輕肝損傷，其通過抑制巨噬細(xì)胞炎癥作用和HSC激活預(yù)防肝臟疾病，并能減少肝纖維化。其他預(yù)測藥物的治療作用仍需進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)較全面系統(tǒng)地探討了基因表達(dá)譜的變化以及關(guān)鍵通路的識別，探究了Cr（Ⅵ）暴露后肝臟損傷的潛在分子機(jī)制和生物標(biāo)志物，為Cr（Ⅵ）毒性效應(yīng)的研究提供了信息，但仍需要通過人群或試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。