一株仔豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌分離鑒定、耐藥性分析及其卵黃抗體的制備

尹家銀，喻嬌，唐青海，滕威，陽坤，曹馨，徐晴，劉博，李澤

（衡陽師范學院生命科學與環(huán)境學院/南岳山區(qū)生物資源保護與利用湖南省重點實驗室/動物微生物新型檢測技術(shù)及生物制劑衡陽市重點實驗室，湖南 衡陽 421008）

豬大腸桿菌病是一類由腸道致病性大腸桿菌引起的傳染性疾病，包括黃痢、白痢以及水腫病，發(fā)病率及死亡率均較高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失［1］。其中，仔豬斷奶后腹瀉與腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（EnterotoxigenicE.coli，ETEC）在腸道定植有較大關(guān)系，每年其導致的死亡占全球仔豬死亡的50%，是影響生豬生產(chǎn)的嚴重威脅之一［2，3］。ETEC 的主要毒力基因是elt、esta、estb和stx2e，其致病過程依賴黏附素和腸毒素的共同作用［4-6］。因致病性大腸桿菌的血清型多、變異快，接種疫苗一般達不到預(yù)防效果，臨床常用抗生素治療仔豬細菌性腹瀉。而大腸桿菌易產(chǎn)生耐藥性，甚至形成多重交叉耐藥株，致使細菌耐藥性問題愈發(fā)嚴重［7］。劉鑫宇等［8］對西藏林芝地區(qū)分離的豬源大腸桿菌（81 株）毒力基因檢測的結(jié)果顯示，毒力基因STb、STa+STb、eaeA出現(xiàn)的頻率最高。佟春玉等［9］對黑龍江省仔豬腹瀉大腸桿菌毒力基因檢測的結(jié)果顯示，STa、STb的檢出率共占腸毒素檢出株（74 株）的94.59%。Shahrani等［10］研究表明，在伊朗地區(qū)分離出的致病性大腸桿菌（620 株）對青霉素、鏈霉素、四環(huán)素等藥物耐藥率分別為100%、98.25%、98.09%。Shin等［11］在韓國地區(qū)分離出的致病性大腸桿菌（205 株）對鏈霉素、四環(huán)素、新霉素、頭孢噻酚等藥物耐藥，耐藥率分別為63.1%、54.5%、40.3%、32.8%。目前，主要采用廣譜抗生素治療豬大腸桿菌病，將導致細菌耐藥、抗生素殘留及食品安全等問題。因此，急需一種綠色安全的抗生素替代品，而IgY 作為理想的抗生素替代品之一，在養(yǎng)殖業(yè)具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

卵黃抗體（Egg yolk immunoglobulins，IgY）是禽卵黃中的一種免疫球蛋白，相比哺乳動物的IgG 具有更好的穩(wěn)定性［12］，在疾病檢測、診斷、防治方面具有多種優(yōu)點，是一種理想的抗生素替代品［13］。劉文鑫等［14］以重組E.coliK88ab 和K99 蛋白為抗原制備IgY，其預(yù)防、治療有效率達100%。黨如意等［15］以E.coliK88 蛋白為免疫原制備IgY，其對仔豬黃痢的治愈率為93.75%，遠高于慶大霉素的，表明IgY 在養(yǎng)殖業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究擬從某養(yǎng)豬場仔豬腹瀉糞便樣品中分離一株致病性大腸桿菌、分析其毒力基因和耐藥性、制備特異性卵黃抗體，為臨床仔豬大腸桿菌病的防治提供依據(jù)和技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 疑似大腸桿菌感染的腹瀉仔豬糞便樣品由湖南省衡陽市某規(guī)模化養(yǎng)豬場提供。

1.1.2 主要試劑 ExTaq酶、BamHⅠ、Hind Ⅲ與DNA Marker，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；PCR 清潔試劑盒與質(zhì)粒提取試劑盒，購自Axygen 公司；腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管與藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；聚乙二醇（PEG-6000）等分析純化學試劑，購自Solarbio 公司；MONTANIDETMISA71VG、201VG、15AVG系列疫苗佐劑，由法國SEPPIC 公司生產(chǎn)；Bradford 蛋白濃度測定試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與純化 將采集的病料用500 μL滅菌PBS 溶液稀釋，接種于麥康凱（MC）培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h。挑取粉紅、不透明單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h。將菌液在MC 培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)16 h。連續(xù)純化3代，取第3 代菌液在LB 固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)16 h，觀察菌落形態(tài)特征。

1.2.2 細菌生化特性鑒定 取第三代菌液接種至生化鑒定管內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)1～2 d，記錄試驗現(xiàn)象，根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》對細菌進行鑒定。

1.2.3 細菌毒力基因檢測 取第三代菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h。提取菌液DNA，根據(jù)參考文獻［16］設(shè)計引物，引物信息見表1。PCR擴增體系（總體積25 μL）：ExTaq酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 補至25 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取3 μL PCR 產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。將目的基因克隆至pMD-19T 載體中，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞中，篩選陽性質(zhì)粒，利用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，將陽性質(zhì)粒送至深圳華大基因股份有限公司測序，采用DNAStar 和MEGA 等軟件對所得序列與GenBank 中的毒力基因序列進行同源性比對與進化分析。

表1 引物序列及其反應(yīng)條件

1.2.4 藥敏試驗 采用K-B 紙片擴散法測定分離菌株對15 種常見抗菌藥物的敏感性，藥敏敏感性判定按杭州微生物試劑有限公司對抑菌范圍標準的解釋進行。

1.2.5 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌抗原的制備 取20 μL 第三代菌液接種于200 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃下220 r/min 培養(yǎng)16 h，培養(yǎng)2 瓶菌液。

1）全菌體滅活法制備抗原。培養(yǎng)后1 瓶菌液中加入甲醛溶液至終濃度為0.2%，37 ℃滅活48 h，進行無菌檢驗，無細菌生長即合格。

2）超聲波破碎法制備抗原。取另1 瓶菌液4 ℃下10 000 r/min 離心5 min，收集菌體沉淀，用PBS溶液重懸后進行超聲波裂解，超聲5 s，間隔5 s，共60 min。

1.2.6 疫苗制備 采用乳化法制備大腸桿菌滅活疫苗，按照佐劑廠家說明書將0.2%甲醛處理菌液和超聲波破碎處理菌液分別與佐劑ISA 71VG、ISA 210VG 和ISA 15AVG 按7∶3、1∶1 和1.5∶8.5 比例乳化。等體積疫苗中抗原含量要保持一致。

1.2.7 動物免疫 將24 只產(chǎn)蛋高峰期的蛋雞隨機分成6 組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組），每組4 只。6 組疫苗抗原與佐劑成分依次為0.2%甲醛處理的菌液+ISA 71VG、0.2%甲醛處理的菌液+ISA 201VG、0.2%甲醛處理的菌液+ISA 15AVG、超聲波破碎處理的菌液+ISA 71VG、超聲波破碎處理的菌液+ISA 201VG、超聲波破碎處理的菌液+ISA 15AVG。免疫劑量為1 mL/羽，于胸部肌肉注射疫苗，共免疫2次，間隔21 d。

1.2.8 高免卵黃抗體提取與純度檢測 收集首免后0、7、14、21、35、49、63 d 的雞蛋，4 ℃保存。以聚乙二醇沉淀法提取IgY，卵黃與PBS 溶液按1∶2 比例混合，劇烈振蕩30 s。加3.5 %（W/V）聚乙二醇（PEG-6000）充分混勻，37 ℃水浴15 min，取出靜置作用1 h；4 ℃下12 000 r/min 離心30 min，過濾，濾液中加8.5 %（W/V）PEG-6000，37 ℃水浴15 min，充分攪拌溶解。4 ℃下12 000 r/min 離心30 min，棄上清液，在沉淀物中加PBS 溶液溶解，加12 %（W/V）（1.2 g）PEG-6000，37 ℃水浴15 min。4 ℃下12 000 r/min 離心30 min，棄上清液，在沉淀物中加PBS 溶液溶解（每10 mL 卵黃原液加入1 mL PBS 溶液溶解），置于透析袋內(nèi)透析，-20 ℃保存。采用SDS-PAGE 電泳法評估IgY 純度，若70 ku 處的重鏈條帶和25 ku 處的輕鏈條帶同時存在且?guī)兔黠@，則該提取物合格；若重鏈或輕鏈缺一條或均無，則提取物不合格，需重新提取。

1.2.9 蛋雞血清抗體制備 首次免疫后0、21、35、49 d 于蛋雞翼下靜脈采血1 mL，37 ℃靜置3 h，血清自然析出后，4 ℃下5 000 r/min 離心3 min，分離血清，棄沉淀物，-20 ℃保存。

1.2.10 抗原及IgY 濃度測定 按照Bradford 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）的說明書操作，并以標準蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線方程及樣品使用體積，求得樣品蛋白含量。

1.2.11 抗體效價測定 采用雙向瓊脂擴散試驗進行抗體效價測定。在溴酚藍瓊脂平板上打孔，打孔器孔徑5 mm，孔距4 mm，棄去瓊脂塊，并加熱封底。于中間孔注入抗體，周圍孔注入梯度稀釋的滅活抗原（或中間孔注入滅活抗原，周圍孔注入梯度稀釋抗體）。將加好樣的瓊脂平皿放入濕盒中，37 ℃培養(yǎng)48～72 h。兩孔之間出現(xiàn)清晰白色沉淀線為陽性，無沉淀線為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離鑒定結(jié)果

分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基上具有粉紅色、邊緣光滑整齊、濕潤扁平等特征（圖1）。

圖1 分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.2 分離菌株的生化特性鑒定結(jié)果

由表2 可知，分離菌株可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、棉子糖等，不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、硫化氫、枸櫞酸鹽等。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》，該菌株生化反應(yīng)結(jié)果符合大腸桿菌的生化特性。

2.3 毒力因子PCR 鑒定結(jié)果

2.3.1elt基因PCR 擴增elt基因PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約272 bp 處出現(xiàn)特異性擴增條帶（圖2），與預(yù)期大小相符。

2.3.2estb基因PCR 擴增estb基因PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約113 bp 處出現(xiàn)特異性擴增條帶（圖3），與預(yù)期大小相符。

圖3 estb 基因的PCR 擴增電泳結(jié)果

2.4 重組克隆載體雙酶切鑒定結(jié)果

2.4.1 pMD19T-elt 重組克隆載體的雙酶切鑒定結(jié)果 pMD19T-elt 重組克隆載體的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在第6 號泳道約272 bp處出現(xiàn)了特異性擴增條帶，與目的基因大小相符，說明目的基因已成功克隆至pMD-19T 載體中。

2.4.2 pMD19T-estb 重組克隆載體的雙酶切鑒定結(jié)果 pMD19T-estb 重組克隆載體的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在第2、4、6 號泳道約113 bp處出現(xiàn)了特異性擴增條帶，與目的基因大小相符，說明目的基因已成功克隆至pMD-19T載體中。

圖5 重組克隆載體pMD-19T-estb 的酶切鑒定

2.5 elt 基因和estb 基因核苷酸序列、參考毒株同源性與遺傳進化分析結(jié)果

2.5.1E.coli-elt 基因核苷酸序列、參考毒株同源性與遺傳進化分析結(jié)果 與參考毒株（表3）比較發(fā)現(xiàn)，E.coli-elt 與越南2017 年毒株ECOPV-HL（MF990203）和EcoPV-173（MF990202）、美國2015年流行毒株UMNK88（CP002732）、巴西2008 年毒株225-IV（EU113245）、中 國2006 年毒株Eco412（DQ778054）及中國臺灣2002 年毒株CH-C2（AF242418）基因核苷酸序列的同源性均在99%以上。使用MEGA 5.0 軟件建立遺傳進化樹，分析分離株的elt基因與國內(nèi)外已發(fā)表的毒株的關(guān)系。結(jié)果表明，分離株與越南流行毒株如ECOPV-HL（MF990203）、EcoPV-173（MF990202）、中國流行毒株如195（EF057802）、美國流行毒株如UMNK88（CP002732）等處于同一分支，遺傳關(guān)系最近。而與丹麥株CFSAN018748、瑞士株14OD0056 和美國經(jīng)典菌株F6699、F56656C1 處于不同分支，親緣關(guān)系較遠（圖6）。

表3 elt基因的參考菌株

圖6 elt基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5.2E.coli-estb 基因核苷酸序列與參考毒株同源性與遺傳進化分析結(jié)果 通過與參考毒株（表4）的對比發(fā)現(xiàn)，E.coli-estb 與中國近年新流行毒株CV839-15（CP024975）與及德國流行毒株EC32173（CP000913）基因核苷酸序列的同源性均為99.1%，與法國流行毒株17-462F（MH847580）及美國流行毒株UMNK88（CP002732）基因核苷酸序列的同源性均為100%。使用MEGA 5.0 軟件建立遺傳進化樹，分析分離株estb基因與國內(nèi)外已發(fā)表的毒株的關(guān)系（圖7）。結(jié)果表明，分離株與美國流行毒株如UMNK88（CP002732）、法國流 行毒株 如17-462（MH847580）、德國流 行毒株 如 EC32173（CP000913）、中國流行毒株CV839-15（CP024975）處于同一分支，親緣關(guān)系較近，而與丹麥株CFSAN018748（CP028195）、瑞士株 14OD0056（MG904993）、15OD0495（MG904998）等處于不同分支，親緣關(guān)系較遠。

表4 estb 基因的參考菌株

圖7 estb 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 分離菌株的藥物敏感性

在測定的15 種藥物中，分離菌株對多西環(huán)素、呋喃唑酮以及多種氨基糖苷類和喹諾酮類抗菌藥物耐藥，對其他藥物表現(xiàn)為中介或敏感（表5）。

表5 分離菌株的藥物敏感性

2.7 免疫后各組蛋雞產(chǎn)蛋率

2019 年4 月13 日至2019 年6 月2日，于每天18：20—18：50 記錄每組蛋雞的產(chǎn)蛋數(shù)。計算Ⅰ～Ⅵ組蛋 雞50 d 的平均 產(chǎn)蛋率 分別為（40.5±28.2）%、（51.0±33.2）%、（43.0±24.0）%、（43.0±24.0）%、（50.5±32.6）%、（55.5±32.9）%。

2.8 卵黃抗體的純度檢驗

SDS-PAGE 檢測純度結(jié)果（圖8）顯示，粗提和透析后IgY 的重鏈（約70 ku）和輕鏈（約25 ku）都較明顯，透析后的雜帶比粗提少，抗體純度高。

圖8 E.coli-HuNHY19 菌株卵黃抗體的SDS-PAGE 檢測

2.9 抗原、IgY 濃度的測定

用Bradford 法測得標準曲線的結(jié)果見圖9。結(jié)果表明，牛血清白蛋白在范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。測得抗原的OD為2.365，計算出抗原濃度為2.596 mg/mL。首免后7、14、19、49、56 d 各組卵黃抗體蛋白含量最高值分別出現(xiàn)在Ⅴ組（1.153 mg/g 卵黃）、Ⅳ組（1.427 mg/g 卵黃）、Ⅰ組（1.006 mg/g 卵黃）、Ⅳ組（1.428 mg/g卵黃）、Ⅲ組（1.462 mg/g 卵黃）。各組卵黃抗體含量在首免后19 d 均出現(xiàn)大幅下降，而在首免后49 d 呈上升趨勢（圖10）。

圖9 Bradford 法測定蛋白含量標準曲線

圖10 各組卵黃抗體含量的消長規(guī)律

2.10 抗體效價檢測

首免后21 d蛋雞血樣中Ⅳ組效價最高，為1∶16；其次是Ⅰ組，效價為1∶4；Ⅱ組、Ⅴ組效價均為1∶2；Ⅲ組效價為1∶1。首免后35 d 蛋雞血樣中Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組效價均為1∶4；Ⅴ組和Ⅵ組效價均為1∶2。首免后49 d蛋雞血樣中Ⅰ組效價最高，為1∶8；其次是Ⅳ組，效價為1∶4；Ⅱ組和Ⅴ組效價為1∶2；Ⅲ組和Ⅵ組效價為1∶1（圖11）。首免后49 d Ⅳ組蛋雞卵黃抗體可與8 倍稀釋抗原（0.209 mg/mL）特異性結(jié)合，效價達1∶4。

圖11 各組蛋雞血清抗體效價變化

3 討論

本試驗通過病例進行細菌學診斷，成功分離得到一株形態(tài)特征、生化特性均與大腸桿菌相符［17-19］的細菌。隨著中國養(yǎng)豬業(yè)集約化發(fā)展，豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的致病性越來越強。由于ETEC 所帶的毒力基因與致病性密切相關(guān)，因此檢測細菌的毒力基因是確定致病性大腸桿菌常用方法。本試驗檢測出分離菌攜帶elt 和estb 兩種毒力因子，與葛晨玲等［20］對廣西地區(qū)ETEC 毒力基因的研究結(jié)果相同。劉玉芹等［21］對河北地區(qū)ETEC 毒力基因的研究結(jié)果顯示，40 株分離菌全部含有腸毒素ST。不同地區(qū)ETEC 的毒力基因主要是腸毒素，可初步判定造成該規(guī)模豬場仔豬腹瀉的主要致病原因是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌。

目前，國內(nèi)外對豬源大腸桿菌的耐藥性已有大量研究。如黃琴［22］對豬源大腸桿菌（83 株）耐藥性的研究結(jié)果顯示，菌株對復方新諾明的耐藥率接近100%；與本試驗關(guān)于分離菌對復方新諾明的耐藥結(jié)果不同。本試驗藥敏結(jié)果顯示分離菌對復方新諾明和部分β-內(nèi)酰胺類藥物敏感，對頭孢曲松、多黏菌素B 中介，對多西環(huán)素、呋喃唑酮以及多種氨基糖苷類和喹諾酮類抗菌藥物耐藥。García-Meni?o等［23］對西班牙工廠化養(yǎng)豬場（2005—2017 年）的186 個致瀉性大腸桿菌抗生素耐藥率的研究顯示，50%以上的分離菌株對氯霉素、慶大霉素、環(huán)丙星沙不敏感。趙位等［24］對野豬源大腸桿菌耐藥性的研究結(jié)果與本研究相符，均對部分β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類藥物耐藥。大腸桿菌藥敏結(jié)果不同的原因可能是不同時期、不同地區(qū)流行使用的抗菌藥物不同；也可能是用藥不規(guī)范，導致細菌耐藥性增強。耐藥菌的產(chǎn)生和擴散使得獲取最新抗菌物質(zhì)變得更加迫切。當前豬場大腸桿菌的耐藥性已經(jīng)非常普遍，應(yīng)引起高度重視。

本研究采用全菌體滅活和超聲波破碎滅活兩種方法制備大腸桿菌滅活疫苗。由于不同佐劑與同一免疫原配伍所制的疫苗，產(chǎn)生的抗體存在差異［25］。本試驗將上述兩種方法制備的滅活抗原分別與ISA 71VG、ISA 201VG、ISA 15AVG 3 種不同類型的油性佐劑配伍。通過對各組蛋雞產(chǎn)蛋率差異的比較，ISA 71VG 佐劑對蛋雞產(chǎn)蛋率影響較小、波動相對穩(wěn)定。SDS-PAGE 檢測結(jié)果顯示，透析前后IgY 重、輕鏈條帶均明顯，雜蛋白占比低，說明抗體結(jié)構(gòu)完整、純度高。通過對各組卵黃抗體含量消長規(guī)律的分析，首免后19 d 各組卵黃抗體的蛋白含量均呈現(xiàn)出下降后上升的趨勢，可能是由于首免激活了蛋雞的初次免疫應(yīng)答，血液中抗體經(jīng)過潛伏期才能轉(zhuǎn)移至卵黃，在高峰期后抗體量下降；而后蛋白含量上升是由于二免激活了機體的再次免疫應(yīng)答，迅速產(chǎn)生大量抗體。首免后56 d 0.2%甲醛處理的菌液與ISA 15AVG 配伍所致疫苗的卵黃抗體含量最高（1.462 mg/g 卵黃），超聲波破碎處理的菌液與ISA 71VG 配伍所制疫苗的卵黃抗體含量次之（1.459 mg/g 卵黃），但該結(jié)果并不能反映出特異性卵黃抗體的含量，仍需結(jié)合各組抗體的效價對各組疫苗的免疫效果進行綜合判斷。

在相同佐劑配伍的條件下，比較不同滅活抗原對抗體效價的影響。ISA 71VG 佐劑配伍下，超聲波破碎組和全菌體滅活組的血清抗體效價分別在首免后21 d 和49 d 達到最高峰，前者最高效價達1∶16，后者最高效價為1∶8。超聲波破碎組抗體效價呈下降趨勢，但整體效果優(yōu)于全菌體滅活組，其抗體效價的強度高于全菌體滅活組，但持久度低于全菌體滅活組。這可能是超聲波破碎使抗原的內(nèi)含物釋放，所制備的疫苗能夠迅速刺激機體識別并產(chǎn)生免疫反應(yīng)。隨著時間的延長，破碎后的抗原比全菌體滅活抗原可能更易于分解、吞噬，因此其抗體效價持久度不如后者。ISA 201VG、ISA 15AVG 佐劑配伍下，全菌體滅活抗原免疫原性均高于超聲波破碎抗原。在同種滅活抗原配伍的條件下，比較不同佐劑對抗體效價的影響。無論采用全菌體滅活法還是超聲波破碎法制備滅活抗原，ISA 71VG 組的血清抗體效價的強度、持久度均高于ISA 201VG 組和ISA 15AVG 組。因此，綜合蛋雞應(yīng)激反應(yīng)、產(chǎn)蛋率及抗體效價等指標，ISA 71VG 佐劑免疫效果最佳，與韓濤濤等［26］的研究結(jié)果相符。