桃樹病毒病RNA-seq檢測分析

摘要 選擇一桃園內(nèi)的17份樣品，利用轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)行病毒及類病毒鑒定，并用qRT-PCR驗證特定病毒的檢測情況。結(jié)果表明，在17份樣品中，共檢出10種病毒，其中柑橘裂皮類病毒（CEVd）和桃病毒T（PeVT）感染率分別為58.82%和47.06%；其他8種病毒的感染率為5.88%～17.56%。17份樣品中，僅1份種質(zhì)沒有病毒檢出；有8份種質(zhì)感染1種病毒；其余8份種質(zhì)感染2～5種病毒。研究了解了桃產(chǎn)業(yè)的病毒病感染情況，對提出相應(yīng)的防治措施提供參考。

關(guān)鍵詞 桃；柑橘裂皮類病毒；轉(zhuǎn)錄組測序；熒光定量PCR

中圖分類號 S662.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）23-24-0123-05

The virus detection and analysis based on RNA-seq technology of peach crop

HAO Mingyue1 " "MA Xiaofeng2 " "DU Mo3*

（1Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， China;

2Agriculture and Rural Bureau of Huishan District， Wuxi 214174， China;

3Agricultural Technology Extension Service Station in Huishan District， Wuxi 214174， China）

Abstract A total of 17 samples from a peach orchard were selected to perform transcriptome sequencing to detect viruses and viroids. After that， a quantitative RT-PCR was used to verify the detection of specific viruses. The results showed that a total of 10 viruses were detected in these samples， among which the infection rates of Citrus exocortis viroid （CEVd） and Peach virus T （PeVT） were 58.82% and 47.06%， respectively. The infection rate of the other 8 viruses ranges from 5.88% to 17.56%. Out of 17 samples， only 1 haven't found any virus， 8 germplasms were infected with 1 virus. The remaining 8 samples were infected with 2-5 viruses. The research results has gained an understanding of the virus infection situation in the peach industry， laying a theoretical foundation for proposing corresponding prevention and control measures.

Keywords peach；Citrus exocortis viroid；RNA-seq；fluorescence quantitative PCR

病毒是非常微小的生命體，與人類生活息息相關(guān)。果樹受植物病毒感染時，會出現(xiàn)壽命縮短、生長衰退、抗逆性減弱、產(chǎn)量降低和品質(zhì)變劣，其生產(chǎn)效益明顯下降等。樹體一旦被侵染，將長期帶毒，持續(xù)危害，采用化學(xué)藥劑很難進(jìn)行有效控制。目前果樹病毒性病原檢測方法主要包括指示植物法、電子顯微鏡觀察法、免疫學(xué)方法以及以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測方法等。其中指示植物法檢測速度慢，電子顯微鏡觀察法對儀器條件要求高，免疫學(xué)檢測法目標(biāo)病毒少，分子生物學(xué)檢測法在近年來較為常用。基于分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測方法，可細(xì)分為定量PCR（qRT-PCR）、普通轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）和small RNA測序等[1]，在生產(chǎn)中均有應(yīng)用。

桃在生長發(fā)育過程中易受多種病毒的侵染，目前已鑒定的桃病毒及類病毒36種[2]。其中李痘病毒（Plum pox virus，PPV），主要通過嫁接或蚜蟲傳播，會引起寄生植物葉片扭曲褪綠、葉脈黃化、果實畸形和變小、葉面出現(xiàn)萎黃斑等癥狀，嚴(yán)重的還會導(dǎo)致果實成熟前大量脫落；桃潛隱花葉類病毒（Peach latent mosaic viroid，PLMVd）主要通過嫁接傳播，會引起桃葉片、枝干和果實白化，花葉黃化和褪綠等癥狀[3]。病毒病感染后通常會影響果實產(chǎn)量和品質(zhì)，縮短果園的生產(chǎn)年限，造成經(jīng)濟損失。

在桃上，有不少利用轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)行病毒檢測的報道。如He等[4]對表現(xiàn)小果、裂果癥狀的桃樹進(jìn)行小RNA測序，除了已知的病毒外，還發(fā)現(xiàn)了一種新的蠶豆萎蔫病毒屬病毒。周俊[5]通過分析桃不同種的病毒攜帶情況，發(fā)現(xiàn)普通桃檢出的病毒種類明顯多于光核桃、山桃和甘肅桃，其中光核桃、山桃、甘肅桃和普通桃中均檢出的病毒有桃相關(guān)黃癥病毒屬病毒和桃潛隱花葉類病毒，說明這兩類病毒可能在桃馴化早期已經(jīng)存在于其野生近緣種中，并隨著桃樹的演化途徑進(jìn)行傳播。

本研究選擇一老桃園，隨機采集17棵單株，采用RNA-seq鑒定其病毒攜帶情況，并采用qRT-PCR進(jìn)行驗證，了解該地區(qū)果樹病毒病發(fā)生現(xiàn)狀，為果園的安全生產(chǎn)提供建議。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用隨機取樣法，在一老桃園內(nèi)，采集17份種質(zhì)（樹齡15年，栽培管理一致，砧木為新疆毛桃）的幼嫩葉片，部分葉片黃化疑似感染病毒（圖1）。幼葉用液氮冷凍后，置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取 "使用RNA快速提取試劑盒（華越洋，北京，中國）提取供試樣品的RNA，具體步驟參見試劑盒使用說明書。提取的總RNA置于-80 ℃冰箱備用，測序前檢測RNA的純度及完整性。

1.2.2 普通轉(zhuǎn)錄組測序 "提取的RNA由北京諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行建庫測序。主要建庫方法如下：在RNA反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA后，經(jīng)過末端修復(fù)、加polyA尾并連接測序接頭，篩選其中250～300 bp的cDNA，進(jìn)行PCR擴增并純化，構(gòu)建的文庫用Hiseq Xten測序。

普通轉(zhuǎn)錄組測序完成后，去除接頭，去除含N的reads，去除低質(zhì)量的reads，然后將純凈reads進(jìn)行簡單組裝并比對至GenBank Virus RefSeq Nucleotide，統(tǒng)計出其中與病毒序列相似性E值≤1.0E-10，Identity≥90%的reads數(shù)，計算各病毒的峰度。

1.2.3 qRT-PCR驗證 "針對前期轉(zhuǎn)錄組檢測結(jié)果，選擇其中的PLMVd，設(shè)計引物進(jìn)行qRT-PCR驗證。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，qRT-PCR擴增使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase試劑盒（Vazyme，南京，中國）進(jìn)行，總體系50 μL。PCR反應(yīng)程序為95 ℃ 5 min預(yù)變性；95 ℃ 10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，45個循環(huán)；72 ℃共5 min。當(dāng)PCR的CT值在15～35，認(rèn)定該樣品被病毒感染；超過35則認(rèn)為病毒含量過低，認(rèn)定為無病毒檢出。具體引物序列如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序

供試的17份樣品測序共獲得805 918 176個原始reads，其中低質(zhì)量的reads占比0.44%，標(biāo)記為N即序列缺失的reads占比0.14%，接頭污染的reads占比為4.46%。

去除上述3種類型的序列后，純凈reads達(dá)到94.96%，總測序量達(dá)到114.79 Gb，平均測序量為6.75 Gb（表2），數(shù)據(jù)量足夠用于分析病毒攜帶情況。

2.2 轉(zhuǎn)錄組檢測病毒

將純凈reads組裝后與NCBI的病毒庫進(jìn)行比對，如圖2所示，樣品紅油桃6號組裝后的contigs與桃病毒T（Peach virus T，PeVT）具有較高的相似性，即認(rèn)為該樣品感染了PeVT病毒。

如表3所示，17份樣品共檢測出10種病毒，總體帶毒率達(dá)到94.12%。其中CEVd感染率高達(dá)58.82%；PeVT感染率為47.06%；其次為PLMVd、亞洲李屬病毒（Asian prunus virus，APV）和櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（Cherry green ring mottle virus，cgrmv），感染率均為17.65%；再次為啤酒花矮化類病毒（Hop stunt viroid，HSVd）、李屬壞死環(huán)斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV）和桃病毒D（Peach virus D，PeVD），感染率均為11.76%；蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）和桃病毒1（Peach virus 1，PeV1）的感染率較低，僅在萬州酸桃上有檢出。在17份樣品中，僅有1份種質(zhì)（早桃）沒有病毒檢出；有8份種質(zhì)僅有1種病毒檢出；有8份種質(zhì)為復(fù)合侵染，其中，紅油桃6號感染病毒最多，達(dá)到5種。

2.3 驗證病毒結(jié)果

為驗證RNA-seq鑒定病毒的準(zhǔn)確性，用qRT-PCR的方法進(jìn)行上述鑒定結(jié)果的驗證。選取了上述樣品中的前8份種質(zhì)，設(shè)計針對PLMVd的引物進(jìn)行擴增，結(jié)果顯示在供試樣品中，除第1、7份種質(zhì)外，第6份種質(zhì)同樣檢出了PLMVd，與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果有一定差異，實際應(yīng)用中，應(yīng)進(jìn)行重復(fù)檢測，確保結(jié)果準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論與討論

桃是重要的經(jīng)濟樹種，在長期的嫁接繁殖過程中，病毒不斷傳播積累，可能引起新定植的果園葉片褪綠、斑駁、卷曲，果實畸形、落果和樹勢下降，病毒病是影響桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一[6]。

在高通量測序出現(xiàn)之前，對于植物上病毒和類病毒的鑒定常采用qRT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）進(jìn)行[7-8]。然而，這些方法只能鑒定已知的病毒和類病毒，無法鑒定未知的病毒。采用二代測序技術(shù)（NGS）能克服上述方法的缺點[9]，如Villamor等[10]采用NGS分析了油桃導(dǎo)致莖痘病癥狀的可能病毒，Bag[11]和Wu等[12]鑒定了油桃上的黃癥病毒。此外，He等采用NGS首次發(fā)現(xiàn)豆科病毒也可能感染桃[4]；Igori等[13]對玉米雷亞朵非納病毒屬新的成員桃病毒D（PeVD）進(jìn)行了序列分析。本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序方法，一次性鑒定出的病毒種類較多，不同種質(zhì)共10種，單份種質(zhì)達(dá)到5種，在轉(zhuǎn)錄組測序成本大幅下降的情況下，效率更高。

本研究中，17份樣品共檢出了10種病毒，其中PNRSV、CGRMV、HSVd、PLMVd和ACLSV在相關(guān)研究報道中比較常見，部分病毒如PeVD[13]和PeV1[14]是近年來報道的，在17份樣品中僅檢出1～2次，表明其感染情況并不嚴(yán)重。然而，CEVd在桃上報道較少，但在本研究的17份樣品中，有10份材料感染。CEVd多數(shù)商品化柑橘呈潛隱癥狀，其弱毒株系常引起矮化癥狀，強毒株系則引起裂皮癥狀。1991年，馬修理等[15]對湖南、湖北和四川地區(qū)245個植株進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)柑橘的裂皮類病毒帶毒率為87%～100%，可見該病毒在柑橘上已經(jīng)大面積傳播。在其他果樹上也有檢出該病毒的報道，García-Arenal等從西班牙、Rezaian等從澳大利亞的葡萄上均檢出了該病毒[16-17]。舒靜[18]采用qRT-PCR對來自鄭州和湖北的40份葡萄樣品進(jìn)行CEVd的檢測，首次報道其中2份樣品感染該病毒。吳斌等[19]通過對山東境內(nèi)149份疑似感染病毒的葡萄進(jìn)行5種類病毒檢測，未檢測出CEVd，表明被檢測樣品僅受到GYSVd1、GYSVd2、AGVd和HSVd的侵染。本研究結(jié)果顯示，CEVd在桃樹上的感染率較高，雖然在田間并沒有觀察到明顯的裂皮癥狀，栽培者需高度重視。

病毒感染會影響樹體生長和產(chǎn)量[20]，有研究者還分析了病毒感染對寄生基因表達(dá)的影響。Rubio等[21]以健康葉片為對照，對感染PPV病毒的桃GF305的葉片進(jìn)行RNA-Seq研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有癥狀的樣本中，1.04%的測序序列與PPV具有較高的同源性，而該比例在無癥狀的葉片中僅為0.00 002%。對PPV病毒相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)對生物脅迫的響應(yīng)、脂質(zhì)和碳水化合物代謝以及催化活性的負(fù)調(diào)控顯著富集。在侵染早期鑒定到的差異基因較多，其功能與病原的誘導(dǎo)和抗性形成有關(guān)，如茉莉酸、幾丁質(zhì)酶、細(xì)胞分裂素、葡糖基轉(zhuǎn)移酶和Lys-M蛋白。一旦病毒積累到一定程度，編碼Dicer蛋白的基因高表達(dá)，可能通過誘導(dǎo)基因沉默來參與植物抵抗病毒的感染。理解該過程，對于揭示桃與PPV互作的分子機制，研發(fā)相應(yīng)的調(diào)控措施具有重要意義。

生物學(xué)防治是目前病毒病管理的主要手段，如發(fā)現(xiàn)病樹應(yīng)立即鏟除銷毀，防止傳染，也不能在病園內(nèi)采集接穗進(jìn)行擴繁。但許多果樹病毒是潛隱性，且和生理性病害有相似的癥狀，因此果農(nóng)通常忽略和錯失防治時機。從技術(shù)手段上來說，通過熱處理或莖尖培養(yǎng)脫除病毒，是防止病毒病發(fā)生，實現(xiàn)早果、豐產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的重要途徑，但目前桃的脫毒技術(shù)成熟度有待提高，報道較少[22]，在生產(chǎn)中鮮見應(yīng)用。可以實行的方法是切斷傳播媒介，例如，使用工具注意消毒，增強樹勢提高樹體自身抗病毒能力，抑制果園內(nèi)病毒的蔓延速度。此外，選育抗性種質(zhì)，是病毒病防治較為有效的手段[23]，如Polak等[24]選擇桃的種間雜交材料如Barier、Fire、Cadaman、GF-677和李屬的其他雜交后代如MRS、NBS 540-73和Pumiselect，然后嫁接到人工接種PPV的砧木上，經(jīng)過6年的評價，發(fā)現(xiàn)桃和扁桃的雜種GF-677對PPV高抗，桃和山桃的雜種Cadaman以及桃和扁桃的雜種Fire對PPV抗性稍次，是未來進(jìn)行抗病育種的優(yōu)異親本材料。在本研究中，雖然早桃沒有病毒檢出，但其是否是抗性種質(zhì)，尚需要進(jìn)行人工接種鑒定進(jìn)行確認(rèn)。

隨著基因組學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇可以有效地提高抗病毒優(yōu)系的選擇效率，針對抗病毒性狀進(jìn)行標(biāo)記開發(fā)已有初步研究。如Cirilli等[25]首先完成了85份意大利桃種質(zhì)的抗PPV評價，然后利用1個自主開發(fā)的桃9K SNP芯片進(jìn)行基因分型，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），將抗性位點定位在桃第2染色體9 Mb（標(biāo)記為SNP_IGA_214703）和第3染色體的26 Mb（標(biāo)記為SNP_IGA_366639）處，通過對比抗病種質(zhì)Kamarat和感病種質(zhì)在定位區(qū)間的遺傳變異，初步篩選出RTM2-like為抗病候選基因，其第2個外顯子上63 bp的缺失與抗性連鎖，該位點可以開發(fā)為有效的標(biāo)記在抗PPV種質(zhì)育種中進(jìn)行后代篩選。

參考文獻(xiàn)

[1] 許云霄.不同病害癥狀油桃的病毒群體分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2019.

[2] RUBIO M，MARTíNEZ G P，MARAIS A，et al.Recent advances and prospects in prunus virology[J].Annals of applied biology，2017，171（2）：125-138.

[3] 楊樹俊，王華，付世峰.病毒病對蘋果生長和結(jié)實的影響[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)（自然科學(xué)版），2001，47（9）：42-43.

[4] HE Y，CAI L，ZHOU L L，et al.Deep sequencing reveals the first fabavirus infecting peach[J].Scientific reports，2017，7：11329.

[5] 周俊.桃及其野生近緣種中病毒組研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2020.

[6] 董曉民，張毅，劉偉，等.桃病毒病及檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].北方園藝，2016（3）：199-203.

[7] NASSUTH A，POLLARI E，HELMECZY K，et al.Improved RNA extraction and one-tube RT-PCR assay for simultaneous detection of control plant RNA plus several viruses in plant extracts[J].Journal of virological methods，2000，90（1）：37-49.

[8] KOENIG R，PAUL H L.Variants of elisa in plant virus diagnosis[J].Journal of virological methods，1982，5（2）：113-125.

[9] BARBA M，CZOSNEK H，HADIDI A.Historical perspective， development and applications of next-generation sequencing in plant virology[J].Viruses，2014，6（1）：106-136.

[10] VILLAMOR D E V，MEKURIA T A，PILLAI S S，et al.High-throughput sequencing identifies novel viruses in nectarine： insights to the etiology of stem-pitting disease[J].Phytopathology，2016，106（5）：519-527.

[11] BAG S，AL RWAHNIH M，LI A，et al.Detection of a new luteovirus in imported nectarine trees： a case study to propose adoption of metagenomics in post-entry quarantine[J].Phytopathology，2015，105（6）：840-846.

[12] WU L P，LIU H W，BATEMAN M，et al.Molecular characterization of a novel luteovirus from peach identified by high-throughput sequencing[J].Archives of virology，2017，162（9）：2903-2905.

[13] IGORI D，LIM S，BAEK D，et al.Complete nucleotide sequence and genome organization of peach virus D， a putative new member of the genus Marafivirus[J].Archives of virology，2017，162（6）：1769-1772.

[14] ZHOU J，CAO K，ZHANG Z X，et al.Identification and characterization of a novel rhabdovirus infecting peach in China[J].Virus research，2020，280：197905.

[15] 馬修理，葛宗民，周詠芝，等.柑橘裂皮病發(fā)生情況調(diào)查[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，1991，30（12）：20.

[16] GARCíA A F，PALLáS V，F(xiàn)LORES R.The sequence of a viroid from grapevine closely related to severe isolates of Citrus exocortis viroid[J].Nucleic acids research，1987，15（10）：4203-4210.

[17] REZAIAN M A，KOLTUNOW A M，KRAKE L R.Isolation of three viroids and a circular RNA from grapevines[J].The journal of general virology，1988，69（Pt 2）：413-422.

[18] 舒靜.來源于柑橘和葡萄的類病毒的檢測與序列分析[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[19] 吳斌，馮佳，張眉，等.山東鮮食葡萄主要類病毒的鑒定及序列分析[J].果樹學(xué)報，2018，35（8）：928-935.

[20] 陳玫勛，陳貴明.桃樹主要病害的發(fā)生與防治[J].植物醫(yī)生，2003，16（3）：16-17.

[21] RUBIO M，RODRíGUEZ-MORENO L，BALLESTER A R，et al.Analysis of gene expression changes in peach leaves in response to Plum pox virus infection using RNA-Seq[J].Molecular plant pathology，2015，16（2）：164-176.

[22] 李青，覃蘭英，鄧世秀.桃樹的病毒病及脫毒苗培育[J].北方果樹，1993（3）：6-8.

[23] PASCAL T，PFEIFFER F，KERVELLA J.Preliminary observations on the resistance to sharka in peach and related species[J]. Acta horticulturae，2002（592）：699-704.

[24] POLáK J，OUKROPEC I. Identification of interspecific peach and Prunus sp. hybrids resistant to Plum pox virus infection[J]. Plant protection science，2010，46（4）：139-144.

[25] CIRILLI M，ROSSINI L，GEUNA F，et al. Genetic dissection of Sharka disease tolerance in peach（P.persica L.Batsch）[J]. BMC plant biology，2017，17（1）：192.

（責(zé)編：李 媛）