HPLC-MS/MS 法同時檢測人血清中奧氮平、利培酮和氨磺必利的濃度

鄧順順，梁國朝，梁靈君，高永雙

（1.中山市第三人民醫(yī)院檢驗科；2.藥劑科, 廣東 中山 528400）

精神分裂癥為精神科常見病、多發(fā)病,該疾病有著較高的致殘率，疾病對于患者的家庭以及整個社會造成了極大負擔[1]。該病是一種目前病因尚未明確的嚴重精神疾病,藥物控制是精神分裂癥的基本治療手段[2]。第二代抗精神病藥物也叫新型抗精神病藥物,主要包括利培酮、奧氮平、氨磺必利等藥物。與傳統(tǒng)抗精神病藥物比較，第二代抗精神病藥物療效更廣、治療作用更確切、安全性也更高等特點，已被臨床廣泛應用于精神分裂癥患者的治療[3］。有研究顯示，仍然會有50%以上患者在服用第二代抗精神病藥物之后會出現(xiàn)不同程度的不良反應，其中在體重方面體現(xiàn)的尤為突出，影響患者繼續(xù)治療依從性，不僅帶來不好的主觀體驗，而且會增加疾病復發(fā)的風險［4-5］。

臨床常用抗精神病治療藥物的療效與藥物的不良反應與其血藥濃度密切相關，因此血藥濃度監(jiān)測( TDM ) 是精神科藥物治療方面的重要參考[6]。神經(jīng)精神藥理學與藥物精神病學協(xié)會（AGNP）推薦臨床使用奧氮平、利培酮或氨磺必利時進行治療藥物監(jiān)測。本研究在以往研究的基礎上[7-9]，建立一種可用于實驗室常規(guī)開展，準確而快速的同時檢測人血清中奧氮平、利培酮或氨磺必利的方法，進行方法學確證，提高TDM 的效率。

1 材料與方法

1.1 試劑 甲醇、乙腈（色譜純），德國默克公司；乙酸，廣州化學試劑廠；去離子水，自制。

1.2 試驗藥品 氨磺必利，批號200701；奧氮平，批號：201502；利培酮，批號：201704，純度均＞99%,購于中國食品藥品檢定研究所；內標氨磺必利-D5，批號：2-AMC-124-4；奧氮平-D3，批號：6-QFY-169-3；利培酮-D4，批號：3-KHI-168-3，純度均＞99%,購于Toronto Research Chemicals 公司。

1.3 儀器設備 采用島津8040 型號液質聯(lián)用儀（日本SHIMADZU），配備有可調柱溫箱 (CTO-20A)，氮氣發(fā)生器（ATN-1050）,二元高壓泵(LC-20AD)，自動進樣器(SIL-20AHT-UFLC)；臺式高速冷凍離心機(Eppendorf 5424R 型)；yi 移液槍(Eppendorf)，數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司，KQ-300DV 型）分析天平(Sartorins，B2T5S 型)；混勻儀(艾本德MixMate 型) ；帕恩特普通分析級純水機(北京湘順源，XYB-H 型)。

1.4 溶液配制

1.4.1 對照品工作溶液制備稱取抗精神病藥物奧氮平、利培酮和氨磺必利的標準對照品分別用一定量甲醇溶解配制成為10.00 ug·mL-1的儲備液，保存于2～8℃冰箱備用。使用時再按需求按照一定比例用甲醇稀釋成質控工作液和標準曲線工作液。

1.4.2 標準品與質控樣品的制備 留取正常體檢人員血清作為空白血清，取1.4.1 制備的對照品工作液10 μL，加入空白血清90 μL，混勻儀混勻1 min，分別配制成含不同藥物的血清標準品溶液，然后按比例用甲醇溶解成含各分析物的質量濃度從低到高依次如下：奧氮平為5、10、25、50、100、250、500 和1 000 ng·mL-1，利培酮標準曲線為1、2、5、10、20、50、100 和200 ng·mL-1，氨磺必利為10、20、50、100、200、500、1 000 和2 000 ng·mL-1。用甲醇將血清標準品稀釋成3 個質量濃度的質控品（低、中、高），各分析物濃度如下：奧氮平為100、500、800 ng·mL-1，利培酮為20、100、160ng·mL-1，氨磺必利為200、1000、1 600 ng·mL-1。

1.4.3 同位素內標工作溶液配制 用乙腈溶解奧氮平-D3、利培酮-D4 和氨磺必利-D5，分別配成質量濃度為100 ng·mL-1的內標工作液。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件 Phenomenex 預柱：Security Guard Ultra Cartridges (AJ0-8775)；Phenomenex 色譜柱:Kinetex XB-C18,2.6 μm,3.0 x 50 mm；柱溫為45℃；流速為0.4 mL·min-1；流動相水相為0.1%乙酸水溶液，有機相為甲醇，線性梯度洗脫；進樣量為5 μL。

1.5.2 質譜條件 采用電噴霧電離（ESI）標準功能正離子模式，離子源溫度為200 ℃，流速20.0 L·min-1，加熱模塊溫度為450 ℃，采用多反應監(jiān)測模式（MRM）質譜掃描方式，電噴霧壓力為230 kPa。各物質前體與產(chǎn)物質荷比（m/z）分別為：奧氮平m/z 312.9→256.1，內標奧氮平-D3 m/z 316→256.1，利培酮m/z 411.2→191.1，內標利培酮-D4 m/z 415→195.1，氨磺必利m/z 370.2→242，內標氨磺必利-D5 m/z 375.2 →242，碰撞能量分別為26，22，22，26，45 和24 eV，裂解電壓135e V。

2 試驗與結果

2.1 樣本的處理 在1.5 mL 的離心管中加入空白血清樣本、標準品或質控品100 μL，加入內標溶液200 μL,，加入乙腈450 μL，混勻儀1 400 轉/分混勻1 min，然后在4℃條件下15 000 rpm 離心10 min，用加樣槍吸取100 μL 上清液置于帶專用內插管的進樣瓶中，進行質譜分析。

2.2 專屬性試驗 取4 份等量空白血清，第1 份不加任何物質，第2 份加入內標，第3 份加入分析物，第4 份同時加入分析物和內標，按照操作規(guī)程進行檢測，進樣檢測分析，得到色譜圖。奧氮平和奧氮平-D3 的保留時間約為2.31 min，利培酮和利培酮-D4 的保留時間約為2.42 min，氨磺必利和氨磺必利-D5 的保留時間約為2.36 min。檢測結果：血清中基質不干擾分析物及內標成分的測定，專屬性強。見圖1。

圖1 血清中3 中精神科藥物檢測的典型色譜圖

2.3 標準曲線與定量下限 按“1.4.2 標準品與質控樣品的制備”配制所得的標準品，稀釋成由低到高8 個不同濃度的標準曲線的血清樣品，按操作規(guī)程檢測，檢測兩次。以峰面積與內標峰面積的比值作為縱坐標（y），以配制時的各分析物濃度為橫坐標(x) ，采用加權( 1 /x2 ) 最小二乘法進行回歸，得到各分析物標準曲線，見表1。

表1 標準曲線與定量下限驗證結果

2.4 精密度與提取回收率試驗 按“1.4.2 標準曲線與質控樣品的制備”項制備的血清質控樣品，按普通樣本處理操作規(guī)程進行檢測，一天內將同一批次的低、中、高三個水平樣本獨立檢測5 次，檢測間隔時間大于1 h，連續(xù)檢測3 d，可得到45 個檢測數(shù)據(jù)，并根據(jù)當批的標準曲線計算均值（x），相對標準偏差（RSD）,批內、批間的精密度。空白血清中加入不同濃度的對照品溶液后，配制成低、中、高三個水平的樣本，每組每個濃度5 份樣品，計算各均值，然后計算提取回收率。各分析物的準確度均在95.37%～105.72%，日內及日間精密度均＜15%，見表2。

表2 精密度與回收率驗證結果

2.5 穩(wěn)定性試驗 按“1.4.2 標準曲線與質控樣品的制備”項制備各分析物質控血清樣品（低、中、高3個濃度）各3 份，考察其在常溫避光條件下放置1 h和24 h、-20 ℃保存條件下存放1 d 和14 d 的穩(wěn)定性。驗證結果：質控樣品在常溫避光條件下放置1 h 和24 h、-20 ℃保存7 d 和14 d 的條件下，RSD 均小于15%，結果穩(wěn)定。

2.6 基質效應 制備標準品純溶液，血清加標樣本以及兩者1:1 的混合液，分別前處理后測定3 次。計算三種溶液3 次測定的峰面積 （目標化合物峰面積和內標峰面積比值）均值，1:1 混合樣本的均值相比血清加標樣本和標準品純溶液的均值的偏差。驗證結果奧氮平、利培酮和氨磺必利的偏差均小于15%，目標分析物在生物樣本和純溶液中的質譜響應無差異，不影響目標分析物的準確定量。

3 討論

目前，盡管許多國家與地區(qū)的精神分裂癥治療指南，均推薦單一抗精神病藥治療原則，但實際臨床上聯(lián)合用藥很常見[10], 有些聯(lián)合用藥甚至超過50%[11]。當患者聯(lián)合用藥時，需要進行每一種藥物的TDM 檢測，如果能一管血同時檢測其所有藥物的藥物濃度，那將會極大的縮短檢測時間，提高檢測效率，并減輕患者多次采血的負擔，臨床運用會更加廣泛。基于質譜具有分析敏感性和特異性，并能夠在單個過程中測量多種化合物[12]。這是一種監(jiān)測接受多種藥物治療的患者的經(jīng)濟、有效的方法［13］。目前TDM 多采用高效液相色譜、熒光偏振免疫分析等方法，其對應的儀器平臺分別是高效液相色譜儀和免疫分析儀[14], 對于某些臨床化學和毒理學分析物，液相色譜(LC)與串聯(lián)質譜(MS/MS)配對提供了優(yōu)于免疫測定的傳統(tǒng)測試的優(yōu)勢[12]。本實驗室采用的是液相色譜三重四極桿質譜聯(lián)用儀，HPLCMS/MS 檢測方法。

本研究旨在建立一種同時監(jiān)測奧氮平、利培酮和氨磺必利的HPLC-MS/MS 方法。在本實驗過程中采用乙腈蛋白沉淀法對樣品進行處理，與液-液萃取法、固相萃取法相比，不但提高了靈敏度，而且有利于改善峰型[15]。本研究采用同位素化合物作為內標，同位素內標與分析物離子可簡化色譜行為，確保質譜行為一致，有效降低溶血、高脂血以及高膽紅素血樣等特殊血樣對檢測的影響[16]。本方法驗證過程符合生物樣品定量分析方法驗證指導原則[17]，驗證該方法的專屬性、線性范圍、靈敏度、和基質效應等，均能滿足該方法同時檢測奧氮平、利培酮和氨磺必利三種精神類藥物的研究要求，檢測中所需標本量少，檢測速度快，能提高臨床檢測效率和檢測質量，可以進行日常檢測。