環境脅迫對黃芩次生代謝產物的影響

王偉杰，徐東川，張秀如，于明，林慧彬

（1.山東中醫藥大學藥學院，濟南 250355；2.山東省中醫藥研究院，濟南 250014）

黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）的干燥根，是中國常用大宗藥材，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效［1］。研究表明，黃芩所含的黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等成分具有抗炎、抗氧化、抗癌、保護心血管、保肝、抗菌等作用［2，3］。根據“逆境效應”理論，適當的外部脅迫有利于藥用植物次生代謝產物的產生和積累［4］，通過提高黃酮類次生代謝產物的含量來提高藥效成為黃芩研究的熱點［5，6］。因此本研究分析了黃芩黃酮類化合物合成的途徑，總結了栽培過程中干旱、光照、溫度、土壤等環境因子對黃芩黃酮類化合物合成與積累的影響，以期為優化黃芩的栽培方法、提高黃芩產量和質量提供科學依據。

1 黃芩黃酮類化合物的合成途徑

通過對黃芩黃酮類化合物化學結構和合成機制的研究，有利于分析黃芩在面對脅迫時體內的關鍵基因、酶的動態變化，從而認識不同類型脅迫對黃芩生長發育的影響。黃芩黃酮類化合物是由環A 和環B 兩個苯環通過3C 鏈連接而成的具有三環化學結構（C6-C3-C6）的多酚類植物次生代謝產物，其生物合成經歷了三個階段。

在第一階段中，通過苯丙烷途徑將苯丙氨酸合成4-香豆酰輔酶A［7］。研究發現，參與這一過程的酶包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、香豆酸輔酶連接酶（4CL），在PAL 的作用下L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在C4H 催化下羥基化合成香豆酸，在4CL 的作用下，通過ATP 和Mg2+將香豆酸和肉桂酸分別轉化成香豆酰輔酶和肉桂酰輔酶［8］。

在第二階段中，在查爾酮合成酶（CHS）、查爾酮異構酶（CHI）兩種酶的作用下進入黃酮合成途徑。首先，CHS 能將一分子的香豆酰輔酶或者肉桂酰輔酶與三分子的丙二酰輔酶轉化成柚皮素查爾酮或者松屬素查爾酮。之后，CHI 催化上述兩種前體物質生成二氫黃酮類化合物柚皮素和松屬素。

在第三階段中，二氫黃酮會通過不同酶生成不同種類的黃酮類化合物。黃芩黃酮類化合物通過黃酮合酶（FNS）合成。黃芩苷元在黃芩素7-O-葡萄糖醛酸轉移酶（UBGAT）作用下轉化為黃芩苷類物質。黃芩苷類物質通過β-葡萄糖苷酸酶（GUS）水解為黃芩苷元類化合物。黃芩黃酮類化合物合成途徑如圖1。

圖1 黃芩黃酮類化合物合成途徑

2 環境脅迫對黃芩次生代謝產物的影響

2.1 干旱脅迫對黃芩次生代謝產物的影響

干旱脅迫是限制藥用植物生長最普遍的環境因素［9］。水分的缺失會導致植物葉片含水量降低，氣孔關閉，葉片內部CO2的濃度由于擴散阻力的增加而顯著降低，使得NADP+的濃度降低，最終使得氧自由基大量增加，從而影響黃芩正常的生長發育和次生代謝產物的積累［10］。程林［11］對一年生和二年生黃芩面對生態脅迫的生理生態變化進行了研究，發現處于營養期和生殖期的黃芩受到干旱的影響更大，因此在這個時期應該保證適當的水分供應。同時，管仁偉等［12］通過代謝組學研究了黃芩在干旱脅迫時體內黃酮類成分的變化規律，發現適度的干旱脅迫有利于黃芩有效成分的積累，但促進程度有限，而隨著干旱程度的加大和時間的延長會影響次生代謝產物的合成與積累。當黃芩面對干旱脅迫時，會通過一系列生理生化作用改變影響黃芩次生代謝產物合成的基因、酶等的表達量從而抵御干旱脅迫。Cheng等［13］研究在干旱脅迫過程中黃芩生理特性的變化，發現隨著干旱脅迫時間的延長，脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白質（SP）等滲透調節物質含量先升高后下降，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶活性先升高后降低。這說明黃芩能夠通過滲透調節物質的含量來改變水勢適應干旱脅迫，通過抗氧化酶含量變化減輕干旱脅迫影響。干旱脅迫還會誘導激素含量的變化以適應脅迫過程中產生的活性氧。轉錄調控因子能夠影響次生代謝產物合成過程中關鍵酶基因的表達。研究發現，在苯丙烷途徑過程中，SbMYB2 和SbMYB7 能夠通過上調合成的第一步，下調最后一步來影響黃酮類化合物的生物合成，而在GA3（赤霉素）處理后發現，SbMYB8 與SbCHS、SbC4H 的啟動子相結合從而提高黃酮類化合物合成過程中關鍵基因的表達［14-16］。因此，在干旱脅迫過程中，MYB 轉錄因子能夠通過影響關鍵酶基因的表達來響應干旱脅迫，進而促進次生代謝產物的積累。

2.2 光照脅迫對黃芩次生代謝產物的影響

光是植物生長發育過程中必不可少的環境因素，是植物進行光合作用制造有機物的重要能源［17］。光照能夠通過光照度、光周期以及光質三個方面影響植物的生長發育［18］。Sun等［19］在研究光強對黃芩生長的影響中發現，光強大能夠加快黃芩光合色素的合成，提高初級代謝產物的含量，增加了合成次生代謝產物的前體物質，與此同時促進了相關酶的表達從而提高黃芩次生代謝產物的含量。蔡葛平［20］分別用8、12、16 h 的光周期培養黃芩發現，有關黃芩黃酮類化合物合成的關鍵酶基因在黑暗條件下轉錄水平升高，因此，短光照周期（8 h 光照，16 h 黑暗）更有利于將糖類轉化成黃酮類化合物。研究光質對黃芩的影響發現，白光、藍光、紅光有利于黃芩鮮重的積累，而隨著紫外光照射時間的延長，會引起植物子葉卷曲、腋生分枝、葉片加厚等；在植物細胞內部導致葉綠素含量降低從而影響光合作用，并且呼吸作用增強，從而導致黃芩生物量降低；但是紫外光有利于PAL 和黃芩苷的合成［21-24］。

同時，研究發現光照脅迫通過內源激素的變化影響黃芩次生代謝產物的合成。光照能夠使刺激CHS 表達的生長激素（IAA）持續減少從而影響黃芩苷的合成；而細胞分裂素（ABA）在促進細胞分裂過程中會消耗大量的碳水化合物，影響了黃酮類化合物前體的合成［25］。

2.3 溫度脅迫對黃芩次生代謝產物的影響

溫度過高會使植物葉片萎靡、體內鈣離子沉淀，從而破壞植物體內葉綠素。同時，溫度能夠改變植物的生理生化特性，通過影響藥用植物體內酶的活性來影響其光合作用、呼吸作用等，進而改變體內次生代謝產物的含量［26］。不同植物生長發育與次生代謝產物積累所需要的最佳溫度不同。在對黃芩的研究中發現，在一定范圍內提高溫度會使黃芩生物量不斷加大，但是黃芩苷在25 ℃下積累量最高，較高或較低溫度均不利于黃芩苷的合成與積累［27］。Yuan等［28］的研究發現，長期的高溫環境盡管對黃芩細胞造成了一定的損傷，但是對細胞生長、干物質的積累并沒有產生影響。而黃芩細胞中PAL 活性降低，導致合成的黃芩苷、黃芩素含量降低，于此同時，POD、GUS 活性增強，促進黃芩苷水解為黃芩素參與到清除活性氧的工作中，二者共同導致了在持續高溫環境中黃芩黃酮類化合物含量下降。王帥［29］的研究發現，適當的低溫脅迫和較大的溫差更有利于黃芩體內次生代謝產物的積累。當黃芩受到適當的高溫或者低溫脅迫時，體內會產生大量的活性氧，抗氧化酶作為體內清除活性氧的第一道防線活性增強，而PAL 的活性會隨著溫度的提升而增強，這促進了黃芩體內黃芩苷含量的提升。但是隨著脅迫時間的延長和脅迫程度的加深，與黃酮類化合物合成相關的PAL、C4H、4CL、CHS 等酶活性增加，但是黃芩苷的含量卻下降，這可能是黃芩苷水解成黃芩素參與清除活性氧造成的。

2.4 土壤因素對黃芩次生代謝產物的影響

2.4.1 重金屬脅迫的影響 重金屬元素包括必要元素和非必要元素，其含量超過了植物的承受范圍就會對植物生長發育產生脅迫作用。土壤中重金屬元素能夠通過抑制葉綠素的合成以及細胞的生長，對藥用植物正常的生長發育產生影響。土壤中必要重金屬元素如Cu、Fe、Zn 等對植物生長發育、氧化還原反應以及其他代謝過程中起到重要的作用，同時一些非必要重金屬元素如Pb、Hg、As 等對不同藥用植物的作用需要具體研究［30］。Li等［31］在鋁脅迫對黃芩光合作用影響的研究中發現，當土壤環境的pH 低于5 時會使鋁變為Al3+，過量的鋁脅迫會使黃芩氣孔面積降低，胞間CO2濃度急劇上升，從而影響黃芩的光合作用。土壤中也有其他的無機元素如Se、K、Fe、Mn 對黃芩苷的合成具有促進作用［32，33］。Cao等［34］在砷對黃芩生長影響的研究中發現，在土壤中添加低濃度的As時，有利于促進黃芩根的生長，但是對于黃芩黃酮類化合物沒有顯著影響；在土壤中加入高濃度As時，會使黃芩生物量降低，黃芩苷、漢黃芩苷含量降低，但提升了黃芩素和漢黃芩素的含量，并且苷類減少的幅度與苷元上升幅度相似，這可能是因為砷脅迫時，促進了黃芩細胞的氧化應激反應，促使苷類化合物生成苷元類化合物以抵御脅迫。無機元素不僅能夠提供藥用植物根系所需要的營養來影響植物代謝活動以及生長發育，而且也是黃芩藥用活性成分的重要組成部分［35］。孟慶華等［36］的研究表明，適當增加或減少土壤中Zn2+、Mg2+兩種離子的濃度可促進黃芩生物量的積累，Zn2+能夠有效促進黃酮苷的合成，而Mg2+的作用相反。

2.4.2 營養脅迫的影響 營養缺乏會嚴重影響植物的生長速度和產量。魏東華等［37］的研究表明，施加復合肥的效果遠好于不施肥組和單一施肥組，并且N1P3K3和N2P3K1效果最好。表明磷肥對于黃芩苷的積累影響較大，磷能夠促進植物光合作用產物的合成與運輸，并且釋放能量促進各類化學反應的正常進行。曹鮮艷等［38］的研究發現，隨著施肥水平的不斷提高，可能會引起黃芩初生代謝產物大量增加，稀釋了黃芩苷的含量，黃芩苷含量增幅明顯降低，造成了黃芩苷含量先降低后升高。而施肥量持續增加，反而會導致黃芩產量減少。碳水化合物除了作為重要的能量來源，也能夠影響初級和次級代謝［39］。在Park等［40］的研究中，采用不同碳水化合物培養黃芩，以確定適合黃芩黃酮類化合物合成積累的最佳碳源，結果表明，蔗糖能夠促進黃芩生長以及有利于黃芩素的積累，果糖是黃芩苷合成的最佳碳源，半乳糖對漢黃芩素的促進作用最大。

3 小結

黃芩生長過程中遭受脅迫時，會引起機體的一系列反應。在黃芩的表觀性狀和生長發育上會引起植株矮小、葉片枯黃等。對于黃芩體內生理特性會通過激活抗氧化酶活性、合成黃酮類次生代謝產物、調節細胞滲透平衡等方式清除體內過剩的活性氧以抵抗脅迫。但是，也有研究表明在適當程度的環境脅迫下，有利于體內次生代謝產物的積累，從而提高黃芩的藥用價值。

目前，對于黃芩面對環境影響的研究主要集中在水分、光照、溫度、土壤條件等單一因素的討論上，而對于復合脅迫的報道很少。因此，進行一些貼近黃芩道地產區環境的復合脅迫研究能夠更好地了解環境脅迫對黃芩生長發育和次生代謝產物合成的影響。黃芩對脅迫的響應機制主要集中在表觀形態、抗氧化酶、合成關鍵酶等的探討上，對于黃芩次生代謝產物在基因、轉錄方面調控機制的探究不夠全面。進一步探究黃芩響應環境脅迫的作用機制，有利于提高黃芩次生代謝產物、優選優良的抗逆品種，為黃芩栽培提供指導。