微小RNA-29b靶向卷曲蛋白6參與急性髓系白血病細胞柔紅霉素耐藥的分子機制

賴思含,何 瑩,易 海

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是最常見的急性白血病,占急性白血病的80%[1]。阿糖胞苷和柔紅霉素(daunorubicin,DNR)組合是治療AML的一線方案[2]。盡管大量的AML患者通過這種治療實現了初始誘導緩解,但化療耐藥性仍然是治療失敗的關鍵因素[3]。因此,探索AML化療耐藥的潛在機制并開發有效的新策略至關重要。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一個高度保守的內源性非編碼RNA,可通過與3′-非翻譯區(3′-untranslated region,3′-UTR)結合降解或阻斷靶基因mRNA翻譯,從而負向調節靶基因的表達。越來越多的證據表明,miRNAs通過調節涉及細胞存活、增殖、分化和凋亡的多種靶基因的表達,在AML治療中發揮關鍵作用[4,5]。有研究發現,微小RNA-29b(microRNA-29b,miR-29b)可通過負靶向調控信號轉導和轉錄激活因子3抑制AML細胞增殖,誘導細胞凋亡[6],但miR-29b在AML化療耐藥中的機制尚不清楚。通過生物信息學分析發現,卷曲蛋白6(frizzled-6,FZD6)是miR-29b潛在靶標基因,且已有研究證實,FZD6參與調控AML的發病機制[7]。本研究旨在探討miR-29b靶向FZD6參與AML細胞DNR耐藥的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 AML細胞系HL-60、KG-1、THP-1和Kasumi-1購自中國上海科學院細胞庫。

DNR(28008-55-1,純度98%)購自上海Chemesky,RPMI-1640培養液(PM150110A,含青/鏈霉素)購自武漢Procell,miR-29b模擬物(miR-29b mimics)及其陰性對照(miR-NC mimics)、FZD6過表達載體(pcDNA-FZD6)及其空載體陰性對照(pcDNA)、3′-UTR FZD6野生型(FZD6-WT)和FZD6突變型(FZD6-MUT)均由上海生工設計并合成。Lipo 2000轉染試劑(11668-019)、一抗FZD6(720414,79 kDa)和GAPDH(MA1-16757,36 kDa)購自美國Thermo Fisher,CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(BB-4202)購自上海BestBio,TRIzolTM試劑(CY80286)購自上海超研,反轉錄試劑盒(CD-102539GM)購自武漢純度,SYBRTMPrimeScript RT-PCR試劑盒(RR064B-1)購自日本TAKARA,雙分子熒光素酶報告基因檢測試劑盒(DD1205-01)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(E112-01)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(A211-01)購自南京Vazyme,RIPA裂解液(JN0191-YJR)、Edu法細胞增殖檢測試劑盒(KFS342)購自北京百奧萊博。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組 AML細胞系HL-60、KG-1、THP-1和Kasumi-1維持在RPMI-1640培養液中(含胎牛血清和青/鏈霉素),在37 ℃和5%CO2的濕潤氛圍中培養。DNR溶解在二甲亞砜(DMSO)中。對數期生長的HL-60、KG-1、THP-1和Kasumi-1使用不同濃度的(0、2、4、8、16 mM)[8]DNR處理培養24 h。

取對數期生長的THP-1細胞分為5組:Control組、miR-NC mimics組、miR-29b mimics組、miR-29b mimics+pcDNA組、miR-29b mimics+pcDNA-FZD6組。Control組細胞正常培養;miR-NC mimics組細胞轉染miR-NC mimics;miR-29b mimics組細胞轉染miR-29b mimics;miR-29b mimics+pcDNA組轉染miR-29b mimics+pcDNA;miR-29b mimics+pcDNA-FZD6組細胞轉染miR-29b mimics+pcDNA-FZD6。轉染方法均按照試劑盒說明書操作轉染24 h。以上5組細胞轉染成功后均使用10 mM DNR處理培養24 h。

1.2.2 CCK-8檢測AML細胞增殖活性 將按照上述培養的不同AML細胞及DNR處理的各組THP-1細胞以1×104個/孔的密度接種在96孔板中,培養48 h后,根據制造商說明書使用CCK-8細胞增殖檢測試劑盒檢測細胞活力。通過酶標儀檢測各孔細胞在450 nm處的吸光度(absorbance,A值),同時計算DNR對不同AML細胞產生50%生長抑制的濃度(IC50)。細胞增殖率=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.3 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測miR-29b和FZD6 mRNA 使用TRIzolTM試劑從按照上述方法培養的不同AML細胞及DNR處理的各組THP-1細胞中提取總RNA,使用反轉錄試劑盒制備cDNA,通過SYBRTMPrimeScript RT-PCR試劑盒檢測miR-29b和FZD6 mRNA的相對表達水平。具體的qRT-PCR的反應體系及程序均按照試劑盒說明書操作。以2-ΔΔCt來表示目的基因的相對表達水平。

引物序列:miR-29b,上游引物5′-GGTACCGGTTGTCTTGGGTTTATTG-3′,下游引物5′-GAATTCAAATACTTCAGAGCTG-3′;U6,上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;FZD6,上游引物5′-ATGGAAAGGTCCCCGTTTCTG-3′,下游引物5′-GGGAAGAACGTCATGTTGTAAGT-3′;GAPDH,上游引物5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,下游引物5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因檢測miR-29b與FZD6靶向關系 經ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn/)網站預測發現,FZD6 mRNA的3′-UTR與miR-29b存在相互結合位點。取按照正常方法培養的THP-1細胞,將FZD6-WT和FZD6-MUT分別連接到pGL3載體后分別與miR-NC mimics或miR-29b mimics轉染,依次作為miR-NC mimics+FZD6-WT組、miR-29b mimics+FZD6-WT組、miR-NC mimics+FZD6-MUT組和miR-29b mimics+FZD6-MUT組,通過雙熒光素酶報告基因檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.2.5 免疫印跡(Western blot)檢測THP-1細胞中FZD6水平 使用RIPA試劑從按照上述方法培養的DNR處理的各組THP-1細胞中提取總蛋白,通過BCA法對蛋白濃度進行定量。通過10% SDS-PAGE分離蛋白,使用濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上,添加5%脫脂牛奶室溫孵育2 h,添加按照1∶1000比例稀釋的FZD6和GAPDH一抗在4 ℃過夜孵育,隔天使用PBS沖洗膜后,添加按照1∶5000比例稀釋的HRP標記二抗室溫孵育2 h,采用ECL發光液顯影后使用凝膠成像系統拍照,通過Image J軟件分析各蛋白的灰度值,FZD6蛋白相對表達量=FZD6灰度值/GAPDH灰度值。

1.2.6 Edu法檢測THP-1細胞增殖情況 將按照上述方法培養的DNR處理的各組THP-1細胞接種于6孔板中(2×105個/孔),培養48 h后,按照Edu法細胞增殖檢測試劑盒中操作方法測定細胞增殖,細胞核使用5 mg/ml Hoeschst 3433染色30 min。Edu陽性細胞呈綠色,Hoeschst 3433細胞呈藍色。Edu陽性細胞率=綠色細胞/藍色細胞×100%。

1.2.7 流式細胞術檢測THP-1細胞凋亡率 將按照上述方法培養的DNR處理的各組THP-1細胞接種于96孔細胞培養板中(2×105個/孔),培養48 h后,分別添加100 ml結合緩沖液和5 ml Annexin V-FITC室溫避光孵育30 min后,加入10 ml碘化丙啶(PI)避光孵育5 min。使用流式細胞儀檢測各孔細胞的凋亡率。

2 結 果

2.1 miR-29b表達與AML細胞中DNR耐藥性的相關性 結果顯示,不同AML細胞系對DNR的耐藥性不同,其增殖率隨著DNR濃度的增高而降低(表1),呈現濃度依賴性;且THP-1、KG-1、HL-60和Kasumi-1細胞的IC50分別為10.470、7.994、6.319和4.927 mM。qRT-PCR結果顯示,miR-29b在AML細胞系THP-1(1.00±0.05)、KG-1(1.87±0.16)、HL-60(2.96±0.21)及Kasumi-1(3.73±0.29)中的表達逐漸增高(P<0.05)。后續研究選用AML細胞耐DNR更高的THP-1細胞為研究對象,選擇藥物處理濃度為10 mM。

表1 CCK-8測定AML細胞在不同DNR濃度下的細胞增殖率

2.2 miR-29b與FZD6靶向關系驗證 經生物信息學分析發現,FZD6 mRNA的3′-UTR存在miR-29b的互補結合位點(圖1)。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,與miR-NCmimics+FZD6-WT組相比,miR-29b mimics+FZD6-WT組細胞中相對熒光素酶活性顯著降低(1.01±0.02vs.0.32±0.04,P<0.05);與miR-NC mimics+FZD6-MUT組相比,miR-29b mimics+FZD6-MUT組細胞中相對熒光素酶活性無統計學差異(0.98±0.06vs.1.00±0.05)。

圖1 miR-29b與FZD6靶向結合位點圖

2.3 miR-29b和FZD6在DNR處理的各組THP-1細胞中的表達水平 與miR-NC mimics組相比,miR-29b mimics組THP-1細胞中miR-29b表達水平增高,FZD6 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05);與miR-29b mimics+pcDNA組相比,miR-29b mimics+pcDNA-FZD6組THP-1細胞中miR-29b表達變化無差異,FZD6 mRNA和蛋白水平增高(P<0.05);而miR-NC mimics組與Control組、miR-29b mimics+pcDNA組與miR-29b mimics組miR-29b和FZD6表達水平變化無統計學差異(圖2、表2)。

圖2 Western blot檢測各組THP-1細胞中FZD6蛋白水平A. Control;B. miR-NC mimics;C. miR-29b mimics;D. miR-29b mimics+pcDNA;E. miR-29b mimics+pcDNA-FZD6。

表2 miR-29b和FZD6在DNR處理的各組THP-1細胞中的表達水平

2.4 DNR處理的各組THP-1細胞增殖情況 與miR-NC mimics組相比,miR-29b mimics組THP-1細胞增殖率和Edu陽性細胞率降低(P<0.05);與miR-29b mimics+pcDNA組相比,miR-29b mimics+pcDNA-FZD6組THP-1細胞增殖率和Edu陽性細胞率增高(P<0.05);而miR-NC mimics組與Control組、miR-29b mimics+pcDNA組與miR-29b mimics組細胞增殖率和Edu陽性細胞率變化無統計學差異(圖3、表3)。

圖3 Edu測定DNR處理的各組THP-1細胞增殖變化A. Control;B. miR-NC mimics;C. miR-29b mimics;D. miR-29b mimics+pcDNA;E. miR-29b mimics+pcDNA-FZD6。

表3 CCK-8和Edu檢測DNR處理的各組THP-1細胞增殖情況 (%)

2.5 DNR處理的各組THP-1細胞凋亡率分析 與miR-NC mimics組相比,miR-29b mimics組THP-1細胞凋亡率增高(42.65%±4.08%vs.10.04%±1.96%,P<0.05);與miR-29b mimics+pcDNA組相比,miR-29b mimics+pcDNA-FZD6組THP-1細胞凋亡率降低(19.62%±3.54%vs.45.09%±4.56%,P<0.05);而miR-NC mimics組與Control組、miR-29b mimics+pcDNA組與miR-29b mimics組細胞凋亡率變化無統計學差異(圖4)。

圖4 流式細胞術檢測DNR處理的各組THP-1細胞凋亡狀況A. Control;B. miR-NC mimics;C. miR-29b mimics;D. miR-29b mimics+pcDNA;E. miR-29b mimics+pcDNA-FZD6。

3 討 論

由于對阿糖胞苷聯合DNR的標準誘導化療耐藥,AML在大多數情況下仍具有較差的長期生存率和高復發風險[8,9]。因此,有必要對AML耐藥機制進行研究,以期為提高DNR的治療效果提供依據。

既往研究表明,miRNA異常表達參與包括血液惡性腫瘤在內的多種癌癥發生發展過程。已有大量研究表明,miR-29b可作為腫瘤抑制因子參與多種腫瘤細胞的增殖、凋亡及耐藥性等生物學過程,同時在機體的適應性免疫應答反應中也具有重要作用,有望成為癌癥的新型診斷標志物和治療靶點[10]。據報道,miR-29b在子宮頸癌細胞中通過直接調控磷酸酶和張力蛋白同源物抑制腫瘤細胞的增殖并減少遷移和侵襲,同時還通過調控Bax和Bcl-2來增強子宮內膜癌細胞對順鉑的敏感性并增強順鉑誘導的細胞凋亡[11]。miR-29b的表達在膠質瘤組織和細胞中下調[12],可通過直接靶向抑制信號轉導和轉錄激活因子3抑制膠質瘤細胞生長,促進其凋亡,同時增強膠質瘤細胞對替莫唑胺的敏感性[12]。此外,miR-29b已被證實在AML及慢性淋巴細胞白血病中下調,且其表達水平的降低與AML進展相關,過表達miR-29b可增強AML細胞凋亡[13,14]。本研究首先通過對不同AML細胞系對DNR耐藥性的研究發現,不同AML細胞系對DNR的敏感性不同;同時通過檢測不同AML細胞系中的miR-29b表達發現,對DNR耐藥性高的細胞系顯示出較低的miR-29b表達,表明miR-29b表達與AML細胞中DNR耐藥性呈現負相關,暗示了miR-29b過表達可作為提高AML對DNR敏感性的證據,因此推測,高表達miR-29b可以降低AML細胞中的DNR耐藥性。為進一步證實AML細胞中miR-29b表達和DNR耐藥性的關聯,我們通過用miR-29b模擬物來過表達miR-29b,結果顯示,miR-29b過表達可降低AML細胞的增殖能力,增強細胞的凋亡能力,這些結果表明,miR-29b表達的上調可以恢復AML細胞對DNR的敏感性,降低DNR耐藥性。

雖然上調miR-29b可以部分緩解AML細胞中的DNR抗性,但此種現象的分子機制還未可知。本研究使用生物信息學方法來預測miR-29b的潛在靶標,結果顯示,FZD6含有miR-29b的靶標結合位點,為進一步確認二者的關系,通過雙熒光素酶報告基因檢測、qRT-PCR及Western blot檢測證明,FZD6確為AML細胞中miR-29b的直接靶標基因。FZD6屬于卷曲家族,已被證明在癌細胞增殖、凋亡中具有重要的作用。如:非編碼RNA可通過靶向調控FZD6激活Wnt/β-catenin信號通路,從而參與調控膀胱癌、結直腸癌等癌癥惡性生物學行為[15,16]。且有研究表明,FZD6可觸發激活Wnt信號參與調控T細胞急性淋巴細胞白血病和AML發病機制,可作為治療的潛在靶點等[7, 17]。此外,已有研究證實,miR-29b可通過靶向下調FZD6表達來抑制成纖維細胞增殖、遷移和分化[18]。然而,FZD6在AML耐藥機制中的作用以及miR-29b和FZD6在AML中的關系尚不清楚。本研究證明了在過表達miR-29b的AML細胞中上調FZD6表達,可顯著降低AML細胞對DNR的敏感性,增強細胞增殖能力,抑制細胞凋亡能力,說明上調FZD6可逆轉miR-29b對AML細胞耐藥性的影響。

綜上,miR-29b過表達可降低AML細胞對DNR的耐藥性,此過程是通過負靶向調控FZD6實現的。總的來說,本研究提出并初步驗證了miR-29b通過直接靶向FZD的3′-UTR區域來提高AML對DNR的敏感性,其在AML細胞中的耐藥性關系,有助于理解AML治療中涉及的潛在機制。然而,仍需更多的研究來確定miR-29b是否可以用于AML臨床治療。