電化學發光檢測法在梅毒抗體確證中的應用

陳邦銳，許婷婷，張紅，樂淼

（武漢血液中心，湖北 武漢 430030）

梅毒是一種可以通過輸血傳播的疾病，在采供血機構中，屬于國家規定的血液檢測的項目，近幾年來，無償獻血的報廢統計中，因梅毒陽性而報廢的比例逐漸增大[1-2]，超過HCV、HIV，嚴重威脅到血液安全。在我國采供機構的血液篩查實驗室，按照國家規定，梅毒檢測必須采用兩個不同廠家的酶聯免疫試劑同時檢測，任一試劑陽性則血液報廢，因為不同廠家抗原包被工藝不一樣，在檢測靈敏度特異性方面有所差異，所以存在一定比例的假陽性，這不僅浪費寶貴的血液資源，也給獻血者咨詢反饋帶來麻煩，給其帶來心理困擾，甚至家庭矛盾，嚴重影響了社會公眾對采供血機構的信任度。為此，筆者認為有必要對梅毒ELISA 初篩陽性的血液，做進一步的抗體確證，通常行業內一般采用TPPA 檢測作為梅毒抗體的確證實驗，但是該方法為手工操作，且人工肉眼判讀，更為經典的確證方法是免疫印跡，但是印跡法價格太貴，常規難以大量使用。因此，筆者通過不同方法學比對，意圖建立起適合本實驗室的確證策略，既操作規范，又可以批量檢測，為此引入電化學發光檢測，把TPPA、電化學發光、免疫印跡的檢測做一個比較，實驗過程如下。

1 材料與方法

1.1 標本 我中心ELISA 法檢出的331 份梅毒陽性標本包括初次雙試劑陽性標本、初次單試劑陽性重復檢測仍為陽性標本 （包括灰區值，S/CO＞0.7）。

1.2 試劑 梅毒螺旋體雙抗原夾心法試劑盒（廈門新創），批號2018097525、批號2019027504；梅毒螺旋體雙抗原夾心法試劑盒 （廣州麗珠），批號2018030308、批號2019010108；TPPA 試劑：日本富士瑞必歐株式會社試劑盒，試劑批號VN81025；羅氏電化學發光梅毒抗體試劑，試劑批號44379703；德國歐蒙免疫印跡梅毒抗體檢測試劑，其中IgG 抗體檢測試劑批號D190417AL、IgM 抗體檢測試劑批號D190417AM；所有試劑均為批批檢合格并在有效期內使用。

1.3 儀器設備 FAME 全自動酶免分析儀 （瑞士HAMILTON24/20）；STAR 加樣儀 （瑞士HAMILTON）；羅氏電化學發光檢測儀e602 ；廣州麗珠梅毒免疫印跡檢測儀；洗板機 （TECAN）；酶標儀（SUNRISE）；離心機（SORVAL）；混旋儀。

1.4 方法 收集雙試劑梅毒陽性標本、單試劑梅毒陽性重復檢測仍為陽性標本，同時進行TPPA 確證試驗、電化學發光檢測，不一致樣本再做梅毒免疫印跡檢測（IgG/IgM）。(1)TPPA 檢測時嚴格按照試劑盒說明書進行操作。TPPA 步驟如下：室溫條件下在U 型板上用稀釋液依次倍比稀釋樣本，然后分別加入未致敏和致敏明膠顆粒，振蕩混合30 s，加蓋后于室溫（15～30℃）下水平靜置。2 h 后，在觀察鏡上記錄并觀察其反應圖像，進行測定結果的判定。(2)梅毒電化學發光：在羅氏電化學發光檢測儀實現自動化加樣、檢測，原理如下：第1 次孵育，10 μL 樣本、生物素化的TP 特異性重組抗原和釕復合物標記的TP 特異性重組抗原反應形成一種夾心復合物。第2 次孵育，加入包被鏈霉親合素的磁珠微粒后，該復合物通過生物素與鏈霉親合素的相互作用與固相結合。將反應混合液吸入測量池中，通過電磁作用將微粒吸附在電極表面。給電極加以一定的電壓，使復合物化學發光，并通過光電倍增器測量發光強度。儀器通過Elecsys 軟件自動計算檢測結果。(3)免疫印跡均按照儀器說明書操作，當印跡膜上出現2 條及以上特異抗原條帶顯色時，判為陽性，當無特異性抗原條帶顯色時結果為陰性。

1.5 統計學分析 采用SPSS 20.0 進行數據處理，卡方檢驗，計數資料以率（%）表示，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

梅毒ELISA 檢測陽性樣本的TPPA 確證結果和ECLIA 結果比較，二者檢測有顯著差異,見表1。不同區間ECLIA 檢測值與TPPA 結果對應關系見表2，可以看出當反應值大于5 時，ECLIA 與TPPA符合性很高，當S/CO 值小于5 時，二者才有差異；15 例TPPA 和ECLIA 不一致樣本進一步做免疫印跡最終確證（WB），可以看出ECLIA 僅存在假陽性，而TPPA 既有假陽性又有假陰性，見表3。

表1 TPPA 確證結果和ECLIA 結果比較

表2 ECLIA 檢測值區間與TPPA 結果比較

3 討論

梅毒是一種常見的傳染性疾病，可以通過輸血傳播，因此國家衛生部門將其作為常規必檢項目。近年來，在采供血機構的相關文獻中，均有報道，梅毒陽性在無償獻血中的血液報廢中占有比例在升高，其中一個原因是乙肝疫苗的全面接種導致人群乙肝感染率下降，另外梅毒通過親密接觸、性途徑傳播速度在增加[3]，導致梅毒陽性占總陽性的比例在增加。因此，采供血機構采用國家規定且符合要求的ELISA 試劑，兩個不同廠家的梅毒試劑同時檢測，任一廠家試劑陽性，則該樣本均判為陽性，ELISA 試劑檢測具有操作簡便，易于自動化，大批量檢測，大通量，高效率，高靈敏度的優點，廣泛在血站實驗室使用。但是，由于不同廠家在制備工藝、抗原包被方面，存在差異，導致有假陽性的產生，這個給獻血者咨詢和回復帶來困擾，假陽性的結果給獻血者帶來巨大心理壓力，甚至家庭矛盾，獻血者在臨床醫院檢測后顯示梅毒抗體為陰性，又直接影響到社會大眾對采供血行業的信任度，給無償獻血宣傳帶來不利影響。為此，為了珍惜寶貴的血液資源，針對獻血者獻血后的關愛服務工作也相繼開展，特別是獻血者歸隊確認，要求血站實驗室對獻血者歸隊樣本進行確認檢測，以保證血液安全可靠，恢復獻血者獻血資格。筆者在本文主要探討梅毒ELISA 初次陽性獻血者的抗體確證工作，一般血站均采用TPPA 進行梅毒抗體陽性的確認檢測，TPPA 是一種常有的梅毒抗體確證方法，將梅毒螺旋體Nichols 株的精制菌株包被于明膠顆粒上的一種檢測方法，但是其操作主要是手工完成，且結果判讀以人工肉眼判斷，存在主觀因素，同時由于明膠顆粒上包被的抗原差異，該方法有漏檢現象，這在汪峰、莫艷萍等人[4-6]的文獻中有提及，在梅毒血清盤用TPPA 檢測時，有假陰性結果，即漏檢發生，同時由于是肉眼判讀凝集程度，很容易受人為因素干擾。在表1 中331 份ELISA 陽性樣本同時用TPPA 和ECLIA 檢測，二者檢測差異有顯著性，具體集中在低值區間，這一點在表2 中可以看出，ECLIA 的檢測值COI 在小于5 時，與TPPA 存在不符結果；而ECLIA 的COI 高于5 時，與TPPA 結果具有一致性，與周貴芬、黎翠翠等人的相關文獻報道一致[7-11]。針對ECLIA 與TPPA 不一致的15 例樣本，我們進一步做免疫印跡（WB）最終確證，免疫印跡試驗結合了分子生物學和免疫學的特點，敏感度和特異性高，是國際上公認的確證試驗中的“金標準”，優點是在分子水平上檢測標本中針對不同分子量多肽抗原成分的抗體，以保證檢測結果的高特異性；試驗過程簡單，有配套儀器使用，結果容易區分反應帶,缺點是每人份試劑的成本非常高,批量使用難以實現。具體結果見表3，TPPA 的結果中有5 例假陰性,3 例假陽性；ELCIA 的結果中僅有7 例假陽性；這也印證了部分學者關于TPPA 有漏檢的觀點，顯然單一的TPPA 實驗不宜用于獻血者歸隊實驗，但是如果不用TPPA 而全部用免疫印跡，這個成本太高，不可取，筆者通過增加電化學發光檢測，該方法通過重組TP 多種抗原技術來測定血清梅毒特異性抗體，不僅具有較高的靈敏度和特異度，同時還具有檢測范圍廣、速度快、重復性強、穩定性高的優勢，可以實現全自動、高通量的檢測，我們只需要針對低值的化學發光結果，補充TPPA實驗，二者結果不一致的再做免疫印跡，從而獲得最終梅毒抗體確證結果，這個策略，將有效降低確證實驗成本，且可以單個檢測也可以批量檢測，非常靈活。

表3 15 例TPPA 與ECLIA 檢測不符樣本的免疫印跡結果

綜上所述，ECLIA 用于梅毒抗體的檢測，操作方便、自動化程度高、檢測結果數據可與實驗室信息化系統實現傳輸，可作為采供血機構建立梅毒ELISA 雙試劑檢測后的反應性樣本補充試驗的優選策略，結合TPPA 進一步確證獻血者血液樣本的一個重要手段，作為現階段獻血者血液初篩出現反應性時，獻血者屏蔽和歸隊的檢測方法之一。

具體到實際應用中，可先用ELISA 梅毒試劑初篩，反應性樣本再使用ECLIA 法檢測，最后我們只需對ECLIA 低值結果的標本做后續確證，主要是COI 值小于5 時，先用TPPA 實驗檢測，二者不一致的再用免疫印跡法進行復檢，如果免疫印跡陰性則梅毒最終確證結果為陰性，如果免疫印跡陽性則最終梅毒抗體確證結果為陽性，如果免疫印跡不確定，則建議獻血者間隔8 周后再次采集血樣復查；這樣的檢測模式可以避免假陽性而導致的誤診[12]，避免給獻血者帶來困擾和心理負擔，增加社會大眾對無償獻血的信任度；而且這樣的梅毒抗體確證流程，不僅操作簡單且成本可控，而且結果易于判斷，具有可行性，具體操作流程，見圖1。

圖1 ELISA 法檢測