菌根真菌對鐵皮石斛幼苗的促生作用研究

摘要 本研究從鐵皮石斛、兜唇石斛和報春石斛等23種石斛屬植物的健康根系中分離純化菌根真菌菌株68株，通過接種鐵皮石斛盆栽幼苗進(jìn)行共生培養(yǎng)，篩選出促生效果顯著的真菌11株。結(jié)果表明，促生菌根真菌能明顯提高鐵皮石斛幼苗的成活率和生長率，顯著提高鐵皮石斛的葉綠素含量，降低丙二醛和過氧化物酶含量，提高鐵皮石斛的抗逆性，對鐵皮石斛的生長起到促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞 菌根真菌；鐵皮石斛；幼苗促生

中圖分類號 S567.239 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）23-24-0041-05

Promoting effect of mycorrhizal fungi on Dendrobium officinale seedlings

YANG Hetong " "SUN Mingyu " "XI Gangjun*

（Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry， Jurong 212400， China）

Abstract The 68 strains of mycorrhizal fungi were isolated and purified from the healthy roots of 23 species of Genus Dendrobium， including Dendrobium officinale， Dendrobium aphyllum， Dendrobium primulinum， and 11 strains of fungi with prominent promoting effects were screened by symbiotic culture with Dendrobium officinale seedlings. The results showed that mycorrhizal fungi could significantly increase the survival rate and growth rate of Dendrobium officinale seedlings， significantly increase the chlorophyll content of Dendrobium officinale， reduce the malondialdehyde and peroxidase content， improve the stress resistance of Dendrobium officinale， and promote the growth of Dendrobium officinale.

Keywords mycorrhizal fungi; Dendrobium officinale; seedling promotion

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為多年生附生蘭，是一種珍貴的藥食同源植物，富含石斛堿、多糖和苯丙素等對人體有益的物質(zhì)[1]。屬于二級保護(hù)植物，具有較大的藥用價值。其種子細(xì)小無胚乳，自然條件下需要與真菌共生才能完成其生活史[2]。近年來，隨著鐵皮石斛組培和栽培技術(shù)的發(fā)展，鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)規(guī)模迅速擴(kuò)大，現(xiàn)有的鐵皮石斛以大棚集約化栽培為主，栽培設(shè)施投入大，成本較高，產(chǎn)品質(zhì)量尚待提高。本試驗(yàn)通過從自然生長的健康石斛根系上分離篩選出對鐵皮石斛有促生作用的菌根真菌，并測定相關(guān)生理生化指標(biāo)，探索其促生的作用機(jī)制，為鐵皮石斛專用生物菌肥的開發(fā)提供菌株材料和理論參考，降低鐵皮石斛栽培種植成本，提高種苗移栽成活率，提升品質(zhì)，減少化肥農(nóng)藥的施用，為鐵皮石斛的有機(jī)栽培提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 "本試驗(yàn)所用鐵皮石斛、齒瓣石斛（Dendrobium devonianum Paxt.）、尖刀唇石斛（Dendrobium heterocarpum Lindl.）、報春石斛（Dendrobium primulinum Lindl.）、串珠石斛（Dendrobium falconeri Hook.）等23種石斛屬植物均采自云南省，詳見表1。將采集的石斛新鮮根放入密封袋中，分別進(jìn)行編號，保存在4 ℃冷藏箱內(nèi)，供分離菌根真菌使用；接種試驗(yàn)使用的鐵皮石斛組培苗由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程技術(shù)中心提供。

1.1.2 試劑 "葉綠素試劑盒購自蘇州格銳思生物科技有限公司，無水乙醇（分析純）、磷酸（分析純）、硫代巴比妥酸（分析純）、DE共生培養(yǎng)基和N6培養(yǎng)基等藥品均購自國藥集團(tuán)。

1.1.3 儀器設(shè)備 "試驗(yàn)用Sigma 3K30高速冷凍離心機(jī)，日本島津UV1280分光光度計，寧波賽福PRX-250A智能人工氣候箱，上海一恒HWS-28水浴鍋，上海博迅YXQ-LS-75SII高壓蒸汽滅菌鍋，蘇州安泰SW-CJ-2FD超凈工作臺。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌根真菌的分離與純化 "剪取石斛根部3～5 cm，流水沖洗1～2 h，在超凈工作臺上用70%乙醇浸潤30 s，用2%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，無菌水沖洗4次，將其切成0.2～0.5 cm的小段，接種于馬鈴薯蔗糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中，5～6段/皿，置于（25±1） ℃恒溫箱中培養(yǎng)5～7 d[3]，挑取不同菌落邊緣菌絲接種于PDA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)[4-5]。重復(fù)上述步驟，直至平板內(nèi)菌落顏色、形態(tài)一致，接種于PDA試管內(nèi)的斜面上，并進(jìn)行編號，長滿斜面后，保存于4 ℃冷藏箱中。

1.2.2 菌根真菌的初篩 "把純化后的真菌菌株接種到PDA培養(yǎng)基中，于（25±1） ℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d，待菌絲布滿培養(yǎng)基表面后，用φ6 mm打孔器，在菌落邊緣打成菌餅備用。先將鐵皮石斛組培苗轉(zhuǎn)接到DE共生培養(yǎng)基中，5株/瓶，再接入真菌菌餅，4個重復(fù)，于寧波賽福PRX-250A智能人工氣候箱中培養(yǎng)90 d，溫度為（25±1） ℃，光照為1 500 lx，光暗循環(huán)為12 h/d，選擇能與鐵皮石斛形成共生關(guān)系的菌種作為試驗(yàn)備用菌種。

1.2.3 生長指標(biāo)測定 "將初篩后不同菌種的菌餅接入含有鐵皮石斛幼苗的組培瓶內(nèi)，待菌絲布滿培養(yǎng)基表面后，迅速將鐵皮石斛苗從瓶中取出，洗凈根部，稱重后移栽入鐵皮石斛栽培基質(zhì)中，4株/叢，4個重復(fù)，放在組培溫室中培養(yǎng)，以不接菌種的組培苗為對照。120 d后稱量植株鮮重，統(tǒng)計凈生長量和生長率等生長指標(biāo)，丙二醛（MDA）、葉綠素及過氧化物酶（POD）含量分別采用硫代巴比妥酸法[6]、葉綠素含量測定試劑盒和POD含量測定試劑盒進(jìn)行測量分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 "生長指標(biāo)和生理指標(biāo)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根真菌的分離純化

從不同石斛的健康根系共分離、純化得到真菌菌株68株，部分菌株菌落形態(tài)見圖1。

2.2 菌根真菌的初篩

將鐵皮石斛組培苗與分離得到的真菌共生培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，不同真菌對鐵皮石斛生長的影響差異較大，少量鐵皮石斛組培苗葉色較綠，根系生長較旺盛，大量鐵皮石斛組培苗表現(xiàn)為葉色黃，葉片被菌絲覆蓋包裹而死亡。根據(jù)鐵皮石斛組培苗的生長情況從中篩選出與鐵皮石斛能形成共生關(guān)系的真菌菌株33株。

2.3 不同菌根真菌對鐵皮石斛生長指標(biāo)的影響

用不同的菌根真菌對鐵皮石斛組培苗進(jìn)行接菌處理，然后將鐵皮石斛組培苗移入基質(zhì)中培養(yǎng)120 d，不同菌根真菌接菌處理的鐵皮石斛幼苗表現(xiàn)出不同的生長情況。33株菌根真菌中篩選出11株菌株對鐵皮石斛有促生作用，其中DCsh-4和QHsh-5菌株對鐵皮石斛幼苗的促生效果最為明顯，接種該菌株的鐵皮石斛幼苗出現(xiàn)許多新的分蘗，長成新的植株，莖葉濃綠，葉片較大（圖2）；接入CZsh-3-4和QHsh-5菌株的鐵皮石斛幼苗莖稈明顯增粗伸長，并出現(xiàn)開花現(xiàn)象（圖3）。即DCsh-4、QHsh-5和CZsh-3-4這3株菌株能提高鐵皮石斛分蘗能力和根系生長。

對用不同菌根真菌處理的鐵皮石斛幼苗的凈生長量和生長率進(jìn)行統(tǒng)計，11株處理苗的幼苗平均生長率均高于CK，且與CK相比，DCsh-4、GSsh-15、CZsh-3-4、QHsh-3、QHsh-15和NBsh-1-3接種的鐵皮石斛生長率顯著提高（表2）。

2.4 不同菌根真菌對鐵皮石斛生理指標(biāo)的影響

2.4.1 葉綠素含量 "不同菌根真菌對鐵皮石斛葉綠素含量的影響不同（表3）。11株菌根真菌處理的鐵皮石斛幼苗葉色濃綠，生長健壯，葉綠素含量均高于CK。其中CZsh-3-2和LBsh-2-4菌根真菌處理的鐵皮石斛幼苗，葉綠素含量顯著高于CK，其葉綠素平均積累量達(dá)1.235和1.234 mg/g。這說明鐵皮石斛促生菌根真菌能夠提高鐵皮石斛的葉綠素含量，進(jìn)而提高鐵皮石斛光合作用能力，促進(jìn)有效成分的合成和積累，提高鐵皮石斛的品質(zhì)，這與李景蕻等[7]的研究結(jié)果一致。

2.4.2 丙二醛（MDA）含量 "MDA含量的變化是植物質(zhì)膜損傷程度的重要標(biāo)志，MDA含量的高低表示植物細(xì)胞膜脂過氧化程度，是反映鐵皮石斛抗氧化能力的重要參數(shù)[8-10]，在鐵皮石斛中，MDA的含量越小說明其抗氧化能力越強(qiáng)。在11株菌根真菌處理的鐵皮石斛幼苗中，除NBsh-1-3外，其他所有處理MDA含量均低于CK。特別是LBsh-2-4菌根真菌接菌處理鐵皮石斛幼苗中MDA的含量顯著低于CK，均值為8.957 mmol/（g·FW）（表3）。促生菌根真菌能提高鐵皮石斛的抗氧化能力，增強(qiáng)對環(huán)境的適應(yīng)性，增強(qiáng)抗逆性。

2.4.3 過氧化物酶（POD）活性 "POD活性在植物生長發(fā)育過程中不斷發(fā)生變化[11]。一般在老化組織中活性較強(qiáng)，幼嫩組織中活性較弱[12]，即POD活性反映植物老化程度。11株促生菌根真菌處理的鐵皮石斛幼苗POD活性均低于CK，其中，QHsh-3和NBsh-1-6菌根真菌接菌處理的鐵皮石斛幼苗中POD活性較CK顯著降低，均值為2.167和2.333 IU/mL。促生菌根真菌有利于鐵皮石斛延緩老化，保持旺盛生長。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從23種石斛屬植物根系中分離純化菌根真菌68株，將其接種到DE共生培養(yǎng)基中與鐵皮石斛組培苗共生培養(yǎng)，初步篩選出與鐵皮石斛共生的菌根真菌33株。通過鐵皮石斛菌根化栽培與接種菌餅栽培后進(jìn)行生長特性、相關(guān)酶活測定等篩選出促生菌根真菌11株。本試驗(yàn)分離篩選出的11株菌株能與鐵皮石斛幼苗生長形成共生關(guān)系，其中明顯提高鐵皮石斛幼苗生長率的菌株是DCsh-4、QHsh-5、CZsh-3-4和QHsh-3等；明顯提高鐵皮石斛幼苗葉綠素含量的菌株是CZsh-3-2、LBsh-2-4、NBsh-1-3和CZsh-3-4等；明顯降低MDA含量的菌株有LBsh-2-4、NBsh-1-6、NBsh-1-25和GSsh-14-1等；明顯降低POD活性的菌株是QHsh-3、NBsh-1-6、NBsh-1-25和DCsh-4等。通過生長率、葉綠素、MDA和POD等指標(biāo)測定，對鐵皮石斛促生作用顯著的菌株有DCsh-4、CZsh-3-4、QHsh-3、LBsh-2-4、NBsh-1-6和NBsh-1-25。

鐵皮石斛幼苗接種菌根真菌后，表現(xiàn)出的促生作用不盡相同，有些菌株能促進(jìn)幼苗生長，有些能降低其MDA和POD活性。DCsh-4和QHsh-3菌株既提高了生長率又降低POD活性；CZsh-3-4菌株既提高了生長率又增加了葉綠素含量；LBsh-2-4菌株既增加了葉綠素含量又降低了MDA含量；NBsh-1-6和NBsh-1-25菌株都降低了MDA含量和POD活性。這說明菌根真菌作用于鐵皮石斛幼苗，有些菌株能促進(jìn)生長，有些能提高其抗逆性，篩選出的6種真菌既能促生又能增強(qiáng)其幼苗抗逆性。在今后的試驗(yàn)中，可進(jìn)一步確定其作用機(jī)理。

本試驗(yàn)中接菌僅用了單一的菌株，而鐵皮石斛根系中分離菌根真菌時，常能從單株中分離出2種或2種以上的真菌，說明共生真菌在鐵皮石斛根系中普遍存在。促生作用可能是多種菌根真菌共同作用的結(jié)果，后期的試驗(yàn)中可進(jìn)行2種及以上的菌株混合接種，并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定，以探索混合接種對鐵皮石斛幼苗的促生作用效果。

本試驗(yàn)篩選出的促生菌株未進(jìn)行分子鑒定和生物學(xué)特性觀察，后期試驗(yàn)需鑒定出具體的種名及生物學(xué)特性觀察，以便進(jìn)一步揭示菌根真菌的特性，有利于后期開發(fā)專用的菌根真菌菌劑、菌肥，應(yīng)用于大田生產(chǎn)栽培。

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（責(zé)編：李 媛）