低聚原花青素通過抑制TLR 4/NF-κB通路對糖尿病腎病大鼠的腎臟保護和炎癥抑制作用

呂曉楠,宗春輝,宋光明

糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病患者嚴重并發癥之一,更是導致患者終末期腎病的重要原因,DKD的發生可直接影響糖尿病患者預后[1]。目前表明氧化應激、炎癥和纖維化在DKD的進展中發揮了關鍵作用。其中,炎癥不僅直接導致了DKD的發生和進展,還可加速這一過程[2]。包括腫瘤壞死因子-α、白細胞介素(interleukin, IL)-1β和IL-6等促炎細胞因子和趨化因子在DKD的發生發展過程中均顯著增加[2]。盡管對DKD的發病機制已經有較多研究,但探索新的有效治療策略仍具有挑戰性[3]。低聚原花青素(oligomeric proanthocyanidi, OPC)是一種存在于有色植物花果中的水溶性物質,其具有抗氧化應激、抗炎、抗纖維化等多種藥理活性,具有重要的臨床和研究價值[4,5]。既往已經有多個研究證實OPC在DKD進展中發揮腎臟保護作用[6-8]。本課題組前期研究表明了OPC對DKD大鼠足細胞間質轉化的抑制作用[9]。但OPC對DKD腎臟保護作用的機制和對腎臟炎癥的抑制作用仍待進一步探索。

Toll樣受體(toll-like receptors, TLRs)是非特異性免疫系統中的一個跨膜非催化性蛋白,可激活下游炎癥信號通路,以應對外源性刺激。已經證實,TLRs信號、核因子κ B(NF-κB)的激活與細胞內的促炎細胞因子和趨化因子[如IL-6、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)和IL-1β]釋放增加相關。TLR4/NF-κB信號通路激活是導致局部炎癥和白細胞蓄積的重要機制之一[10]。大量的研究表明TLR4、NF-κB激活在多種急慢性腎臟疾病、DKD炎癥、纖維化中發揮關鍵作用[10,11]。基于此,本研究探討了OPC對鏈脲佐菌素誘導的DKD大鼠的腎臟損傷和炎癥反應的作用,以期為OPC的臨床應用提供更多理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 OPC提取物(天津尖峰藥業有限公司);鏈脲佐菌素(美國Sigma公司);細胞裂解緩沖液(P0013B)、蛋白酶抑制劑混合物(P1005)(上海碧云天公司);一抗抗體TLR 4、p-p65、p65、p-IκB α、IκB α和β-actin蛋白(美國Biotechnology公司);二抗(美國Invitrogen公司);葡萄糖、血尿素氮和肌酐酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(美國Abcam公司);尿微量白蛋白ELISA檢測試劑盒 (美國Bethyl公司)。

代謝籠(韓國JeungdoBio&Plant公司);光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司);超薄切片機(德國萊卡),透射電子顯微鏡(日本日立,H-7700)。

1.2 實驗動物 選擇5～6周齡雄性SD大鼠50只,體重(250±20)g,均購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物研究所。全部大鼠在具有恒定12 h光照/黑暗循環的受控溫度動物間中自由進食和飲水。進行適應性飼養1周后開始本研究。本研究開始前經天津市中西醫結合醫院研究所實驗動物倫理委員會批準,按照《中國衛生研究院實驗動物護理和使用指南》進行。

1.3 實驗方法

1.3.1 DKD造模和干預 SD大鼠隨機分為5組:對照組,模型組,OPC低、中、高劑量組,每組10只。

對照組給予正常飲食,其他組給予高脂高糖飲食。4周后,除對照組外給予腹腔注射50 mg/kg鏈脲佐菌素誘導糖尿病產生,對照組給予腹腔注射等量生理鹽水。注射3 d后,大鼠尾靜脈的空腹血糖高于16.7 mmol/L為糖尿病大鼠造模成功。

1周后,OPC低、中、高劑量組分別給予125、250或500 mg/kg的OPC灌胃處理,對照組、模型組大鼠灌胃等體積的生理鹽水。在OPC治療8周后測定各組大鼠的空腹血糖和體重。OPC治療8周后處死大鼠。采集靜脈血樣,離心分離血清并儲存于-80 ℃。快速切除右腎樣本,稱重后并儲存于-80 ℃。計算大鼠腎重/體重比值作為腎臟指數。

1.3.2 生化指標檢測分析 使用代謝籠飼養各組大鼠24 h,并收集大鼠尿液。使用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中血糖、血尿素氮、血清肌酐和24 h尿微量白蛋白水平。

取大鼠左腎皮質勻漿后,在4℃下以9000×g離心30 min。使用ELISA試劑盒分別檢測大鼠血清、腎臟皮質勻漿液中的IL-1β、IL-6和MCP-1水平。

1.4 組織病理學檢查 將大鼠右腎制作成2 mm的切片,并用4%多聚甲醛固定。石蠟包埋后,使用HE和Masson染色分析后顯微鏡觀察和拍照大鼠腎小球的病理情況。

1.5 Western blot分析 取大鼠腎勻漿,并在含有蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑的細胞裂解緩沖液中裂解,提取蛋白質。通過10%血清十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠分離等量蛋白裂解物(30 μg),并電轉移至硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的PBS溶液封閉1 h后,加入稀釋好的TLR 4、p-p65、p65、p-IκB α、IκB α和β-actin一抗在4 ℃下孵育過夜,然后用辣根過氧化物酶偶聯的二抗室溫下震蕩孵育2 h,加入Millipore化學發光檢測試劑,然后放入顯影儀,使顯影液曝光蛋白顯影。對目標蛋白拍照后,使用Image-Pro Plus 6.0軟件定量蛋白條帶灰度值水平。

2 結 果

2.1 OPC對DKD大鼠腎病理影響 對照組大鼠HE染色顯示腎小球結構完整,基底膜完整,間質無炎性細胞浸潤;模型組腎小球硬化、萎縮顯著,間質可見炎性細胞廣泛浸潤;OPC低、中、高劑量組大鼠腎小球病理狀態較模型組改善顯著,尤其OPC中、高劑量組的腎小球毛細血管腔均勻一致,無明顯萎縮,間質炎癥細胞較模型組浸潤減輕。Masson染色顯示,對照組腎間質偶有少量藍色纖維著色,模型組腎臟內出現大量藍色著色纖維,而OPC中、高劑量組的大鼠腎臟中藍色著色纖維組織減少,腎小球、間質中僅少部分為藍色著色區(圖1)。

圖1 OPC對DKD大鼠腎組織病理的影響(HE和Masson染色,×100)OPC.低聚原花青素;DKD.糖尿病腎病。

2.2 OPC對DKD大鼠腎損傷的保護作用 在8周時,模型組,OPC低、中、高劑量組大鼠的空腹血糖水平、腎臟指數、24 h尿微量蛋白、血清肌酐和血尿素氮水平均高于對照組(P均<0.05)。OPC中、高劑量組大鼠的空腹血糖、腎臟指數、微量白蛋白、血清肌酐和血尿素氮水平均低于模型組(P均<0.05),而OPC低劑量組大鼠上述參數與模型組差異無統計學意義(表1)。

表1 不同組DKD大鼠8周時血糖、腎功能對比

2.3 OPC干預對DKD大鼠血清、腎皮質炎癥因子作用 8周時模型組,OPC低、中、高劑量組大鼠血清和腎皮質中的IL-1β、IL-6和MCP-1水平均高于對照組(P均<0.05), OPC中、高劑量組大鼠的血清、腎臟中IL-1β、IL-6和MCP-1水平均低于模型組(P均<0.05),而OPC低劑量組大鼠上述參數與模型組比較,差異無統計學意義(表2)。

表2 不同組DKD大鼠8周時血清和腎皮質中炎癥因子比較

2.4 OPC抑制DKD大鼠TLR 4/NF-κB通路的活化 使用Western blot法檢測結果顯示,模型組的TLR 4蛋白水平、p-IκBα/IκBα比值、p-p65/p65比值較對照組顯著升高;而與模型組相比,OPC中、高劑量組大鼠的TLR 4蛋白水平、p-IκBα/IκBα比值、p-p65/p65比值顯著降低(P均<0.05,圖2,表3)。

圖2 Western blot檢測的OPC干預對DKD大鼠腎組織中TLR4、p65、lκBα蛋白表達影響OPC.低聚原花青素;DKD.糖尿病腎病;TLR. Toll樣受體。

表3 不同組DKD大鼠TLR4、p65、lκBα蛋白相對表達量

3 討 論

DKD是糖尿病患者常見且又嚴重的并發癥之一,中醫藥治療DKD近年來取得較多的實驗研究進展[12]。OPC具有廣泛的藥理學活性,并已被證明可通過改善各種病理變化延緩DKD進展。研究表明OPC具有緩解DKD大鼠腎功能不全和腎臟炎癥、改善糖脂代謝紊亂、降低空腹血糖的趨勢[8,13]。此外,OPC可抑制腎纖維化,并抑制DKD的腎小管上皮細胞向間質細胞轉化[9]。本研究以STZ誘導的DKD大鼠模型為研究對象,探討OPC對DKD大鼠腎臟的保護作用及其分子機制。本研究證明,OPC不僅能減輕STZ誘導的DKD大鼠的腎功能損害和炎癥反應,而且能抑制STZ誘導的DKD大鼠TLR 4/NF-κB通路,提示OPC可能通過抑制TLR 4/NF-κB通路而減輕DKD。

本研究證明250、500 mg/kg OPC治療可明顯減輕DKD大鼠模型的腎損傷,8周時大鼠腎臟病理情況得到改善,Masson染色顯示OPC中、高劑量治療組腎臟纖維化顯著改善。表現為空腹血糖、腎臟指數、24 h尿微量蛋白、血清肌酐和血尿素氮的降低,而500 mg/kg的OPC可顯著減輕DKD大鼠模型的腎損傷、抑制炎癥因子IL-1β、IL-6和MCP-1水平。IL-1β和IL-6均具有廣泛生物活性,IL-1β有較強的促炎活性,而IL-6則是較強的繼發性炎癥介質。而MCP-1也是一種對單核細胞具有激活和趨化作用的趨化因子,在DKD炎癥過程中發揮著重要作用。越來越多的證據支持IL-1β、IL-6、MCP-1等炎癥因子和炎癥反應在DKD的發病機制中發揮重要作用[14,15]。在糖尿病患者中也證實了IL-1β、IL-6、MCP-1水平較高[16]。

TLR4/NF-κB通路已證實在多種炎癥相關疾病的發生機制中發揮作用,其通路激活與IL-1β、IL-6、MCP-1表達存在關系。關于TLR4/NF-κB通路發揮促炎作用參與到糖尿病、糖尿病并發癥的研究也有報道,TLR4通路激活后觸發的NF-κB依賴性炎癥反應,可加重急、慢性腎臟疾病[10,17,18]。足細胞、腎小管上皮細胞的TLR4可在高糖環境下被激活,進而活化NF-κB以及下游炎癥和纖維化反應的相關分子。使用小干擾RNA沉默近曲小管上皮細胞中TLR4,可減弱高糖誘導的IκB/NF-κB活化,并抑制下游炎癥細胞因子IL-6和趨化因子配體2(即MCP-1)[19]。在DKD患者的腎小管中也發現了TLR 4表達增加,且腎小管TLR4表達與間質巨噬細胞浸潤相關,與估計腎小球濾過率呈負相關,而TLR 4介導的途徑可能促進DKD的腎小管間質炎癥[20]。本研究同樣證明,OPC治療可抑制DKD大鼠腎臟中TLR 4/NF-κB通路的激活。既往類似研究表明,OPC通過抑制db/db小鼠糖尿病NF-κB活化而實現腎小球基底膜增厚、系膜擴張和腎小球面積,抑制氧化應激,改善腎臟纖維化[7]。

綜上所述,本研究發現OPC可通過減輕腎臟損傷、炎癥反應凋亡而減輕DKD。OPC對DKD的腎臟保護作用可能與抑制TLR 4/NF-κB通路有關。本研究有助于更好地理解OPC參與DKD的機制,并為OPC在DKD治療中的潛在應用提供新的證據。