陳艾提取物的總黃酮、總酚酸含量及抗氧化活性研究

王倩，楊利博，崔美香，王乃澤，趙敏，武玉翠

（1.河北工程大學園林與生態工程學院，河北 邯鄲 056038；2.河北交通職業技術學院，石家莊 050035）

艾草（Artemisia argyiLevl.et Van）是菊科蒿屬草本植物，因其全草入藥，具有溫經止痛、祛風散寒、抑菌抗蟲和抗氧化等功效［1］，臨床上常用于婦科、消化系統、皮膚類等病癥的治療。艾草的主要活性成分包括揮發油、多糖類化合物、黃酮類化合物、酚酸類化合物等，有非常重要的藥用價值［2］。現代研究表明，艾草有抗氧化、抗腫瘤、抑菌等多種藥理活性，這主要歸功于艾葉中揮發油、酚酸以及黃酮類成分的共同作用，從中將有效成分提取出來是實現其藥用價值的關鍵環節［3，4］。陳艾需要時間的沉淀，經過四季交替才能完成，時間越長，艾的味道越醇厚，疏通經脈的效果也會越好，所以才有“七年之病，求三年之艾”的說法。

目前，關于艾草的成分研究主要針對其揮發油以及多糖的測定，本研究以不同年份陳艾及其脫絨后陳艾殘渣為原料，用超聲輔助提取總黃酮、總酚酸，探究不同年份陳艾及其艾渣中含量變化趨勢，考察與其抗氧化活性的相關性，從科學的角度對艾草的使用價值提供理論基礎，進一步為艾草的高效利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

YB-1000A 型多功能藥物粉碎機，永康市速鋒工貿有限公司；Adventurer AX 系列萬分之一電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；KQ-100DE 型數控超聲波清洗器，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；HH-S 型恒溫水溫箱，天津賽得利實驗分析儀器制造廠；ST8 ST8R 型熱電高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技公司；TU-1810 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 材料與試劑

材料：產自河北邯鄲新鮮艾草、儲存一年陳艾、儲存三年陳艾及脫絨后的艾渣。分別粉碎后過60目篩，粉末裝密封袋置于陰涼干燥處儲存備用。

試劑：蘆丁對照品、沒食子酸對照品、2，2-聯苯基-1-苦基肼 基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-聯氨-雙二胺鹽［2，2′-azino-bis（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid）di-ammonium salt，ABTS］、奎諾二甲基丙烯酸酯（水溶性維生素E，6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid，Trolox）均購于美國Sigma 公司；無水乙醇、Folin-Ciocalteu 試劑、甲醇、5% NaNO2、10% Al-Cl3、4%NaOH、Na2CO3、K2S2O8。

1.3 試驗方法

1.3.1 總黃酮的提取與測定

1）總黃酮的提取。將干燥的待測樣品放入粉碎機打磨成粉末狀，過篩后裝入瓶中備用。稱取樣品粉末20 mg，加入乙醇溶液進行提取，超聲完畢后，5 000 r/min離心3 min，將上清液移至另一離心管；殘渣復提1次，2次上清液合并為樣品提取液。

2）標準曲線的繪制。以蘆丁為標準品，精密稱取10.0 mg 用60%乙醇配制濃度為1.0 mg/mL 的標準蘆丁對照液；依次稀釋成濃度為0.50、0.40、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.01 mg/mL 的溶液，并各取500 μL 于10 mL 離心管中；依次加入4 mL 60%乙醇、100 μL 5% NaNO2溶液，充分混勻并室溫靜置6 min；再加入100 μL 10% AlCl3溶液，充分混勻并靜置6 min 逐漸變色；最后加入300 μL 4% NaOH 溶液，搖勻，室溫顯色反應10 min；以60%乙醇為空白校正，采用紫外可見分光光度法于波長510 nm 處測定吸光度，試驗重復3 次。以平均吸光度為縱坐標，蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標計算得出線性回歸方程y=1.029 5x-0.001 8，r2=0.999 9。

3）精密度試驗。從0.2 mg/mL 蘆丁溶液中吸取500 μL，取6份，測定其吸光度，結果相對標準偏差（RSD）為1.03%，表明該方法精密度良好。

4）重復性試驗。精密稱取6 份待測樣品，完成樣品溶液制備，測定并計算樣品中總黃酮含量，為（189.55±1.14）mg/g，RSD為0.6%。

5）穩定性試驗。取待測樣品分別于0、1、2、3、4 h 進行測定。結果顯示，樣品中總黃酮的平均質量分數為（190.23±1.09）mg/g，RSD為0.57%，表明其溶液在4 h 內穩定。

1.3.2 總酚酸的提取與測定

1）總酚酸的提取。稱取一定重量待測樣品粉末，加入適量乙醇溶液進行超聲提取，5 000 r/min 離心3 min，將上清液移至另一離心管；殘渣復提1次，2 次上清液合并為樣品提取液。

2）標準曲線的繪制。將沒食子酸作為標準品，精密稱取10.0 mg，用去離子水制成終濃度為1.0 mg/mL的沒食子酸對照品母液；再依次用去離子水稀釋至濃度分別為5、10、20、30、40、50、100 μg/mL 的梯度溶液；取稀釋后各梯度溶液200 μL 于10 mL 離心管內，分別加入200 μL Folin-Ciocalteu 試劑，室溫暗反應8 min；最后加入600 μL Na2CO3（7.5%，W/V）、4 mL去離子水，充分混勻后，40 ℃水浴30 min。以去離子水為空白校正，于波長765 nm 處測定吸光度，試驗重復3 次。以平均吸光度為縱坐標，沒食子酸濃度（mg/mL）為橫坐標計算得出線性回歸方程y=4.956 8x+0.014 3，r2=0.999 2。

3）精密度試驗。從1.0 mg/mL 沒食子酸對照品母液中精確吸取200 μL，取6份，測定吸光度，結果相對標準偏差（RSD）為0.98%，表明該方法精密度良好。

4）重復性試驗。精密稱取待測樣品6份，完成樣品溶液制備，測定并計算樣品中總酚酸含量，為（45.98±0.76）mg/g，RSD為1.66%。

5）穩定性試驗。取待測樣品分別于0、1、2、3、4 h 測定。結果顯示，樣品中總酚酸的平均質量分數為（39.39±1.16）mg/g，RSD為2.93%，表明其溶液在4 h 內穩定。

1.3.3 總黃酮抗氧化活性試驗

1）清除DPPH 自由基能力的測定。精密稱取1 mg DPPH，使用甲醇將其完全溶解后定容至100 mL的容量瓶內，得到濃度為0.001%的DPPH 反應溶液，避光儲存。以提取液中所含材料的質量濃度為單位，分別將樣品提取液稀釋成濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mg/mL，各取不同濃度梯度的樣品溶液200 μL，依次加入1.2 mL 的DPPH 反應溶液，搖晃均勻后，室溫避光靜置30 min，于波長517 nm 處測定反應液吸光度（A樣品），同時將甲醇反應液的吸光度作為空白（A空白），試驗重復3 次取平均值。依照DPPH 自由基清除率公式，計算出不同濃度下樣品DPPH 自由基清除率，以樣品濃度為橫坐標，DPPH 清除率為縱坐標繪制標準曲線。通過GraphPad Prism 軟件計算出不同濃度下樣品自由基清除能力的IC50值。DPPH自由基清除率公式如下：

2）ABTS+自由基清除能力測定。精密稱取384.076 mg ABTS，用去離子水定容至100 mL 容量瓶中，配制成濃度為7 mmol/L 的ABTS 溶液。稱取66.284 mg K2S2O8，用去離子水定容至100 mL 容量瓶內，配制成濃度為2.45 mmol/L 的K2S2O8水溶液。將上述2 種溶液各取10 mL 混合均勻，室溫避光條件下放置12～16 h，得到ABTS+工作液母液。用適量的無水乙醇將其稀釋至波長734 nm 處吸光度為0.7±0.02 的溶液，制成ABTS+工作液。以水溶性維生素E（Trolox）作為標準品，使用無水乙醇稀釋成濃度為0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24 mg/mL的標準品溶液。再分別取0.1 mL 上述各濃度溶液，依次加入4 mL ABTS+工作液，室溫避光反應6 min后，于734 nm 處測定吸光度（A樣品），同時將去離子水反應液的吸光度作為空白（A空白）。依照ABTS+自由基清除率公式，計算ABTS+自由基清除率，以樣品濃度為橫坐標，ABTS+自由基清除率為縱坐標繪制標準曲線。將待測樣品提取液適當稀釋后，按照上述方法進行測定，計算出ABTS+自由基清除率，帶入相對于水溶性維生素E（Trolox）含量公式Y=377.96X+8.429 4，得出與單位干材料樣品同等ABTS+自由基清除能力的Trolox 等同物質含量，以Trolox 抗氧化活性當量（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）為單位。ABTS+自由基清除率公式如下：

2 結果與分析

2.1 樣品中總黃酮含量

由圖1 可知，不同放置時間下艾草及艾渣總黃酮含量差異明顯。總黃酮含量為三年陳艾＞一年陳艾＞三年陳艾艾渣＞新鮮艾草。三年陳艾提取黃酮效果最好，為191.33 mg/g，約是脫絨后艾渣總黃酮含量的2.95倍，一年陳艾總黃酮含量的2倍，新鮮艾草總黃酮含量的5.93 倍。可見脫絨后艾渣仍含有黃酮類物質，并且有一定的利用價值。

圖1 不同年份陳艾及艾渣中總黃酮含量

2.2 樣品中總酚酸含量

由圖2 可知，新鮮艾草、一年陳艾、三年陳艾及脫絨后艾渣的總酚酸含量有顯著差異，分別為5.52、30.40、43.45、19.88 mg/g。總酚酸含量高低依次為三年陳艾＞一年陳艾＞三年陳艾艾渣＞新鮮艾草，說明三年陳艾使用價值最高，其脫絨后艾渣也為今后提供了重要的研究價值。

圖2 不同年份陳艾及艾渣中總酚酸含量

2.3 樣品提取物清除DPPH 自由基能力

不同年份陳艾及脫絨后艾渣提取物在不同樣品濃度條件下清除DPPH 自由基能力如圖3 所示。在相同濃度范圍內，不同年份的提取物對DPPH 自由基的清除作用存在差異。當樣品濃度在0.05～0.20 mg/mL時，各樣品提取物對DPPH 自由基的清除能力增長較快。其中，三年陳艾提取物對DPPH 自由基清除率從25.89%增加到94.15%；而新鮮艾草提取物對DPPH 自由基清除率增長較為緩慢，由4.85%增加到17.15%。當樣品濃度在0.25～0.35 mg/mL時，一年陳艾提取物對DPPH 自由基的清除率約達94.51%，三年陳艾提取物高達96.81%。新鮮艾草、一年陳艾、三年陳艾及脫絨后艾渣的IC50 值分別為0.69、0.13、0.09、0.41 mg/mL。三年陳艾提取物IC50值最低，可見三年陳艾提取物對DPPH 自由基有較強的清除作用。

圖3 不同濃度下陳艾及艾渣提取物DPPH 自由基清除活性比較

2.4 樣品提取物清除ABTS+自由基能力

不同年份陳艾及脫絨后艾渣提取物在不同濃度條件下清除ABTS+自由基能力如圖4 所示。各樣品對ABTS+自由基的清除率分別為新鮮艾草23.53%、一年陳艾53.24%、三年陳艾53.84%、三年脫絨后艾渣27.39%。對ABTS+自由基的清除能力依次為三年陳艾＞一年陳艾＞三年陳艾艾渣＞新鮮艾草，說明三年陳艾對ABTS+自由基的清除能力與一年陳艾相當，有較強的清除作用。將所得清除率帶入相對于水溶性維生素E（Trolox）含量公式，由圖5 可知，一年與三年陳艾水溶性維生素E（Trolox）含量無顯著性差異，新鮮艾草與三年陳艾艾渣也無顯著差異。新鮮艾草、一年陳艾、三年陳艾及脫絨后艾渣對ABTS+自由基清除能力相對于水溶性維生素E（Trolox）含量分別為7.99、23.71、24.03、10.03 mg/g，說明三年陳艾提取物不但對ABTS+自由基有較好的清除作用，而且相對于水溶性維生素E（Trolox）含量也是最高的，反之新鮮艾草含量相對較低。

圖4 不同年份陳艾及艾渣提取物對ABTS+自由基清除活性比較

圖5 不同年份陳艾及艾渣ABTS+自由基清除能力相對于Trolox 含量比較

2.5 陳艾總黃酮、總酚酸含量與其抗氧化活性的相關性分析

各樣品提取物的總黃酮、總酚酸含量與其抗氧化活性的相關性（圖6）顯示，陳艾總黃酮、總酚酸含量與其DPPH 自由基清除能力相關系數分別為0.698 3（P＞0.05）、0.871 6（P＞0.05），與ABTS+自由基清除能力相關系數分別為0.680 0（P＞0.1）、0.816 0（P＞0.05），因為P＞0.05，所以相關系數無意義，說明陳艾總黃酮、總酚酸含量與其抗氧化活性無顯著相關性。

圖6 陳艾總黃酮、總酚酸含量與其抗氧化活性的相關性比較

3 小結與討論

黃酮類化合物與酚酸類化合物是存在于自然界具有2-苯基色原酮結構的一類化合物，廣泛存在于藥用植物中，屬于植物在長期自然過程中產生的次生代謝產物［5，6］。相關研究表示，不同年份不同產地艾草所含總黃酮、總酚酸成分也有所差異。呂雪［7］在分析艾葉中有效成分的變化規律時發現，隨著艾葉生長年份的增加，其有效成分含量也隨之發生變化。其中，總黃酮類成分隨年份的增加而逐漸增加，達到峰值后再降低，與龔敏等［8］的觀點相似，他們對一到五年的陳艾總黃酮進行了研究，認為陳艾中總黃酮含量隨儲存年份的延長逐年升高，但在第3 年達到峰值后開始急劇下降。薛紫鯨等［9］對6 個采收時期36 批祁艾進行了總黃酮含量的測定，結果表明，不同采收期的祁艾化學成分含量存在一定的差異性，不同采收期總黃酮含量變化規律較為一致，均以第3 個采收期的含量最高，而且黃酮類指標成分含量變化與總黃酮含量變化趨勢較為相同。此外，楊觀蘭等［10］在研究南酸棗葉總黃酮及其抗氧化活性的過程中發現，南酸棗葉黃酮純化后有較強的抗氧化活性，在一定濃度范圍內呈依賴關系，并且認為在相同黃酮濃度范圍，濃度增加其自由基清除能力越強。黃琴等［11］同樣在研究時發現鐵皮石斛總黃酮含量、總酚含量與抗氧化活性之間密切相關。而尚紅梅等［12］研究表明，菊苣根的抗氧化活性與其總黃酮含量相關性不大，但與總酚含量明顯相關。王畢妮等［13］研究發現，紅棗中總黃酮、總酚含量與其抗氧化活性無顯著相關性，這與本研究結果一致，陳艾總黃酮與總酚酸含量和采用DPPH、ABTS+法評價的抗氧化性無顯著相關，說明黃酮類物質結構中的復雜性是影響結果差異的重要因素之一。

本研究采取了簡單易行的超聲輔助提取法對陳艾中的黃酮類及酚類物質進行了提取，并且對其抗氧化活性有了初步的研究。結果表明，新鮮艾草、一年陳艾、三年陳艾及脫絨后艾渣的總黃酮、總酚酸含量存在差異。總黃酮及總酚酸含量會隨儲存年份的增加而逐漸增加，其抗氧化活性會因濃度的增加而隨之增強。不同年份陳艾提取物抗氧化活性存在較大差異。最終得出儲存三年陳艾總黃酮、總酚酸含量較高，同樣對DPPH 自由基、ABTS+自由基有較強的清除能力，而新鮮艾草所含黃酮類、酚類物質較少，對自由基的清除率也相對較低。據相關性研究顯示，陳艾總黃酮、總酚酸含量與其DPPH 自由基清除能力相關系數分別為0.698 3（P＞0.05）、0.871 6（P＞0.05），與ABTS+自由基清除能力相關系數分別為0.680 0（P＞0.1）、0.816 0（P＞0.05），因為P＞0.05，所以相關系數無意義，說明陳艾總黃酮、總酚酸含量與其抗氧化活性無顯著相關性。此外，在本研究中發現脫絨后的艾渣中含有黃酮類及酚類物質，雖然含量相對陳艾有所降低，但仍有利用價值。通過提取艾絨以及副產品的深加工，使得艾草的附加值不斷增加，生產過程中所產生的艾渣在養殖場則是不可或缺的寶貝。飼養戶利用艾渣和一些玉米、谷糠攪拌喂雞喂兔，飼養長大的雞和兔抗病力有所提高，死亡率也大幅度下降。劉洪麗等［14］研究表明在飼糧中添加艾葉粉可以提高畜禽飼糧粗脂肪的消化率，促進畜禽生長發育。后期可以研究如何高效發酵艾渣作為飼料，提高其綜合利用價值。本研究為艾草的陳化期提供了理論依據和數據支撐，還為艾渣的開發利用提供了參考方向［15］。