MicroRNA-155 調(diào)節(jié)Notch 信號通路對TLCs 誘導(dǎo)的急性胰腺炎腺泡細(xì)胞的影響

楊亞勤，牛麗丹，孔令宇，陳希妍，任芳，楊飛云

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科，河南 衛(wèi)輝 453100）

急性胰腺炎（Acute pancreatitis，AP）是臨床上常見的消化系統(tǒng)急性疾病，流行病學(xué)研究顯示，近年來AP 的發(fā)病率呈上升趨勢，且死亡率也居高不下，對人類生命安全造成嚴(yán)重威脅[1-2]。然而，由于AP 發(fā)病機制并不明確，臨床難以取得針對性的治療方式。研究顯示微小RNA(microRNA, miRNA 非編碼RNA) 在AP 患者血清中的表達出現(xiàn)明顯差異，與AP 的發(fā)生發(fā)展及臨床診斷密切相關(guān)[3-4]。郭廣洋等人的研究表明，AP 患者血漿miRNA-155表達升高，其表達水平與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[5]。動物實驗結(jié)果也表明，說明miRNA-155 的表達與AP 的發(fā)生密切相關(guān)[6]。然而，miRNA-155 在AP 中的作用機制并不明確。本研究利用TLCs 誘導(dǎo)制造AR42J 細(xì)胞的AP 模型，檢測AP 中miRNA-155 對Notch 信號通路的調(diào)控作用，初步探索miRNA-155的作用機制，為臨床AP 的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 大鼠胰腺AR42J 腺泡細(xì)胞購自于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 主要試劑F12K 培養(yǎng)液購自于Sigma 公司，優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自于Gibco 公司，牛磺膽酸鈉鹽(TLCs) 購自于Sigma 公司，Notch1 抗體，Bcl-2 抗體，Bax 抗體，Caspase-3 抗體購自于Abcam 公司，GAPDH 抗體購自于Sigma 公司。Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于Invitrogen 公司。microRNA-155 inhibitor，microRNA-155 negative control，pcDNA-Notch1，pcDNA negative control購自于蘇州吉瑪基因公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 AR42J 細(xì)胞的培養(yǎng) 大鼠胰腺AR42J 細(xì)胞培養(yǎng)于的F12K 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中含20%胎牛血清及青霉素100 U/mL，鏈霉素0.1 mg /mL，置于37℃、5 % CO2的無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次，實驗所用細(xì)胞均為對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞的藥物處理，轉(zhuǎn)染及分組 細(xì)胞的藥物處理：取對數(shù)生長期的AR42J 細(xì)胞，按照1X106個/mL 的濃度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后用濃度為200 μM 的TLCs 刺激20 min（模型組），收集細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的AR42J 細(xì)胞，按照1X106 個/mL 的濃度接種于6 孔板中，按照使用說明，利用Lipofectamine 2000 將microRNA-155 inhibitor，microRNA -155 negative control，pcDNA -Notch1，pcDNA negative control 轉(zhuǎn)染至AR42J 細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用濃度為200 μM 的TLCs 刺激20 min，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。

細(xì)胞分組：正常對照組 （Normal control group），模型組（TLCs group），TLCs+microRNA-155 inhibitor 組（TLCs+microRNA-155 inhibitor group），TLCs+microRNA-155 negative control 組（TLCs+microRNA-155 NC group），TLCs+microRNA-155 inhibitor+pcDNA negative control 組 （TLCs+microRNA-155 inhibitor +pcDNA NC group），TLCs +microRNA-155 inhibitor+pcDNA-Nocth1 組 （TLCs+microRNA-155 inhibitor+pcDNA-Nocth1 group）。

1.2.3 RT-qPCR 檢測 選取正常對照組與模型組細(xì)胞，提取細(xì)胞的總RNA，檢測RNA 濃度與純度后，利用RT-qPCR 檢測細(xì)胞中microRNA-155 mRNA，Notch1 mRNA 的表達變化，miRNA-155 Forward: 5′- CGCGTTAATGCTAATCGTGAT-3′;miRNA -155 Reverse: 5′ - CGCGTTAATGCTAATCGTGAT -3′ ，Notch1 Forward: 5′ -TCAATGTTCGAGGACCAGATG-3′; Notch1Reverse: 5′-TCACTGTTGCCTGTCAAGTC-3′，所有步驟均按照試劑盒及儀器的操作說明進行，RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，進行擴增，反應(yīng)條件:預(yù)變性94，30 s、變性94，5 s、退火55，30 s、延伸72，30 s；共40 個循環(huán)。

1.2.4 ELISA 檢測 將AR42J 細(xì)胞接種于6 孔板中，處理細(xì)胞后按照試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6，IL-32，IL-1β 及TNF-α 的含量，利用酶標(biāo)儀檢測吸光度值，計算各組細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的含量（pg/mL）。

1.2.5 Western blot 檢測 分別提取各組細(xì)胞總蛋白，進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，10%的脫脂奶粉封閉膜1 h，4℃孵育Ⅰ抗過夜，Ⅰ抗體濃度分別是Bcl-2 抗體（1∶500），Bax 抗體（1∶500），caspase-3（1∶500）及GAPDH 抗體（1∶10000），熒光II 抗（1∶1000）孵育2 h，利用Odyssey 曝光系統(tǒng)曝光，利用Image J 軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-155 與Notch1 在TLCs 誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞模型中的表達 正常對照組相比較，TLCs 組AR42J 細(xì)胞中miRNA-155 mRNA 的表達顯著升高（P<0.01），而Notch1mRNA 及Notch1 蛋白的表達顯著上調(diào)（P<0.01）。這些結(jié)果提示，在TLCs 誘導(dǎo)下，AR42J 細(xì)胞中miRNA-155 與Notch1 的表達均上調(diào)，見圖1。

圖1 miRNA-155 與Notch1 在TLCs誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞中的表達

2.2 抑制miRNA-155 的表達對Notch1 的影響 與TLCs 組相比較，miRNA-155 inhibitor 組Notch1 mRNA 與蛋白的表達均顯著降低 （P<0.01）；而miRNA-155 NC 組與TLCs 組相比較，Notch1 mRNA 與蛋白的表達并無明顯改變。結(jié)果說明，抑制模型組細(xì)胞中miRNA-155 的表達后，細(xì)胞中Notch1 的表達顯著降低，miRNA-155 可正向調(diào)節(jié)Notch1 的表達，見圖2。

圖2 miRNA-155 抑制劑對TLCs 誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞中Notch1 表達的影響

2.3 抑制miRNA-155 的表達對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 正常對照組相比較，TLCs 組細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達顯著下降，凋亡蛋白Bax 與Caspase-3 的表達顯著升高；而與TLCs 組相比較，TLCs+miRNA-155 inhibitor 組細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達顯著下降，凋亡蛋白Bax 與Caspase-3 的表達顯著升高。提示，在TLCs 誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞模型中，miRNA-155 可促進抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，抑制凋亡蛋白Bax 與Caspase-3 的表達，抑制損傷細(xì)胞的凋亡，而抑制miRNA-155 后可促進損傷細(xì)胞的凋亡，見圖3、表1。

表1 miRNA-155 抑制劑對TLCs 誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞中Bcl-2, Bax 與Caspase-3 表達的影響

圖3 miRNA-155 抑制劑對TLCs 誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中Bcl-2, Bax 與Caspase-3 表達的影響

2.4 抑制miRNA-155 與Notch1 的表達后，對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 TLCs+miRNA-155 NC 組相比較，TLCs+miRNA-155 inhibitor 組AR42J 細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達顯著下降，凋亡蛋白Bax與Caspase-3 的表達顯著升高；而與TLCs+miRNA-155 inhibitor 相比較，TLCs+microRNA-155 inhibitor+pcDNA-Notch1 組，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達顯著升高，凋亡蛋白Bax 與Caspase-3 的表達顯著降低。這些結(jié)果提示，在TLCs 誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞模型中，抑制miRNA-155 可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，促進凋亡蛋白Bax 與Caspase-3 的表達，促進損傷細(xì)胞的凋亡，而過表達Notch1 可逆轉(zhuǎn)抑制miRNA-155 對損傷細(xì)胞的作用，抑制細(xì)胞凋亡，見圖4。

圖4 抑制Notch1 可逆轉(zhuǎn)miRNA-155 抑制劑對TLCs 誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞中Bcl-2, Bax 與caspase-3 蛋白表達的影響

表2 抑制Notch1 可逆轉(zhuǎn)miRNA-155 抑制劑對TLCs 誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞中Bcl-2, Bax 與caspase-3 蛋白表達的影響

2.5 抑制miRNA-155 與Notch1 的表達后對細(xì)胞炎性因子的影響 正常對照組相比較，TLCs 模型組細(xì)胞中炎性因子IL-6，IL-32，IL-1β 及TNF-α 的含量顯著升高；與TLCs 組相比較，TLCs+microRNA-155 inhibitor 組細(xì)胞中它們的含量顯著下降；與TLCs+microRNA-155 inhibitor 組相比較，TLCs+microRNA-155 inhibitor+pcDNA-Notch1 組細(xì)胞中它們含量顯著升高。這些結(jié)果說明，抑制microRNA-155 可減輕TLCs 誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞損傷，減少炎性因子的釋放，而過表達Notch1 可逆轉(zhuǎn)了抑制microRNA-155 對TLCs 誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞損傷的作用,促進炎性因子的釋放，見表3。

表3 抑制miRNA-155 與過表達Notch1 對TLCs 誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞中炎性因子的影響。

3 討論

早期的研究顯示當(dāng)AP 發(fā)生時，腺泡細(xì)胞往往會發(fā)生兩種情況，即壞死與凋亡，前者與胰腺炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，后者與胰腺炎嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，因此，抑制細(xì)胞壞死，促進細(xì)胞凋亡可減輕AP 的進一步惡化[7]。通過靶向治療減少腺泡細(xì)胞壞死，促進其凋亡可成為臨床治療AP 的新的策略。

Notch 信號通路通過配體與受體的結(jié)合，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)部一系列的蛋白分解，激活其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)解細(xì)胞的凋亡[8]。動物實驗研究顯示，Notch 信號通路參與小鼠AP 模型中細(xì)胞的凋亡[9]，通過過度表達Notch1 可抑制胰腺細(xì)胞的凋亡，從而促使AP 的惡化[10]。

近年來，microRNA 的研究顯示，多個miRNA參與AP 的發(fā)生發(fā)展，與診斷和預(yù)后相關(guān)[11-12,5],其中miRNA-155 的表達與AP 的發(fā)生密切相關(guān)[6]。本研究的結(jié)果也顯示，miRNA-155 在模型細(xì)胞中的表達顯著升高，同時Notch1 的表達也升高，這也與文獻報道相一致。房裕鈔等人的研究顯示，miRNA-155 通過調(diào)控Notch 信號通路參與腦缺血-再灌注損傷[13]，那么miRNA-155 是否是通過調(diào)控Notch信號通路參與對AP 的影響，還未見報道。

本研究中，抑制模型細(xì)胞中miRNA-155 表達后，細(xì)胞中Notch1 的表達也顯著下降；抑制miRNA-155 后抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達降低，而凋亡蛋白Bax 與Caspase-3 的表達升高；同時過表達Notch1 后，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達升高，而凋亡蛋白Bax 與Caspase-3 的表達降低。這些結(jié)果表明在AP 中，miRNA-155 正向調(diào)控Notch 信號通路，抑制miRNA-155 的表達后，可抑制Notch 信號通路的激活，進而促進AR42J 細(xì)胞凋亡，而過表達Notch1 后，可逆轉(zhuǎn)抑制miRNA-155 對TLCs 誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞的作用，抑制了細(xì)胞凋亡。

血清中TNF-α 及IL-6 等水平與炎性疾病的發(fā)展密切相關(guān)[14]，抑制miRNA-155 通過靶向SIRT1緩解糖尿病小鼠高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞炎癥[15]。呂芳等人的研究表明，在AP 大鼠模型中，IL-6、TGF-β、IL-32 及TNF-α 水平顯示高表達，它們的水平升高也反應(yīng)了機體的炎性狀態(tài)，在對AP 診斷中具有重要意義，四項聯(lián)合檢測可以提高診斷效率[16]。本研究中，抑制模型細(xì)胞中miRNA-155 表達后，細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TGF-β、IL-32 及TNF-α 水平顯著下降；同時過表達Notch1 后，它們的水平顯著升高，表明在AP 中，抑制miRNA-155 的表達后，可減輕TLCs 誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞損傷，而過表達Notch1 后，可逆轉(zhuǎn)抑制miRNA-155 對AR42J 細(xì)胞損傷的減輕作用，促進細(xì)胞損傷。

綜上所述，在TLCs 誘導(dǎo)的AP 模型AR42J 細(xì)胞中，通過抑制miRNA-155 可靶向下調(diào)Notch1 表達，抑制Notch 信號通路的激活，促進細(xì)胞凋亡，抑制炎性因子的釋放，從而減輕TLCs 誘導(dǎo)的AP 模型細(xì)胞AR42J 的損傷。本研究結(jié)果表明，miRNA-155 和Notch 信號通路是AP 的潛在分子靶點，可為臨床AP 的治療提供了新的策略。