蔗糖酶制備與生化特征及應用研究進展

摘要 蔗糖酶具有水解酶和轉移酶的雙重性質，主要用于催化水解蔗糖鏈中的糖苷鍵。本文介紹了蔗糖酶的來源和分類，以酸性酶和堿性酶為代表，分別闡述了兩種酶的結構和催化水解蔗糖的機理，并綜述了蔗糖酶在工業上的應用，為進一步拓寬蔗糖酶在食品工業中的應用范圍提供參考。

關鍵詞 蔗糖酶；食品工業；催化機理

中圖分類號 TS201.2 文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）23-24-0146-05

蔗糖是使用較為廣泛的糖類，其甜味純正，無不良口感，作為天然甜味劑被廣泛應用在食品、醫藥等領域。甘蔗和甜菜是制備蔗糖的主要原料[1]。人體不能直接吸收蔗糖和多糖等物質，須在體內水解轉化為單糖（如葡萄糖、果糖等）才能被充分吸收利用。因此，研究蔗糖的水解有利于甘蔗等糖料資源的充分利用。

蔗糖酶是催化蔗糖水解成果糖和葡萄糖的一種酶，目前與蔗糖酶相關的文獻報道較多。米運宏等[2]利用蔗糖酶制備出高果糖漿；梁鵬等[3]介紹了蔗糖酶、蔗糖異構酶和β-果糖基轉移酶等多種延伸蔗糖產業鏈的相關酶；劉麗娜等[4]對微生物葡聚糖蔗糖酶進行了詳細論述，該酶有助于提升通過蔗糖合成葡聚糖和功能性低聚糖的產量。國外對于不同來源、不同類型蔗糖酶的報道也較多，Manoochehri等[5]統計出來源于動植物、真菌和細菌等在內的50多種蔗糖酶，其本質屬于糖苷水解酶，主要功能是催化蔗糖水解得到葡萄糖和果糖[6]，以及兩者等比例混合的轉化糖漿，該反應也可通過酸水解發生。

[GF " 蔗糖酶 " "G+F或GF酸G+F]

式中，GF代表蔗糖，G代表葡萄糖，F代表果糖。其中，酸水解通過在高溫高壓下加入酸性物質使蔗糖水解為葡萄糖和果糖，此方法工序復雜、副產物多且效率低，限制了其在工業上的應用[7]。而酶水解是由蔗糖酶催化的水解過程，具有反應溫和、無中間副產物產生且無有毒試劑添加等優勢[8-9]，更適用于工業化生產。

本文以蔗糖酶為研究對象，主要圍繞其來源、分類、制備方式、內部結構、酶催化機理、穩定性及其工業應用展開介紹，為進一步拓寬蔗糖酶在食品工業中的應用范圍提供參考。

1 蔗糖酶的基本情況

蔗糖酶（Invertase）又稱β-D-呋喃果糖苷水解酶（EC 3.2.1.26），能催化裂解D-葡萄糖和D-果糖之間的糖苷鍵。蔗糖酶對糖苷鍵具有專一性，也能催化棉籽糖和水蘇糖的水解。蔗糖酶還具有轉移活性，能將α-β-D-O-呋喃果糖苷殘基轉移給受體底物，稱為果糖基轉移酶（EC 2.4.1.9）[10]。蔗糖酶廣泛存在于動植物及微生物細胞中，對生物體的糖類代謝和生長發育發揮著重要作用[11]。不同生物體部位來源的蔗糖酶具有不同的結構和特征，從最適pH值的角度看，酸性蔗糖酶主要來源于細胞壁和液泡，而中性或堿性蔗糖酶大部分存在于細胞質；從來源上看，相比動植物來源的蔗糖酶，微生物來源的蔗糖酶具有催化活性多樣、來源廣泛和生產成本低等優勢，更適合工業生產[12]。生產蔗糖酶的微生物主要有酵母菌、霉菌和細菌等，如黑曲霉（Aspergillus niger）能在培養基中產生高純度的蔗糖酶，被用于食品業和飼料業生產中[6]。但考慮到生物安全性和毒性，酵母菌具有獨特優勢，酵母菌中的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是目前應用較廣的微生物。

2 蔗糖酶的制備

工業生產通過微生物發酵法制備蔗糖酶，發酵方式有固態發酵法、半固態發酵法和深層發酵法。深層發酵法具有產量高、成本低和易于控制培養條件等優勢，工業上大多數的工業酶以此方法生產得到[13]。提取的粗蔗糖酶須經純化才能提升酶活性和穩定性，蔗糖酶屬于蛋白酶，可根據蛋白質的溶解度、分子大小、帶電性質和配體差異性等進行純化分離[14]。通常結合多種純化步驟的蔗糖酶純度更高，Timerman[15]報道了蔗糖酶純化最常用的3個步驟，首先用鹽溶液或有機試劑沉淀雜質蛋白，其次用離子交換、親和層析進一步除去相關雜質，最后通過凝膠色譜柱過濾得到指定分子量范圍的目標酶，再通過凝膠電泳驗證。純化后酶的儲存穩定性容易受影響，并且傳統的酶催化反應結束后需滅酶處理，蔗糖酶不能被回收，不利于工業上的大規模生產應用。將蔗糖酶固定在特殊載體上，待酶催化反應結束后可以將固定化的蔗糖酶進行回收，不需要滅酶處理，實現蔗糖酶重復使用，因此更適合工業的連續生產。

3 蔗糖酶的結構及催化機理

目前被廣泛應用的酸性蔗糖酶屬于糖苷水解酶第32家族成員（GH32），GH32家族的蔗糖酶主要有4種結構，從N端開始分別是短肽結構域、5重折疊β-螺旋槳催化結構域、α-螺旋結合域及β-折疊堆積成類似三明治狀的結構域[16]。其中，前兩種結構域是GH32家族蔗糖酶的標志性結構，其二級結構主要由β-折疊組成。在催化結構域中，3個高度保守的氨基酸殘基位于口袋活性中心，構成一個“催化三聯體”，分別是親核性殘基天冬氨酸、酸/堿催化殘基谷氨酸和過渡態穩定殘基天冬氨酸[17]。劉麗娜等[4]在研究GH70家族的葡聚糖糖苷酶的催化機理時也發現了類似的“催化三聯體”。Lammens等[18]以GH32家族的擬南芥細胞壁蔗糖酶為例，對其催化機理進行了闡述，蔗糖底物的糖苷氧被酸/堿催化殘基（E203）質子化，然后親核性殘基（D23）對異構碳進行親核攻擊，形成共價果糖-酶中間體，果糖-酶中間體隨后被水解，生成果糖和游離轉化酶，過渡態穩定殘基（D149）不直接參與催化，但提供氫鍵以結合果糖的C3和C4羥基。

另一種堿（中）性蔗糖酶，屬于糖苷水解酶第100家族成員（GH100），與GH32沒有序列同源性，在結構上也有所不同。GH100家族的蔗糖酶并不屬于β-呋喃果糖苷酶，不會被糖基化，并且缺乏N末端信號短肽[19]。這種堿（中）性蔗糖酶也能水解蔗糖，但其內部結構和催化機理與酸性蔗糖酶并不相同。Xie等[20]通過研究GH100家族的魚腥藻堿性蔗糖酶發現其內部結構為六聚體，由3個二聚體組成，每個二聚體主要由α-螺旋組成；研究推測該酶的催化活性部位是天冬氨酸殘基（Asp-188）和谷氨酸殘基（Glu-414），具體催化機理可能是水分子對葡萄糖基部分的頭型碳原子的親核攻擊引發水解，堿催化殘基Glu-414從水分子中提取一個質子協助水解，而酸催化殘基Asp-188則與之相反，向目標氧原子提供一個質子，從而導致糖苷鍵斷裂。

4 蔗糖酶的穩定性

作為生物催化劑，蔗糖酶的穩定性與工業化生產密切相關，對生產過程中的催化效率和生產成本都會造成影響。影響蔗糖酶催化特性的因素主要有溫度、pH、金屬離子和有機試劑等[12]。蔗糖酶在30～50 ℃的溫度范圍內較穩定。Hussain等[21]通過研究溫度對蔗糖酸性轉化酶的影響發現，溫度分別在53、55和63 ℃時，轉化酶的半衰期分別為112、224和10 min，當溫度超過60 ℃后會導致蔗糖酶不可逆地失活。pH值對蔗糖酶的影響與最適溫度相關，比如黑曲霉產生的蔗糖酶在pH值4.1和65 ℃下表現出較佳活性，當溫度降低時，最適pH值也隨之降低[22]。不同的金屬離子對蔗糖酶表現出不同的效果，以酵母蔗糖酶為研究對象，徐雯映等[11]在酵母蔗糖酶催化蔗糖水解過程中分別添加5 mmol/L的EDTA及Mn2+、Zn2+和Fe2+等金屬離子，結果顯示，經過EDTA和Fe2+處理后酵母蔗糖酶的米氏常數（Km）和最大反應速率（Vmax）均降低；Zn2+處理導致Km值上升和Vmax值下降；Mn2+處理則引起Km值和Vmax值均降低；除此之外，金屬離子引起的蔗糖酶內部構象變化與最佳酶活性的變化并無直接關聯。

5 蔗糖酶的應用

5.1 食品工業

酶因反應溫和、可降解、無毒性、副產物較少以及易于純化而被廣泛用于食品工業生產[23]。蔗糖酶較為重要的工業應用是制作含有葡萄糖和果糖的轉化糖漿，轉化糖漿具有比蔗糖更甜、不易結晶和增強食品風味口感等優勢，可以很好地避免杏仁蛋白軟糖、姜餅面團或果仁餡中的糖結晶聚集等[24]。蔗糖酶具備吸濕性，使其可以作為保濕劑用于生產軟心糖果，蔗糖酶還可用于生產和制備人造蜂蜜、奶油、果醬和軟心巧克力等食品[25-28]。

釀造是蔗糖酶在食品工業中的一項重要工業應用。啤酒的生產通過淀粉糖在各種酶的作用下最終發酵生成乙醇，生產過程包括制麥工序、糖化工序、發酵工序和包裝工序，其中參與的酶有α和β-淀粉酶、糊精酶、麥芽糖酶、蔗糖酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶和氧化還原酶等，每一種酶都參與釀造過程中的一個或多個步驟。蔗糖酶將蔗糖分解為果糖和葡萄糖，其活性在澆水末期至發芽第3天非常重要。釀造過程中，當溫度55 ℃、pH值為5.5條件下，轉化酶參與催化轉化過程[29-30]。

5.2 醫療健康

蔗糖酶不僅在糖分解過程中發揮著重要的作用，而且還有助于預防一些人類疾病。蔗糖酶與果糖基轉移酶共同作用于蔗糖溶液可用于生產低聚果糖，低聚果糖對糖尿病患者較有益，其熱量值比蔗糖低，甜度與蔗糖相似[31]。另外，低聚果糖還可以調節糖和脂肪代謝、礦物質吸收以及預防便秘等[32]。蔗糖酶具有抗氧化活性和抗菌作用，可避免細菌污染和腸道氧化發酵。蔗糖酶酶解產物是容易被吸改消化的單糖，單糖不會長時間在胃中停留從而降低胃毒性，可預防細菌在消化道滋生引起的消化系統疾病。不僅如此，蜂蜜中的蔗糖酶還具有代謝活性和化療特性，有助于某些腫瘤消退的治療[5，33]。此外，蔗糖酶可與其他酶配合使用，如蔗糖酶、葡萄糖異構酶和多聚果糖酶協同反應，通過一鍋法制備方式獲得三級序貫供能的特殊膳食用食品，這樣的產品既符合特殊膳食用運動營養食品補充能量類國家標準（GB24154），又賦予逐級供能、益生元和膳食纖維等功能，同時還保持蔗糖原有甜味柔和、供能快速的優點。

5.3 其他應用

蔗糖酶應用于生物燃料[34]、化妝品和造紙工業的生產，以及甘油和乳酸等生產[35]。蔗糖酶還能用在生物傳感器上，可輕松便捷地測出商業應用中的蔗糖含量[8-9]。

6 展望

蔗糖酶在工業中的用途廣泛，常用于碳水化合物的生產加工。為了適應更密集的工業生產，實現蔗糖酶在食品、飼料和醫藥等領域的應用，可通過基因工程提升重組蔗糖酶的產量、酶活性以及催化過程的穩定性等。此外，研究者一直在尋找能適應更廣泛溫度和pH值的新型蔗糖酶，這對蔗糖酶的工業化應用具有較大價值。對蔗糖酶實現工業固定化，提高蔗糖酶使用次數，簡化生產工藝，對企業提高產品品質和提升競爭力具有重要意義。

本文介紹了蔗糖酶的來源和分類，以酸性酶和堿性酶為代表，分別闡述了兩種酶的結構和催化水解蔗糖的機理，并綜述了蔗糖酶在工業上的應用，為進一步拓寬蔗糖酶在食品工業中的應用范圍提供參考。

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（責編：何 艷）