基于Nrf2/HO-1信號通路探討阿托伐他汀對急性心肌梗死大鼠模型心肌細胞的影響

孫向華,楊 菲

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是指因持久而嚴重的心肌缺血所致的部分心肌急性壞死,伴隨病情進展快等特異性[1],病人伴有胸骨處疼痛,疼痛程度劇烈且持續時間長,嚴重者會猝死。心肌缺血缺氧后氧化應激反應的過度激活是引起心肌損傷的重要病理環節[2-3],該環節涉及多個生物學環節,其中,核因子E2相關因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)通路的過度激活是重要表現之一。Nrf2/HO-1信號通路與氧化應激反應密切相關[4-5],氧化應激過度激活時,氧自由基過度釋放,受到刺激的Nrf2表達隨之增加,并與Keap1解離,啟動HO-1基因里的抗氧化元件,降低氧化應激和炎性因子水平,保護血管內皮細胞和心肌細胞[6],且Nrf2/HO-1通路在AMI心肌細胞損傷和凋亡中起重要作用。阿托伐他汀(atorvastatin,ATV)是調脂藥物,多用于治療冠心病、腦卒中、高膽固醇血癥等疾病[7-9]。研究表明,阿托伐他汀能夠緩解因AMI引起的心肌細胞損傷,其機制可能與Nrf2/HO-1信號通路有關[10]。本研究通過動物模型,基于Nrf2/HO-1信號通路探討阿托伐他汀對AMI大鼠心肌細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗大鼠30只,體質量(150±20)g,購自河南省實驗動物中心,許可證號:SCXK(豫)2017-0001,于普通級環境下動物房飼養,鼠籠整潔,室內安靜,溫度保持在15～25 ℃,空氣流通干燥。

1.2 藥物、試劑與儀器 阿托伐他汀(成都德思特生物技術有限公司);小動物呼吸機(型號:RWD407,上海寰熙醫療器材有限公司);MD3000/8型生物機能實驗系統(東莞市譜標實驗器材科技有限公司);蘇木精(CAS:517-28-2,上海博耀生物科技有限公司)、0.5%伊紅水溶液(CAS:17372-87-1,上海源葉生物有限公司);酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒、脫氧核苷酸末端轉移酶(TdT)介導的核苷酸(dUTP)缺口末端標記法(TUNEL)試劑盒(上海酶研生物科技有限公司)。酶標儀、組織勻漿機(東莞市譜標實驗器材科技有限公司);RIPA裂解緩沖液(型號:Amresco N653,上海玉博生物科技有限公司);二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、抗體、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(上海通蔚生物科技有限公司);顯微鏡。

1.3 動物造模 參照文獻[11]相關步驟進行造模,先將實驗大鼠麻醉,通過大鼠的四肢進行心電圖檢測。給大鼠接通呼吸機,隨后進行開胸手術,打開心包,對左前降支進行結扎,結扎后大鼠心臟表面顏色發生變化,紅色加深,心電圖顯示ST段異常抬高。結扎30 min后撤掉結扎線,使血液重新運行后關胸。手術結束后注射青霉素防止術后感染。假手術(sham)組大鼠只開胸不進行任何操作。ATV組大鼠連續1周使用10 mg/kg ATV灌胃,sham組、AMI組用相同劑量生理鹽水灌胃,每日1次。

1.4 心功能指標監測 左心室收縮末期壓力(LVESP)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)、左心室內壓上升/下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.5 心肌梗死面積測定 實驗大鼠注射死亡,取其心臟,留結扎線至心尖部分制作標本,根據蘇木素-伊紅(HE)染色結果測算梗死面積。

1.6 心肌細胞凋亡情況 取大鼠心肌組織制作切片,將制作好的切片放入37 ℃混合工作溶液孵育、修復15 min。加入50 μL的TUNEL反應溶液,在37 ℃下孵育1 h,使用PBST洗滌切片。加入100 μL的二氨基聯苯胺在37 ℃下孵育30 min,PBST洗滌,通過顯微鏡計算凋亡指數,取3次平均值。

1.7 免疫組化檢測細胞色素C陽性染色 取大鼠心臟組織,固定在4%多聚甲醛中約18 h,進行細胞色素C的免疫組化檢測,部分切片用于對照實驗。按照 SABC免疫組化試劑盒說明書進行操作, 一抗為抗細胞色素C單克隆抗體,工作濃度為 1∶200,二抗為山羊抗小鼠/兔IgG。圖像分析與計算:LEICA DM LB2顯微鏡下觀察,拍照,運用LeicaQWinV3圖像分析軟件計算細胞色素C陽性染色區。

1.8 白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平檢測 收集大鼠血液,離心后取血清。測定IL-6、TNF-α、SOD、MDA,實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.9 心肌梗死組織Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達水平檢測 從梗死邊界區獲得心肌組織,用組織勻漿機均勻研磨。蛋白濃度通過雙BCA試劑盒測量,分別取總量為40 μg的總蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進行濕轉移,在5%牛血清白蛋白(BSA)中于室溫孵育1 h。將1∶500稀釋的anti-Nrf2、anti-HO-1添加到分離的蛋白質中,在4 ℃下孵育過夜。洗滌后在室溫下添加二抗孵育1 h后,加入化學發光試劑進行顯影。三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)用作內部參考,用Image J軟件分析目標條帶的灰度值。

2 結 果

2.1 3組心功能指標比較 與sham組比較,AMI組LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低,LVEDP增加;與AMI組比較,ATV組LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax增加,LVEDP降低。詳見表1。

表1 3組心功能指標比較(±s)

2.2 3組心肌梗死面積比較 sham組未出現心肌梗死;與AMI組相比,ATV組大鼠心肌梗死面積降低。詳見表2、圖1、圖2。

表2 3組大鼠心肌梗死面積比較(±s) 單位:%

圖1 HE染色觀察大鼠心肌梗死面積

圖2 超聲影像觀察大鼠心肌梗死面積

2.3 3組大鼠心肌細胞凋亡指數比較 與sham組相比,AMI組大鼠心肌細胞凋亡指數增加,與AMI組比較,ATV組心肌細胞凋亡指數降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3、圖3。

表3 3組大鼠心肌細胞凋亡指數比較(±s)

2.4 細胞色素C陽性染色 sham組未出現明顯細胞色素C的陽性染色;AMI組梗死區心肌細胞免疫反應性均明顯增強,并呈現片狀染色;ATV組細胞色素C的陽性染色較AMI組減弱,呈深棕色。詳見圖4。

圖4 細胞色素C陽性染色

2.5 3組大鼠IL-6、TNF-α、SOD、MDA水平比較 與sham組相比,AMI組IL-6、TNF-α、MDA水平升高,SOD水平降低;與AMI組相比,ATV組IL-6、TNF-α、MDA水平降低,SOD水平升高。詳見表4。

表4 3組大鼠IL-6、TNF-α、SOD、MDA水平比較(±s)

2.6 3組大鼠心肌梗死組織Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達比較 與sham組比,AMI組Nrf2及HO-1水平降低;與AMI組相比,ATV組Nrf2及HO-1水平升高。詳見表5、圖5。

表5 3組大鼠心肌梗死組織Nrf2/HO-1通路蛋白表達比較(±s)

圖5 Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達條帶圖

3 討 論

AMI是因短時間內冠狀動脈快速閉塞導致相應灌注區域出現心肌缺血壞死[12]。AMI后會出現氧化應激反應,而在這個過程中,氧自由基會異常活躍,其過度釋放及強氧化性的特點使得心肌細胞膜中的脂質受到破壞,進而破壞細胞膜的結構。心肌細胞膜中的脂質與氧自由基結合,在這個過程中產生了大量的MDA,也損耗了心肌組織中擁有抗氧化作用的代謝酶SOD與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)[14]。阿托伐他汀在臨床上多作為調脂藥物使用。韓曉濤等[15]研究表明,阿托伐他汀對于心腦血管中的粥樣斑塊具有穩定作用,還能夠改善內皮功能、抗炎等。此外,阿托伐他汀還能夠緩解心力衰竭癥狀[16],實驗發現,對AMI大鼠模型進行阿托伐他汀治療連續4周后,模型大鼠的心室功能、心肌纖維化和心室肥大都得到了一定程度的改善,這一實驗結果表明,阿托伐他汀對于心肌梗死的治療具有重要意義[17]。本研究通過動物模型,基于Nrf2/HO-1信號通路探討阿托伐他汀對AMI大鼠心肌細胞的作用。

本實驗建立AMI大鼠模型,觀察3組大鼠心功能指標發現,AMI組大鼠LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax較sham組下降,而LVEDP較sham組增加;ATV組大鼠LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax較AMI組增加,LVEDP較AMI組降低。HE染色觀察大鼠心肌梗死面積發現,ATV組大鼠心肌梗死面積較AMI組減小。比較3組大鼠心肌細胞凋亡情況發現,AMI組大鼠心肌細胞凋亡指數較sham組增大,而ATV組心肌細胞凋亡指數較AMI組減小。免疫組化發現,sham組未出現明顯細胞色素C的陽性染色,AMI組梗死區心肌細胞免疫反應性均明顯增強并呈現片狀染色,ATV組細胞色素C的陽性染色較AMI組減弱,呈深棕色。提示阿托伐他汀能夠保護心功能,減少心肌梗死面積,緩解心肌細胞凋亡,這與Chen等[18]的研究結果相似。

AMI引起的心肌組織缺血會出現氧化應激反應,釋放出大量的氧自由基,而激活Nrf2/HO-1通路可以增加SOD、HO-1等抗氧化物質的表達,從而緩解細胞破壞和炎癥反應[19]。為深入了解阿托伐他汀對AMI大鼠的作用機制,對3組大鼠的血清炎性因子IL-6、TNF-α,氧化應激因子SOD、MDA及Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白進行檢測,發現AMI組大鼠IL-6、TNF-α、MDA水平較sham組升高,SOD水平較sham組下降;ATV組大鼠IL-6、TNF-α、MDA水平較AMI組下降,SOD水平較AMI組升高。AMI組大鼠Nrf2、HO-1蛋白表達水平較sham組降低,ATV組Nrf2、HO-1蛋白表達水平較AMI組升高。實驗結果表明,經阿托伐他汀治療后,大鼠Nrf2/HO-1通路相關蛋白表達增加,血清炎性因子IL-6、TNF-α及氧化應激因子MDA的水平下降,SOD水平增加,這與Sun等[20]研究結果相似。

綜上所述,阿托伐他汀緩解AMI大鼠氧化應激、炎癥反應、心肌損傷和心肌細胞凋亡等作用可能與Nrf2/HO-1通路有關,關于阿托伐他汀對AMI的影響及調控Nrf2/HO-1通路的機制仍需進一步研究。