新型沸石止血紗布的生物安全性研究

馬 玥,張 瑩,孫 琦,史振偉,黃轉青,楊 飛,石浩源,楊亞龍,徐風華

在軍事行動和平時創傷中,大出血是導致院前死亡的主要原因之一[1-3]。近年來,有研究發現礦物質沸石具有一定生物活性,可用于機體止血且效果顯著[2]。為解決緊急止血問題,項目組研發了一種低產熱納米沸石顆粒敷料[4],以紗布棉纖維作為結構支架,采用無模板生長方式,將介孔單晶菱沸石緊密結合在棉纖維表面的止血材料上,錨定在棉纖維上的沸石顆粒平均尺寸為5 μm,單個顆粒是由納米晶體[(148±37)nm]聚集而成。前期項目組使用豬股骨交界動脈破裂槍擊模型比較沸石止血紗布與其他止血材料的功效,發現新型沸石止血紗布不僅能有效控制出血,還解決了沸石產品止血局部放熱的副作用[5]。盡管新型沸石止血紗布是外用急救止血材料,性能穩定,但其在傷口按壓止血過程中的生物安全性尚不清楚。本研究參照我國GB/T16886醫療器械生物學評價標準和GB/T 14233.2-2005《中華人民共和國藥典》,對納米沸石止血紗布的生物安全性進行系統評價,為今后在臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 新型沸石止血紗布(杭州沸創醫療科技有限公司,批號20200901);DMEM細胞培養液(美國Gibco公司);胎牛血清(美國Gibco公司),青霉素-鏈霉素(北京百靈克生物科技有限公司);UV-2550紫外分光光度計(日本島津);酶標儀(Thermo Scientific Varioskan LUX多功能微孔板讀數儀)。

1.2 浸提液的制備 參照GB/T 16886醫療器械生物學評價標準[6],稱量6.045 g無菌沸石紗布置于30 ml DMEM培養液中,37 ℃環境下浸提24 h,并用0.22 μm濾膜過濾得相對濃度為100%的浸提液,稀釋成不同濃度備用。

1.3 實驗動物 清潔級新西蘭純種雄兔6只,體重2～2.5 kg;清潔級豚鼠20只,體重(300±20)g;昆明系小鼠20只,體重17～20 g,由北京圣水金蟾養殖專業合作社提供[許可證號:SCXK(京)2019-0010]。試驗經醫院動物實驗福利倫理委員會批準,授權編號為2019-X15-90。L929小鼠成纖維細胞株由武漢賽維爾生物科技有限公司提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞毒性試驗 采用CCK8法進行細胞毒性試驗[7]。試驗分組:A、B、C、D組分別為相對濃度100%、75%、50%、25%沸石紗布浸提液,培養12、24、48、72 h后,加入含10% CCK-8溶液,酶標儀檢測OD值(490 nm),并計算相對增殖率(relative growth rate, RGR)。RGR(%)=試驗組OD值/陰性對照組OD值×100%。

1.4.2 溶血試驗 分為試驗組(沸石紗布浸提液)、陰性對照組(生理鹽水)、陽性對照組(蒸餾水),依據文獻[8]方法進行溶血試驗,計算溶血率。溶血率(%)=(樣品吸光度-陰性對照吸光度)/(陽性對照吸光度-陰性對照吸光度)×100%。

1.4.3 熱原試驗 按照GB/T 14233.2-2005《中華人民共和國藥典》[9],篩選3只體溫在38.0～39.6 ℃波動不超過0.4 ℃的白兔。自兔耳緣靜脈注射紗布浸提液(約38 ℃),注射劑量10 ml/kg。每隔1 h測量肛溫,連續測3次,計算兔體溫的升高度數。

1.4.4 急性全身毒性試驗 將20只小鼠隨機分為試驗組和對照組,每組10只,記錄初始體重,分別經尾靜脈注射沸石紗布浸提液和生理鹽水,注射劑量0.05 ml/g,注射速度0.1 ml/s。參照評價標準觀察注射后24、48、72 h動物一般狀態、體重變化、毒性表現和死亡情況。

1.4.5 皮內反應試驗 取新西蘭白兔(n=3),試驗前24 h背部4 cm×8 cm區域去毛。在脊柱兩側皮膚試驗區各距離脊柱2 cm處各設計5個注射點,每點之間間隔2 cm進行皮內注射,每點注射0.2 ml。觀察注射后24、48、72 h的皮膚反應,根據紅斑及水腫反應進行計分,并計算原發刺激指數,確定刺激反應類型。

1.4.6 致敏試驗 將豚鼠隨機分為3組,每組6只。按照皮內誘導階段、局部誘導階段和激發階段的試驗[10],觀察24、48、72 h貼敷部位有無紅斑、水腫、焦痂發生。

2 結 果

2.1 細胞毒性試驗 隨著培養時間延長,各濃度浸提液OD值均有所增加,細胞生長狀態良好,且于48 h后顯著增加,相對增殖率均在0～1級,無顯著細胞毒性(表1)。培養72 h后,顯微鏡觀察細胞生長狀態良好,多呈梭形,試驗組和對照組細胞形態和數量無明顯差異(圖1)。

表1 CCK-8法細胞毒性實驗及相應毒性等級

圖1 新型沸石止血紗布72 h后試驗組與對照組細胞形態(× 40)A.試驗組;B.對照組。

2.2 溶血試驗 試驗組和陰性對照組上清液未見紅色渾濁溶血狀態,無明顯紅細胞破裂。試驗組溶血率為3.37%(≤5%),陰性和陽性對照組溶血率分別為0和100%,結果表明新型沸石止血紗布未引起明顯的溶血反應。

2.3 熱原試驗 測得 3 只實驗動物體溫分別升高0 ℃、0.4 ℃、0.2 ℃,均小于0.6℃;且體溫升高總數為 0.6℃,小于1.4℃,結果表明新型沸石止血紗布未引起動物熱原反應。

2.4 急性全身毒性試驗 試驗組與對照組小鼠在觀察時間窗內一般狀態良好,未出現明顯中毒反應,無死亡。兩組小鼠體重均有增加,但差異無統計學意義(P>0.05,表2)。

表2 新型沸石止血紗布急性全身毒性試驗動物體重變化

2.5 皮內反應試驗 3只新西蘭白兔在72 h內均無紅斑、水腫,未見任何刺激反應,計算各時間點平均原發性刺激為0,表示新型沸石止血紗布未引發明顯的皮膚刺激反應。

2.6 致敏試驗 試驗中2只陽性對照組動物分別于皮內刺激和局部誘導階段死亡,其余4只動物24 h試驗區皮膚出現明顯的焦痂壞死,試驗組和陰性對照組動物激發部位皮膚均無紅斑、水腫和焦痂(圖2)。結果表明,新型沸石止血紗布未引起動物的致敏反應。

圖2 新型沸石止血紗布動物致敏試驗A.皮內注射;B.試驗組;C.陰性對照組;D.陽性對照組。

3 討 論

沸石是一種存在于自然界的硅鋁酸鹽礦物,典型孔徑為0.4～1.2 nm[11],多孔結構能夠快速有效地控制大血管出血[12]。但有研究發現,如止血后清創不充分,殘留在傷口處的沸石顆粒可能會引起熱損傷等不良反應[13]。新型沸石止血紗布以棉線作為襯底,通過化學鍵使沸石涂層直接生長在纖維素上,脫落率<15%[4]。前期研究發現,在豬股動脈槍擊模型中,新型沸石止血紗布組的出血量和止血時間均有顯著改善,且創面溫度未見明顯升高,各項生理指標提示機體未出現血壓、凝血功能異常等不良反應[5]。目前關于其生物安全性評價并未見公開的系統資料報道,僅通過檢測血液指標無法全面評估紗布應用后皮膚局部是否發生過敏或毒性反應。生物材料不同于藥物,由于直接與人體接觸,是否有活性成分進入體內,以及存留時間長短,都會影響臨床應用的安全性,因此對其進行生物安全性研究至關重要。本研究擬在止血試驗的基礎上對新型沸石止血紗布進行生物相容性評價。

參照GB/T 16886 醫療器械生物學評價標準,沸石止血紗布屬于Ⅱ類醫療器械,本研究從細胞毒性、溶血、皮內和致敏試驗方面對沸石止血紗布的生物安全性進行評價。在細胞毒試驗中應用不同濃度的浸提液,能反映在不同應用情況下新型沸石止血紗布對細胞的影響。本研究結果顯示,新型沸石止血紗布的細胞毒性等級均在0～1級,提示無明顯細胞毒性。新型沸石紗布主要用于急救止血,它的血液相容性是評價生物安全的一項重要內容。本研究證實新型沸石與血液接觸后未引起急性溶血反應。皮內反應試驗是通過皮內注射浸提液觀察受試樣品誘導機體產生刺激反應的潛在性,在各種體內特異性試驗中應用最廣。本試驗中,證明沸石紗布浸提液不引起皮內反應刺激。致敏試驗中加入了FCA使得豚鼠的致敏能力增強,顯著提高了試驗篩選接觸性致敏原的有效性。陽性對照組的焦痂壞死提示變應原可誘發100%的豚鼠致敏,試驗組和陰性對照組動物,致敏反應為陰性,證實沸石紗布浸提液沒有致敏性。

本研究參照醫療器械生物學評價標準,證實新型沸石止血紗布的生物相容性較好,是一種安全、快速、有效的急救止血材料。