二代測序技術在社區獲得性肺炎病原學診斷中的應用價值

胡賢珍，王亞飛，宋 成，耿 爽

1. 江漢大學醫學部（武漢 430056）

2. 武漢市中心醫院呼吸與危重癥醫學科（武漢 430014）

二代測序（next-generation sequencing，NGS）是一種新興技術，能夠同時對數十億個核酸片段進行測序。研究表明，NGS 技術目前已被應用于多種感染性疾病的病原學診斷，如中樞神經系統、血液、呼吸道、胃腸道及眼部等的感染[1]。NGS 可以檢測樣本中存在的各類微生物，包括細菌、病毒、真菌、非典型病原體和寄生蟲等[2-3]。傳統的社區獲得性肺 炎（community-acquired pneumonia，CAP） 病原體檢測需要進行微生物培養、抗原/抗體免疫學檢測、核酸PCR 或病毒DNA 檢測等，耗時長且檢測陽性率低。無法精準確定病原體可能導致抗感染藥物使用不當、延誤病情，或造成經驗性抗感染藥物廣覆蓋，增加抗生素濫用及病原體的耐藥性[4]。通過核酸檢測能夠精準獲得病原譜的NGS 技術可能成為CAP 患者精準治療的有效手段，因此本研究分析NGS 病原學檢測與傳統病原學檢測的差異，以探索NGS 在CAP 病原學檢測中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取武漢市中心醫院呼吸與危重癥醫學科2020 年12 月至2021 年8 月采用支氣管鏡檢查收集肺泡灌洗液標本并行NGS 送檢的64 例CAP 患者作為研究對象。納入標準：①符合《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南（2016 年版）》中的社區獲得性肺炎診斷標準[5]；②患者均進行了NGS 送檢以及傳統病原學檢測。排除標準：①無法耐受支氣管鏡下肺泡灌洗操作的患者；②重復送檢患者。本研究經武漢市中心醫院倫理委員會倫理審查通過（院-自-倫函2021（6））。

1.2 研究方法

回顧性分析納入64 例研究對象的臨床相關資料，收集肺泡灌洗液NGS 病原學檢查結果以及同期送檢的傳統病原學結果，包括肺泡灌洗液及細菌培養、真菌培養、各類病毒核酸及抗體檢測、肺炎支原體及肺炎衣原體IgG、IgM 檢測結果等。

1.3 統計分析

使用SPSS 25.0 對數據進行統計分析，計數資料采用頻數和百分比（n，%）進行描述，采用χ2檢驗比較NGS 與傳統病原學檢測方法間的差異。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

研究共納入64 例CAP 患者，其中男性39 例、女性25 例，年齡21～90 歲、平均年齡（63.55±16.39）歲。NGS 檢測陽性55 例、陰性9 例。NGS 陽性患者中，41 例檢出細菌、27 例檢出真菌、29 例檢出病毒、2 例檢出鸚鵡熱衣原體、6 例檢出結核分枝桿菌、1 例檢出嗜肺軍團菌。傳統病原學檢測中，17 例檢出細菌、31 例檢出真菌、2 例檢出病毒、2 例檢出肺炎衣原體、4 例檢出結核分枝桿菌。

2.2 NGS與傳統細菌培養檢測結果比較

NGS 中41 例檢出細菌，傳統細菌培養17 例檢出細菌，NGS 細菌檢出率顯著高于傳統細菌培養檢測（64.1% vs. 26.6%，P＜0.001）（表1）。肺泡灌洗液NGS 檢出細菌27 種，其中銅綠假單胞菌（8 株）、卡他莫拉菌（6 株）、結核分枝桿菌復合群（6 株）檢出株數較多；傳統細菌培養出細菌6 種，其中檢出菌株較多的是銅綠假單胞菌（8 株）和肺炎克雷伯菌（6 株），詳情見表2。

表1 NGS與傳統細菌培養的細菌檢測結果比較Table 1. Comparison of bacterial detection results between NGS and traditional bacterial culture

表2 NGS與傳統細菌培養的細菌檢測情況Table 2. Bacterial detection by NGS versus conventional bacterial culture

2.3 NGS與傳統真菌培養檢測結果比較

NGS 有27 例患者檢出真菌，傳統真菌培養有31 例檢出真菌，NGS 檢出率與傳統真菌培養檢測之間無顯著差異（42.2% vs. 48.4%，P=0.48），見表3。NGS 檢出真菌12 種，其中白色念珠菌檢出株數最多（16 株）；傳統真菌培養培養出真菌7 種，檢出數最多的亦為白色念珠菌（21 株），見表4。

表3 NGS與傳統真菌培養真菌檢測結果比較Table 3. Comparison of fungal detection results between NGS and traditional fungal culture

表4 NGS與傳統真菌培養的真菌檢測情況Table 4. Fungal detection by NGS versus conventional fungal culture

2.4 NGS與傳統病原學檢測其他病原體的比較

NGS 共檢出29 例病毒陽性，包括人類皰疹病毒1 型（11 例）、人類皰疹病毒4 型（8 例）、人類皰疹病毒5 型（4 例）、人類皰疹病毒7 型（2 例）、人類皰疹病毒6B 型（1 例）、細環病毒（3 例）；而傳統病毒檢驗技術僅檢出2例EB病毒DNA陽性。

NGS 送檢患者中檢出1 例嗜肺軍團菌感染，傳統方法則未檢出。NGS 送檢患者中檢出6 例結核分枝桿菌感染，另有2 例鸚鵡熱衣原體感染，結合臨床可確定為衣原體感染肺炎。采用傳統肺炎支原體衣原體抗體檢測技術，5 例肺炎衣原體IgM 抗體陽性、56 例肺炎衣原體IgG 抗體陽性、無肺炎支原體IgM 陽性、6 例肺炎支原體IgG 抗體陽性。

3 討論

對于CAP 患者，采用恰當的檢測手段盡早明確其病原學診斷具有重要的臨床意義。一方面可以縮短患者住院時間，另一方面能夠有效避免抗生素濫用。傳統病原學檢測技術成熟、應用廣泛，然而面臨著病原譜窄、檢測陽性率低、精確度低、檢測周期長等局限，易致疾病治療延誤及抗菌藥物濫用[6]。近年來，NGS 為下呼吸道感染的病原學診斷提供了更有效、準確的手段[4]。該方法允許通用病原體檢測，而不考慮微生物（病毒、細菌、真菌和寄生蟲）的類型[7]。不需要做出臨床假設，檢測范圍廣泛，避免了傳統病原學檢測易導致的漏檢。NGS 還可以檢出一些傳統檢驗方法無法檢出的特定病原體，從而提高病原體檢出率[8]。在診斷時間上，NGS 技術與傳統檢驗方法相比有明顯優勢，NGS 技術所需時間在24 h 內，而傳統細菌培養時間為 2～5 d[9]。

研究結果顯示，NGS 檢測陽性率高于傳統細菌培養，此外，通過NGS 可以同時檢測出更多病原體種類，有助于臨床針對性治療。兩者結果差異考慮可能與未及時接種導致病原體死亡、細菌生長被優勢真菌掩蓋，以及抗菌藥物使用、細菌本身培養條件苛刻有關。使用NGS 技術進行CAP患者的病原學檢測，無需依賴培養方式來檢測和鑒定病原微生物，特別是對于一些難以培養的微生物，NGS 可以縮短檢測所需時間，從而盡早明確病原種類并進行針對性治療。林定文等在關于肺結核病原診斷技術的進展中指出，通過二代測序新型全基因組測序技術，能夠提高病原識別能力，操作難度小且能夠降低試驗成本，以后將成為結核病原診斷的重要手段[10]。

在真菌檢測方面，NGS 與傳統真菌培養沒有明顯差異。原因可能與真菌細胞壁厚，難以裂解，NGS 存在一定的假陰性有關[11]。但是，傳統真菌培養檢出真菌種類明顯少于NGS，結果顯示真菌培養對念珠菌屬更敏感，對曲霉菌屬及孢子菌屬不敏感。韓李周等對NGS 在侵襲性肺真菌病的研究中也表明，傳統檢測對念珠菌最敏感，曲霉菌次之，而NGS 對二者均較敏感[12]。相較于傳統病原學檢測手段，NGS 能夠檢測出更多種類的真菌。

在病毒檢測方面，NGS 不依賴于臨床假設，能夠直接提取樣本病毒核酸進行檢測，且能同時檢測出多種病毒，相較于傳統病原學檢測更快捷，檢測范圍更廣，且能夠檢出臨床不常見的病原體。張綿等的研究表明在重癥患者中應用宏基因組二代測序技術，能夠提高病原菌檢出的陽性率，尤其是病毒和真菌，從而更好、更及時地指導患者的治療，且對預后有一定改善作用[9]。但NGS 檢出病毒，如細環病毒、HSV1 型等病毒，可能存在定植、污染等，并不意味著患者感染相應病毒性肺炎，需將患者的臨床資料與NGS 結果結合分析。

在非典型病原體檢測方面，NGS 檢測出了傳統檢測中未檢出的嗜肺軍團菌及鸚鵡熱衣原體。在結核檢測方面，NGS 比結核感染T 細胞檢測陽性率更高。代小偉等比較了NGS 與涂片、培養和xpert 對結核分枝桿菌的診斷效能，顯示NGS 技術檢測的敏感度最高，與臨床診斷的一致性也最高，能夠快速、高效檢測痰標本中的結核分枝桿菌，可早期輔助診斷疑似肺結核患者[13]。在該研究中，NGS 與傳統病原學檢測方法在肺炎支原體檢測中目前均無陽性，與臨床診斷結果一致。而在肺炎衣原體的檢測中，NGS 未檢出傳統病原學檢測方法檢出的肺炎衣原體。國內外缺少NGS 與肺炎衣原體血清學檢測在肺炎衣原體檢出中的陽性率對比。NGS 在支原體及衣原體檢測中是否優于傳統病原學檢測還需要更多的研究進一步驗證。

綜上所述，NGS能夠同時檢測患者細菌、真菌、病毒和其他非典型病原微生物。相較于傳統病原學檢測方法，NGS 檢測病原微生物范圍廣泛，種類豐富，在社區獲得性肺炎患者的病原學診斷中具有重要意義，但仍需結合臨床進一步分析明確。